Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

نشكر ديانا أدجود على المساعدة التقنية. وقد تم دعم هذا العمل بمنح من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (2015-2020)، وجينوم كيبيك (2016-2019) وجينوم كندا (2016-2019) إلى E.B.A. E.B.A. هو باحث كبير في مؤسسة بحوث كيبيك سانتي (FRQ-S). L.M وN.S.K. لديهم منحة الدكتوراه من FRQ-S. حصل سعادة على منحة دكتوراه من وزارة التعليم العالي ومن البحث العلمي في تونس ومؤسسة كول.

1. GSH-أغاروز تنقية التقارب من GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 مجمع يوبيكويتين Ligase
<ol><li>استخدام pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1-109aa) البكتيريا التعبير بناء لتحويل BL21 (DE3) البكتيريا (انظر جدولالمواد)23. يسمح هذا البناء التعبير عن المجال RING1B murine 1-159 تنصهر إلى مجال BMI1 1-109 مع علامة GST في العمود الفق...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+structure+and+function+of+the+deubiquitinases.">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unravelling+of+the+ubiquitin+system.">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li><li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+cell-cycle+control+and+cancer.">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li><li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy.">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Ligases:+Structure,+Function,+and+Regulation.">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li><li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages.">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li><li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code.">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li><li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation.">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li><li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity.">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li><li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense:+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing.">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li><li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation.">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li><li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers.">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li><li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response.">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li><li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast.">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li><li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control.">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li><li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions.">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li><li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter.">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li><li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B.">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li><li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB.">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li><li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1:+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression.">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li><li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas.">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li><li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma,+lung+adenocarcinoma,+meningioma,+and+other+cancers.">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li><li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma.">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li><li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility.">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li><li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma.">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li><li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors.">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li><li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation.">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li><li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma.">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li><li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2++flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation.">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1.">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385 (2018).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAP1/ASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer.">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li><li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O.">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression.">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair.">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li><li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response.">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression.">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li><li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells.">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1.">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li><li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

هناك العديد من المزايا لإنشاء قوية في المختبر في كل مكان واختبارات ديوبيكيتيشن للبروتينات ذات الأهمية. ويمكن استخدام هذه الاختبارات من أجل: '1' تحديد الظروف المثلى وتحديد الحد الأدنى من المتطلبات لهذه التفاعلات، '2' تحديد الثوابت الحركية والكيميائية الحيوية الأنزيمية، '3' تحديد أدوار العوا...

