Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

Vi takker Diana Adjaoud for teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) og Genome Canada (2016-2019) til E.B.A. E.B.A. er en ledende forsker i fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L. M og N.S.K. har et ph. d.-stipendium fra FRQ-S. H. B havde et ph. d.-stipendium fra ministeriet for videregående uddannelse og fra videnskabelig forskning i Tunesien og Cole Foundation.

1. GSH-agopstået affinitet rensning af GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin Ligase Complex
<ol><li>Brug pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa)-bakterie udtryks konstruktionen til at omdanne BL21 (DE3) bakterier (Se tabel over materialer)23. Denne konstruktion tillader ekspression af murine RING1B Domain 1-159 smeltet til BMI1 domæne 1-109 med GST-tag i pGEX-6P-2 backbone.</li>
	<li>Udfør en overnatning starterkultur ved inokulerende RIL-bakterier udtrykker GS...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+structure+and+function+of+the+deubiquitinases.">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unravelling+of+the+ubiquitin+system.">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li><li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+cell-cycle+control+and+cancer.">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li><li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy.">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Ligases:+Structure,+Function,+and+Regulation.">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li><li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages.">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li><li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code.">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li><li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation.">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li><li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity.">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li><li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense:+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing.">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li><li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation.">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li><li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers.">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li><li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response.">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li><li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast.">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li><li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control.">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li><li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions.">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li><li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter.">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li><li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B.">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li><li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB.">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li><li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1:+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression.">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li><li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas.">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li><li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma,+lung+adenocarcinoma,+meningioma,+and+other+cancers.">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li><li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma.">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li><li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility.">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li><li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma.">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li><li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors.">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li><li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation.">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li><li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma.">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li><li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2++flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation.">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1.">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385 (2018).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAP1/ASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer.">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li><li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O.">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression.">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair.">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li><li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response.">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression.">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li><li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells.">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1.">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li><li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

Der er flere fordele ved at etablere robuste in vitro allestedsnærværende og deubiquitination assays for proteiner af interesse. Disse assays kan bruges til at: (i) etablere optimale betingelser og definere minimal krav til disse reaktioner, (II) bestemme enzymatiske kinetiske og biokemiske konstanter, (III) definere rollerne af cofaktorer eller hæmmere, der kan påvirke disse reaktioner, (IV) Identificer interaktions grænseflader, (v) test virkningen af kunstige eller sygdoms associerede mutationer og (vi) fastlægg...

