Sekvensering av mRNA från helblod med Nanopore sekvensering

Tredje generationens nanoporsekvensering är en kraftfull romansekvenseringsteknik som gör det möjligt att mycket enkelt få sekvensinformation från en mängd olika prover. De viktigaste fördelarna med denna teknik är portabiliteten för sekvenseringsanordningen, den extremt långa läslängden och realtidstillgängligheten för data. Nanopore sekvensering är en särskilt användbar teknik under sjukdomsutbrott på avlägsna platser.

Det har framgångsrikt använts i fältlaboratorier under och efter ebolavirusutbrott i Väst- och Centralafrika. Via nanosporesekvensering och användning av MinION-enheten för detta ändamål är ganska lätt, måste man vara försiktig under biblioteksberedningen och under flödescellsbelastning. Till att börja detta förfarande, inrätta en touchdown PCR att förstärka cDNA med primer som en med hjälp av en varmstart high fidelity DNA polymeras med lämplig reaktion buffert i en 50 mikroliter reaktionsvolym med en microliter mall.

Om möjligt, ställa in reaktionen på is eller i en cool block på fyra grader Celsius. Inkubera reaktionen i en termocyklare som beskrivs i textprotokollet. Efter detta överför du 50 mikroliter av PCR-produkten till ett 1,5 milliliter DNA-lågt bindningsrör.

Resuspend de magnetiska pärlorna grundligt genom att vortexa. Tillsätt sedan 50 mikroliter av pärlor till PCR-reaktionen och blanda väl. Inkubera provet på en roterande mixer i fem minuter vid rumstemperatur medan det roterar vid 15 RPM.

Kort snurra ner provet och sedan placera röret på en magnetisk rack att pelleta de magnetiska pärlor. Vänta tills supernatanten har klarlagts helt innan du fortsätter. Därefter aspirera supernatanten utan att störa pärlpelletsen och kassera den.

Pipett 200 mikroliter av 70%etanol in i reaktionsröret och inkubera i 30 sekunder vid rumstemperatur. Aspirera etanolen utan att störa pärlpelletsen och kassera den. Upprepa denna tvättprocess med etanol en gång till för totalt två tvättar.

Lufttorka pelleten i en minut i rumstemperatur. Ta sedan bort reaktionsröret från magnetstället. Resuspend pelleten i 30 mikroliter av nukleas fritt vatten och inkubera i rumstemperatur i två minuter.

Placera tillbaka reaktionsröret på magnetställningen och vänta tills reaktionspärlorna är helt pelleterade. Efter detta, ta bort supernatanten utan att störa pelleten och överför till ett nytt 1,5 milliliter reaktionsrör. Om flera prover ska sekvenseras samtidigt kan streckkoder nu läggas till genom ytterligare två PCR-steg följt av DNA-rensning som tidigare visats.

För det första, kombinera en lika stor mängd streckkodade DNA från varje prov för totalt ett mikrogram DNA i en volym av 45 mikroliter i en 0,2 milliliter reaktionsrör. För dA-Tailing, tillsätt sju mikroliter av slutet prep reaktion buffert, tre mikroliter av slutet prep enzym mix, och fem mikroliter av nukleas fritt vatten. Snärta försiktigt röret för att blanda.

I en termocyklare, inkubera reaktionen i fem minuter vid 20 grader Celsius följt av fem minuter vid 65 grader Celsius. Därefter utför PCR-rening av reaktionsprodukten som beskrivs i textprotokollet. Eventuellt, ta en mikroliter för att kvantifiera koncentrationen av provet med hjälp av en UV-spektrofotometer.

Kombinera 22,5 mikroliter av det tidigare erhållna renade DNA med 2,5 mikroliter av 1D2-adapter och 25 mikroliter blunt/TA Ligase Master Mix i ett nytt 1,5 milliliter DNA-lågt bindande reaktionsrör. Snärta försiktigt röret för att blanda. Kort spinn ner blandningen och inkubera i rumstemperatur i 10 minuter.

Utför sedan PCR-rening av reaktionsprodukten enligt textprotokollet. Kombinera 45 mikroliter av reaktionsprodukten med fem mikroliter av streckkodsadaptermix och 50 mikroliter av Blunt/TA Ligase Master Mix i ett DNA-lågt bindande reaktionsrör. Snärta försiktigt för att blanda och inkubera i 10 minuter i rumstemperatur.

Rena reaktionsprodukten enligt beskrivningen i textprotokollet och förvara den resulterande produkten på is eller vid fyra grader Celsius tills den är klar att användas. Börja med att utföra en kvalitetskontroll på flödescellen före användning. I detta syfte ansluter du sekvenseringsenheten till värddatorn och öppnar programvaran.