Ubiquitination هي واحدة من التعديلات الأكثر حفظا بعد الترجمة وحاسمة لمجموعة واسعة من الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة والنباتات والفقاريات. يوبيكيتيشن يتكون من مرفق التكافؤ من يوبيكويتين، وهو 76 ببتيد الأحماض الأمينية المحفوظة للغاية، لاستهداف البروتينات ويحدث في ثلاث خطوات متتالية تنطوي على ثلاثة أنزيمات، أي E1-تفعيل، E2-الاقتران وE3 ligase1، 2،3. يلعب هذا التعديل ما بعد الترجمة أدوارًا مركزية في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية. في الواقع، فإن الأربطة E3، والتي توفر خصوصية رد الفعل، تشكل عائلة عظمى كبيرة من الإنزيمات وهي الإنزيمات الأكثر وفرة من نظام ubiquitin4،5،6. تعتمد الآثار النهائية للبروتين في كل مكان على طبيعة التعديل: أحادية الشبه، ومتعددة أحادية المونوبية، وتعدد الأقطاب الخطي أو المتفرع. نادرا ً ما يرتبط المونوبيكويتين بالتدهور البروتياسومال، ولكن بدلاً من ذلك يشارك هذا التعديل في التوسط في مختلف أحداث الإشارات. [بولوبقويتيتينأيشن] يتضمّن ال [ن-ترمينل] أو اليسين بقايا في [أوبقويقويتين] جزيء نفسه, والمصير من بروتين [بولوبقويتينت] يعتمد على أيّ بقايا يكون تضمّنت في [أوبقويتين] سلسلة إمتداد. ومن المعروف منذ فترة طويلة أن تعدد الحالات المضلع ة بوساطة يسين 48 من يوبيكويتين يسبب تدهور البروتياسومال. على العكس من ذلك، غالباً ما يرتبط تعدد الموبيكتيين عن طريق يسين 63 من أوبكويتين مع تنشيط البروتين7،8،9. على غرار التعديلات الهامة الأخرى بعد الترجمة، في كل مكان هو عكسها ويتم ضمان إزالة ubiquitin من البروتينات من قبل البروتياز محددة تسمى deubiquitinases (DUBs)، والتي ظهرت كجهات تنظيمية هامة للعمليات الخلوية 2 , 10.الأهم من ذلك، العديد من DUBs هي متخصصة للغاية، وتنظيم، من خلال deubiquitination، ركائز محددة، مما يشير إلى أن التوازن الدقيق بين في كل مكان وdeubiquitination أمر بالغ الأهمية لوظيفة البروتين. E3s وDUBs، جنبا إلى جنب مع آلات التحلل بروتياسوم والعوامل التبعي، تشكل نظام البروتياسوم Ubiquitin (UPS، مع > 1200 الجينات) الذي ينظم مسارات الإشارات الرئيسية، والتي يرتبط العديد منها مع نمو الخلايا وانتشارها، تحديد مصير الخلية، والتمايز، وهجرة الخلايا، وموت الخلية. الأهم من ذلك، إلغاء الضوابط التنظيمية من العديد من السلاسل التعاقبية الإشارات التي تنطوي على في كل مكان يعزز تكوين الأورام وأمراض التنضد العصبي5،11،12،13، 14.
يلعب التمركز أدوارًا متفشية في بيولوجيا الكروماتين والعمليات المعتمدة على الحمض النووي15و16و17. على سبيل المثال، المونوبيكيت من الهيستون H2A على يسين 119 (فيما يلي H2A K119ub) هو تعديل ما بعد الترجمة الحرجة المشاركة في القمع النسخي وإصلاح الحمض النووي18،19،20، 21،22. يتم تحفيز H2A K119ub من قبل مجمع بوليكومب القمعي 1 (PRC1)، الذي يلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على المعلومات الوراثية ويتم الحفاظ عليها بشكل كبير من دروسوفيلا إلى الإنسان. يتكون PRC1 الكنسيبشكل خاص من قبل RING1B و BMI1، والتي هي الأساسية E3 مجمع ubiquitin ligase المسؤولة عن الحدث في كل مكان المذكورة أعلاه22،23. في دروسوفيلا، يتم عكس H2A monoubiquitination (H2A K118ub الذي يتوافق مع H2A K119ub في الثدييات) من قبل كاليبسو دوب ، الذي يتفاعل مع مشط الجنس إضافية (ASX) تشكيل مجمع دوب بوليكومب القمعية (PR-DUB)24. وتقويم الثدييات من كاليبسو، BAP1، هو مثبط الورم حذف أو تعطيل في الأورام الخبيثة البشرية المختلفة25،26،27،28، 29 , 30 , 31 , 32 , 33.BAP1 ينظم العمليات التي تعتمد على الحمض النووي في النواة والكالسيوم إشارة بوساطة المبرمج في الشبكية endoplasmic33،34،35،36، 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42.BAP1 يجمع مجمعات البروتين متعددة الوحدات الفرعية التي تحتوي على المنظمين النسخ لا سيما ASXL1، ASXL2 وASXL3 (ASXLs)، ثلاثة orthologues من ASX38،43. ASXLs استخدام مجال DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD)، وتسمى أيضا مجال ASXM، لتحفيز نشاط BAP1 DUB35،36،44. وبالتالي، ASXLs تلعب أدوارا هامة في تنسيق نشاط BAP1 DUB في الكروماتين وعلى نطاق أوسع وظيفتها قمع الورم.
توجد عدة طرق لدراسة عمليات التمركز والتجريد من الأويوبية. وتجدر الإشارة إلى أن الاختبارات البيوكيميائية التي تستخدم البروتينات المنقّهة من البكتيريا لا تزال قوية جداً في إظهار الانتشار المباشر لركائز محددة أو إزالة كل شيء منها. ويمكن إجراء هذه التجارب للتحقيق في مجموعة من المعلمات مثل تحديد متطلبات الحد الأدنى من المجمعات، وتحديد ردود الفعل الحركية، وتحديد العلاقات بين الهيكل/ وظيفة، وفهم تأثير المرضية الطفرات الجينية. هنا، ونحن نقدم بروتوكولات لإجراء ردود الفعل في كل مكان وdeubiquitination على ركائز الكروماتين مع مكونات تنقية. كنظام نموذجي، يتم تقديم في كل مكان في المختبر وdeubiquitination من بروتين H2A النيوكليوسومال. وتستخدم البروتينات المنقاة للبكتيريا التي يتم تجميعها في الحد الأدنى من المجمعات من RING1B/BMI1 و BAP1/DEUBAD لانتشار أو إلغاء يوبيكويتين من H2A النيوكليوسومال، على التوالي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

Ubiquitination هو تعديل ما بعد الترجمة الذي يلعب أدوارا هامة في مسارات الإشارات المختلفة ويشارك بشكل ملحوظ في تنسيق وظيفة الكروماتين والعمليات المرتبطة بالحمض النووي. ينطوي هذا التعديل على عمل متسلسل من العديد من الإنزيمات بما في ذلك E1 يوبيكويتين-تفعيل, E2 يوبيكويتين-الاقتران وE3 في كل مكان-ligase وعكس هابيكويتيناسيس (DUBs). في كل مكان يحفز تدهور البروتينات أو تغيير وظيفة البروتين بما في ذلك تعديل النشاط الأنزيمي، والتفاعل بين البروتين والبروتين والتوطين تحت الخلية. خطوة حاسمة في إظهار البروتين في كل مكان أو deubiquitination هو أداء ردود الفعل في المختبر مع المكونات النقية. يمكن أن تتأثر ردود الفعل الفعالة في كل مكان وdeubiquitination إلى حد كبير من قبل المكونات المختلفة المستخدمة، والعوامل المشتركة الإنزيم، وظروف العازلة، وطبيعة الركيزة.  هنا، ونحن نقدم بروتوكولات خطوة بخطوة لإجراء ردود الفعل في كل مكان وdeubiquitination. نحن نوضح هذه ردود الفعل باستخدام مكونات الحد الأدنى من الماوس مجمع بوليكومب القمعية 1 (PRC1)، BMI1، وRING1B، وهو E3 ubiquitin ligase أن monoubiquitinates histone H2A على يسين 119. يتم تنفيذ ثنائي ة من H2A النيوكليوسومال باستخدام الحد الأدنى من مجمع Deubiquitinase القمعية بوليكومب (PR-DUB) التي شكلتها ثنائية الإنسان BAP1 ومجال DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) من العامل المشارك ASXL2. ويمكن إجراء هذه الاختبارات في كل مكان / اللوب في سياق إما النيوكليوسوم المؤتلف المعاد تشكيله مع البروتينات المنقاة للبكتيريا أو النيوكليوسومات الأصلية النقية من خلايا الثدييات. ونحن نسلط الضوء على التعقيدات التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على ردود الفعل هذه، ونقترح أن المبادئ العامة لهذه البروتوكولات يمكن تكييفها بسرعة مع غيرها من E3 في كل مكان ligases وdeubiquitinases.