Sätt in en flödescell i sekvenseringsenheten. Välj sedan flödescelltypen från väljarens ruta och klicka tillgänglig för att bekräfta. Längst ned på skärmen klickar du på Kontrollera flödescell och väljer rätt flödescelltyp.

Klicka på starttest för att starta kvalitetskontrollen. Minst 800 aktiva nanoporer totalt krävs för att flödescellen ska kunna användas. Öppna först primingportluckan genom att skjuta den i medurs riktning.

Ställ in en P1000-pipett till 200 mikroliter och sätt in spetsen i primingporten. Justera sedan pipetten till 230 mikroliter samtidigt som spetsen förvaras i priming-porten för att dra upp 20 till 30 mikroliter av buffert och ta bort eventuella luftbubblor. I en ny 1,5 milliliter DNA låg bindningsreaktion röret, förbereda priming mix genom att kombinera 576 mikroliter av RBF buffert med 624 mikroliter av nukleas fritt vatten.

Försiktigt pipettera 800 mikroliter av den förberedda priming mixen i priming port och vänta fem minuter. Efter detta lyfter du provportens överdrag och pipetter ytterligare 200 mikroliter av den förberedda primingblandningen i primingporten. Pipett 35 mikroliter av RBF-bufferten till ett nytt rent 1,5 milliliter DNA lågbindande reaktionsrör.

Blanda noggrant LLB-pärlor genom pipettering och tillsätt 25,5 mikroliter av pärlorna till RBF-bufferten. Därefter lägger du till 2,5 mikroliter av nukleasfritt vatten och 12 mikroliter av DNA-bibliotek och blanda genom pipettering. Tillsätt 75 mikroliter av provblandningen på ett långsamt drop klokt sätt till flödescellen via provporten.

Byt sedan ut provportens lucka, stäng primingporten och stäng locket till sekvenseringsanordningen. Inom programvaran bekräftar du att flödescellen fortfarande är tillgänglig. Öppna ett nytt experiment och ställ in körparametrarna genom att välja den satsen som används.

Välj live basecalling. Starta sekvenseringen som körs genom att klicka på Begin-experiment. Fortsätt sekvenseringskörningen tills tillräckliga experimentella data har samlats in.

I ett representativt experiment extraheras RNA från 10 olika blodprover från fem djurarter. RNA-koncentrationer observeras mellan 43 nanogram och 543 nanogram per mikroliter. Efter förstärkning av RT-PCR visar gelanalys av MPC1 PCR-produkterna olika utfall med markant svagare band för proverna BC01 och BC02.

Dessa skillnader orsakas troligen av skillnader i provkvalitet även om skillnader i PCR-effekt på grund av skillnader i primerbindning till MCP1-genen av olika arter inte kan uteslutas. Dessa skillnader i avkastning och/eller förstärkningseffektivitet påverkar dock inte markant det övergripande sekvenseringsutfallet. En delmängd av 10, 000 erhållna läsningar väljs sedan och demultiplexas för vidare analys.

Av de 10, 000 läsningar analyseras, 5, 457 visa en längd mellan 1, 750 och 2, 000 nukleotider som matchar de förväntade storlekarna för PCR fragment förstärks som en del av vårt arbetsflöde. En ytterligare topp i längden fördelningen av läsningar observeras mellan 250 till 500 nukleotider som kan hänföras till ospecifika PCR produkter. Demultiplexing av läsningar tillåter tilldelningen av 87,6%av läsningarna till ett av de 10 prover som analyserats.

Medan denna metod är ganska tillförlitlig, under fältförhållanden, är PCR-förstärkning det mest problematiska steget. Under våra erfarenheter var kapslade protokoll ofta nödvändigt att förstärka mål sekvenser. Förutom sekvensering av djurvärdgener kan denna metod också användas för att sekvensera dna eller RNA inklusive virus- eller bakteriepatogener.

Nanoporsekvensering används därför nu nu i allt större utsträckning inte bara vid sjukdomsutbrott eller för vetenskapliga studier på avlägsna platser utan även i regelbundna laboratorier där de långa läslängderna öppnar upp nya spännande forskningsmöjligheter. Medan ingen av de använda reagenserna är särskilt farliga, bör standard goda laboratoriemetoder följas. Uppenbarligen när sekvensering sjukdom agenter, alla nödvändiga försiktighetsåtgärder för hantering av dessa medel måste iakttas.