يتم إنتاج بروتينات GST-BMI1 وRING1B بشكل جيد في البكتيريا ويمكن استخراجها بسهولة في الكسر القابل للذوبان. يظهر الشكل 1A تلطيخ الأزرق Coomassie لتنقية نموذجية من مجمع GST-BMI1-RING1B. تهاجر نطاقات GST-BMI1 وRING1B عند الوزن الجزيئي المتوقع، حوالي 45 كيلوداً وحوالي 13 كيلوداً على الت?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination هو تعديل ما بعد الترجمة الذي يلعب أدوارا هامة في العمليات الخلوية ويتم تنسيقها بإحكام من قبل deubiquitination. العيوب في كل من ردود الفعل تكمن وراء الأمراض البشرية. نحن نقدم بروتوكولات لإجراء رد فعل في كل مكان وdeubiquitination في المختبر باستخدام المكونات النقية.

في كل مكان في المختبر واختبارات الديوبيكيتيمنت النيوكليوسوم

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

نظرا لتعقيد التفاعلات في كل مكان و deubiquitquitination داخل الخلايا من المهم إنشاء في المختبر مع مكونات تنقية محددة. وهذا يساعد على فهم آليات في كل مكان و deubiquitquitination وأيضا لتحديد كيفية الطفرات المرتبطة الجينات التي ترميز الإنزيمات المسؤولة عن هذا التفاعل يمكن أن يسبب المرض البشري. يمكننا تحديد المجالات والزخارف في هذه المكونات التي تحرك هذه التفاعلات.يمكننا أيضا تطوير عالية الإنتاجية الشاشة المقايسة التي يمكن استخدامها لفحص لمثبطات جزيء الصغيرة التي يمكن تطويرها والعلاجات المحتملة. لبدء تحلل البكتيريا، إضافة PMSF وكوكتيل مضاد للبروتين في الجليد الباردة تحلل العازلة A.Add 25 ملليلتر من العازلة تحلل A في زجاجة تحتوي على بيليه البكتيريا و resuspend بيليه. نقل البكتيريا التي تحتوي على lysate في أنبوب ل sonication.استخدام سونيكاتور التحقيق ل sonicate lysate في 70 ٪ سعة الانتاج لمدة 30 ثانية ، أربع إلى خمس مرات. ثم الطرد المركزي في 21،000 مرات ز لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد احتضان البكتيريا مع خرز GSH لمدة خمس ساعات وفقا للمخطوطة، نقل الخرز جنبا إلى جنب مع 10 ملليلترات من العازلة في عمود الكروماتوغرافيا فارغة.ثم، إضافة 1.5 ملليلتر من العازلة A التي تحتوي على الجلوتاثيون ملليمولار 25 في العمود وجمع elution عن طريق الجاذبية في 1.5 ملليلتر الأنابيب الدقيقة. كرر إجراء الاستماء أربع مرات مع العازلة الطازجة A استمرار معالجة الكسور المائلة وفقا للمخطوطة. للبدء، resuspend له-BAP1 والكريات البكتيريا MBP-DEUBAD في 25 ملليلتر من الجليد الباردة تحلل العازلة B.Mix 25 ملليلتر من كل lysate واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.سونيكات ومن ثم الطرد المركزي في 21، 000 ز مرات لمدة 20 دقيقة. بعد الطرد المركزي lysate، تصفية lysate من خلال 0.45 ميكرومتر مسام محاقن فلتر في زجاجة ومزجها مع حبات NTA نيكل. احتضان في أربع درجات مئوية مع اهتزاز لمدة خمس ساعات.بعد ذلك، تدور أسفل الخرز في 25،000 مرات ز لمدة ثلاث دقائق. استخدام ماصة لحفظ عظمى في أنبوب 50 ملليلتر كما تدفق من خلال. غسل الخرز مع خمسة ملليلترات من العازلة B، التي تحتوي على imidazole 20 ملليمولار، ست مرات مع جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق.بعد الغسيل الأخير، نقل الخرز مع 10 ملليلترات من المخزن المؤقت B إلى عمود كروماتوغرافي فارغ وإضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت B الذي يحتوي على إيميدازول 200 ملليمولار. جمع elution عن طريق الجاذبية في 1.5 ملليلتر الأنابيب الدقيقة التي تحتوي على DTT وEDTA. كرر إجراء elution أربع مرات وتجمع الكسور المائل المطلوبة في أنبوب 15 ملليلتر.إضافة العازلة جيم لتخفيف مجمع مائل ثلاث مرات. ثم نقل elution المخفف إلى الخرز amylose المعدة في الأنابيب واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع اهتزاز. في الصباح، الطرد المركزي الأنابيب في 2،500 مرات ز لمدة ثلاث دقائق والحفاظ على supernatant في أنبوب 15 ملليلتر كما تدفق من خلال.غسل البروتين ملزمة الخرز مع خمسة ملليلتر من العازلة C لمدة خمس إلى ست مرات. ثم إضافة 500 ميكروليتر من العازلة D إلى تطهيرها له BAP1/ MBP-DEUBAD مجمع على الخرز agarose amylose لجعل حل حبة 50٪. نقل 20 ميكرولترات من 50٪ حبة الحل إلى أنبوب microcentrifuge وإضافة 20 ميكرولترس من مرتين Laemmli عينة العازلة لSDS-PAGE وتحليل الأزرق Coomassie.تخزين الحل الخرز المتبقية في ناقص 80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. بعد الثقافة خلايا HEK293T، لوحة 12 مليون خلية في 20 ملليلتر من وسائل الإعلام كاملة في طبق ثقافة 15 سنتيمترا، قبل يوم واحد من transfection. بعد يوم واحد واحد، تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، ووسائط الاستنشاق وإمدادات مع 12 ملليلتر من وسائل الإعلام الحرة المصل.Transfect الخلايا مع 21 ميكروغرام من pCDNA شقة H2A باستخدام 63 ميكرولتر من PEI في مليغرام واحد لكل ملليلتر. بعد 12 ساعة، قم بالتغيير إلى متوسطة كاملة. بعد حصاد الخلايا وفقا للمخطوطة، resuspend بيليه الخلية في حوالي 10 مجلدات من العازلة E التي تحتوي على NEM لمنع deubiquiticeinases وأنت احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.بعد الطرد المركزي في 3، 000 مرات ز لمدة خمس دقائق، والتخلص من عظمى. غسل الكرومات بيليه مرتين مع 10 كميات من العازلة E أولا ثم غسل مرتين مع F.Resuspend العازلة الكروماتين في خمسة ملليلتر من العازلة F وعلاج بيليه مع النوى الدقيقة في تركيز ثلاث وحدات لكل ملليلتر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، نقل 40 ميكرولتر aliquot من الخليط إلى أنبوب 1.5 ملليلتر لتحليل شظايا الحمض النووي النووي.إضافة 40 ميكرولترات من الفينول الكلوروفورم و 20 ميكرولترات من ست مرات الحمض النووي تحميل العازلة. دوامة وتدور في 18،000 مرات ز لمدة دقيقتين. ثم نقل 15 ميكرولترات من المرحلة مائي في هلام agarose 2٪لتحميل الحمض النووي.بعد إيقاف التفاعل والطرد المركزي وفقًا للمخطوطة ، احتضن جزء الكروماتين القابل للذوبان مع حبات راتنج مضادة للعلم في أنبوب 15 ملليلتر بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع اهتزاز. غسل الخرز ست مرات مع G.Transfer العازلة مع خمس ملليلترات من العازلة G في عمود الكروماتوغرافيا فارغة. تمييع النوى المقيدة للخرزة مع 260 ميكرولترات من العازل G تحتوي على 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من ببتيد elution العلم وواحد إلى خمسة واحد من الدارس تريس في الثامنة من رقم ه.إلوت النوكلوزومات ثلاث مرات، ساعة واحدة في الغرفة الباردة. لأداء تحليل في كل مكان، أولا إضافة ميكروغرام واحد من النيوكلوزومات المنقية في 40 ميكرولترات من H.بعد ذلك العازلة H.After ذلك، إضافة مزيج حل انزيم يحتوي على 250 نانوغرام من UBE1، 672 نانوغرام من UB و E2 UB الاقتران الإنزيمات وميكروغرام واحد من BMI1-RING1B E3 ubiquitin مجمع ليغا في الأنبوب. احتضان رد الفعل لمدة ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في بعض الأحيان.وقف رد الفعل عن طريق إضافة 40 ميكرولتررس من مرتين Laemmli عينة العازلة وتحليل histone H2AK119 في كل مكان من قبل النشاف الغربية. لأداء في المختبر deubiquitquitination فحص resuspend النيوكلوزومات النقية في 40 ميكرولترات من العازلة الأولى وميكروم واحد من البكتيريا تنقية له BAP1 / MBP - DEUBAD الخرز. وضع أنبوب في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات لتنفيذ رد فعل deubiquitination مع اهتزاز في بعض الأحيان.ثم وقف رد الفعل عن طريق إضافة 40 ميكرولترات من مرتين Laemmli العازلة وتحليلها عن طريق المناعة. في هذه التجربة، يُظهر التلطيخ الأزرق Coomassie لتنقية نموذجية لمجمع GST-BM1-RING1B باستخدام حبات تقارب GST، أن العصابات تهاجر في الوزن الضروس المتوقع حول 45 كيلودالتون و 13 كيلودالتون على التوالي. وبالمثل، أدى تنقية مجمع ه-BAP1 MBP-DEUBAD أيضا إلى استعدادات متجانسة عالية نسبيا مع عصابات حول 90 كيلودالتون و 55 كيلودالتون على التوالي.من ناحية أخرى يتكون الكسر النوى المنقى أساسا من قبل 147 قاعدة زوج الفرقة مما يدل على وجود نسبة عالية من الكسور أحادية النواة. Coomassie الأزرق تلطيخ من النيوكلوزومات المنقى يظهر نمط الفرقة نموذجية من الوحدات الفرعية الأربعة ذات الحجر الهحي مع كميات stoichiometric. يظهر Ubiquitination من H2A histone مع مجمع BMI1-RING1B زيادة الوقت تعتمد على شكل في كل مكان من البروتين في حين أن مستويات النموذج غير المعدلة تنخفض في وقت ومتزامنة.رد فعل في كل مكان هو مجموع كما يتم تحويل جميع البروتينات H2A تقريبا إلى H2A K119ub. من ناحية أخرى، أجريت فحص إزالة ubiubiquitination النويوزومات الأصلية. بعد حضانة هذه النيوكلوزومات مع BAP1-DEUBAD تم ملاحظة الحد من الوقت المعتمدة من إشارة H2A K119ub.يعتمد نجاح التفاعلات في كل مكان والفك على الطريقة التي يتم بها تنقية البروتين. نحن بحاجة إلى عائد جيد واستخدام العازلة لإعادة تركيب البروتين وتنقيته يجب أن تكون متوافقة مع التفاعلات الكيميائية الحيوية. عندما تكون هذه الفحوصات في كل مكان و deubiquitquitination راسخة يمكننا اختبار المنشطات المؤثرة والمثبطات وكذلك تأثير الطفرات الجينية المرتبطة بالمرض.وقد تم إنشاء هذه الطريقة من خلال مساهمة العديد من المختبرات وهي مفيدة جدا لفهم آليات في كل مكان و deubiquitquitination. العديد من المواد الكيميائية خطرة وتحتاج إلى أن يتم التلاعب بها في غطاء محرك السيارة. وهذا يشمل الفينول الكلوروفورم والأحماض والقواعد، والحد من العوامل.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

إعادة تشكيل جسيم نووي مع الهستونات الأخت المسمى النظائر-تفاضلي

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

تحليل سوبيركومبلكسس من سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا مع الكهربائي الأصلي، في هلام فحوصات، والكهرباء

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

عزل ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا واستخدامها في فحوصات البروتين الطاقة تعتمد على النقل

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

توصيف وظيفي لحلقه من نوع E3 اوبيكويتين الاربطه في المختبر وفي بلانتa

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

بروتوكول الدوس خطوة بخطوة لزيادة الإنتاجية في مقالات GPCR المستندة إلى المعاوقة الخالية من التسميات

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...