Allestedsnærværende er en af de mest bevaret post-translationelle modifikationer og er afgørende for en bred vifte af organismer, herunder gær, planter og hvirveldyr. Allestedsnærværende består af den kovalente fastgørelse af ubiquitin, et stærkt bevaret 76 aminosyre polypeptid, til at målrette proteiner og forekommer i tre sekventielle trin, der involverer tre enzymer, nemlig E1-aktivering, E2-konjugering og E3 ubiquitinligase1, 2,3. Denne post-translationelle modifikation spiller centrale roller i et bredt spektrum af biologiske processer. Faktisk, de E3 ligaser, som giver specificiteten af reaktionen, udgør en stor super familie af enzymer og er de mest rigelige enzymer i ubiquitin system4,5,6. De efterfølgende virkninger af protein allestedsnærværende afhænger af ændringens art: monoubiquitination, multi-monoubiquitination og lineær eller forgrenet polyubiquitination. Monoubiquitination er sjældent forbundet med proteasomal nedbrydning, men i stedet denne modifikation er involveret i mætning forskellige signalering begivenheder. Polyubiquitination involverer N-terminalen eller lysinrester i ubiquitin-molekylet, og skæbnen for et polyubiquiteret protein afhænger af, hvilke rester der er involveret i ubiquitin-kæde udvidelsen. Det har længe været kendt, at polyurethan, der er medieret af lysin 48 af ubiquitin, inducerer proteasomal nedbrydning. Tværtimod, polyubiquitination via lysin 63 af ubiquitin er ofte forbundet med protein aktivering7,8,9. Ligesom andre vigtige post-translationelle modifikationer er allestedsnærværende, reversibel og ubiquitin fjernelse fra proteiner er sikret ved specifikke proteaser betegnet deubiquitinaser (DUBs), som er dukket op som vigtige regulatorer af cellulære processer 2 , 10. vigtigere, mange Dubs er højt specialiserede, og regulere, gennem deubiquitination, specifikke substrater, hvilket indikerer, at en fin balance mellem allestedsnærværende og deubiquitination er afgørende for protein funktion. E3s og DUBs udgør sammen med proteasomet nedbrydnings maskiner og tilbehørs faktorer det Ubiquitin Proteasomet system (UPS, med > 1200 gener), som regulerer større signalveje, hvoraf flere er forbundet med cellevækst og-spredning. celle skæbne beslutsomhed, differentiering, celle migration, og celledød. Vigtigere, deregulering af flere signalering kaskader involverer allestedsnærværende fremmer tumor og neurodegeneration sygdomme5,11,12,13, 14.
Allestedsnærværende roller spiller en Pervasive rolle i kromatin biologi og DNA-afhængige processer15,16,17. For eksempel er monoubiquitination af Histon H2A på lysin 119 (herefter H2A K119ub) en kritisk post-translationel modifikation, der er involveret i transkriptional undertrykkelse og DNA-reparation18,19,20, 21,22. H2A K119ub katalyseres af Polycomb repressive Complex 1 (PRC1), som spiller en central rolle i vedligeholdelsen af epigenetiske oplysninger og er stærkt bevaret fra Drosophila til menneske. Canonical PRC1 består især af RING1B og BMI1, som er det centrale E3 ubiquitin ubiquitinligase-kompleks, der er ansvarlig for ovennævnte allestedsnærværende arrangement22,23. I Drosophila, H2A monoubiquitination (H2A K118ub som svarer til H2A K119ub i pattedyr) er vendt af dub Calypso, som interagerer med ekstra sexkam (ASX) danner polycomb-repressive Dub (pr-Dub) kompleks24. Den pattedyr ortholog af Calypso, BAP1, er en tumor suppressor slettet eller inaktiveret i forskellige humane maligniteter25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 regulerer DNA-afhængige processer i kernen og calcium-Signaling-medieret apoptose ved endoplasmatiske reticulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 samler multi-subunit protein komplekser, der indeholder transkriptionsregulatorer, især ASXL1, ASXL2 og ASXL3 (asxls), tre orthologues af ASX38,43. Asxls brug deubiquitinase adapter (deubad) domæne, også kaldet asxm domæne, at stimulere BAP1 dub aktivitet35,36,44. Derfor, ASXLs spille vigtige roller i koordineringen BAP1 DUB aktivitet på kromatin og mere generelt sin tumor suppressor funktion.
Der findes flere metoder til at studere allestedsnærværende og deubiquitination processer. Især biokemiske assays, som anvender proteiner, som er renset for bakterier, er fortsat meget kraftige i demonstrationen af direkte allestedsnærværende eller fjernelse af ubiquitin fra specifikke substrater. Disse eksperimenter kan udføres for at undersøge en række parametre såsom fastsættelsen af kravet om minimal komplekser, bestemmelse af reaktioner kinetik, definere struktur/funktion relationer, og forstå virkningen af patologiske genmutationer. Her tilbyder vi protokoller til at udføre allestedsnærværende og deubiquitination reaktioner på kromatin substrater med rensede komponenter. Som model system præsenteres in vitro -allestedsnærværende og deubiquitination af nukleosomal H2A protein. Bakterier-rensede proteiner samlet i minimale komplekser af RING1B/BMI1 og BAP1/DEUBAD anvendes til allestedsnærværende eller deubiquitination af henholdsvis nukleosomal H2A.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

Allestedsnærværende er en post-translationel modifikation, der spiller en vigtig rolle i forskellige signalering veje og er især involveret i koordineringen af kromatin funktion og DNA-associerede processer. Denne ændring indebærer en sekventiel handling af flere enzymer, herunder E1 ubiquitin-aktivering, E2 ubiquitin-konjugering og E3 ubiquitin-Ligase og er vendt af deubiquitinaser (DUBs). Allestedsnærværende inducerer nedbrydning af proteiner eller ændring af protein funktion, herunder graduering af enzymatisk aktivitet, protein-protein interaktion og subcellulær lokalisering. Et kritisk skridt i at påvise protein allestedsnærværende eller deubiquitination er at udføre in vitro-reaktioner med rensede komponenter. Effektive allestedsnærværende og deallesteds nærværende reaktioner kunne i høj grad påvirkes af de forskellige anvendte komponenter, enzym Co-faktorer, buffer betingelser og arten af substratet.  Her giver vi trin-for-trin protokoller for at gennemføre allestedsnærværende og deubiquitination reaktioner. Vi illustrerer disse reaktioner ved hjælp af minimale komponenter af musen polycomb repressive kompleks 1 (PRC1), BMI1, og RING1B, en E3 ubiquitin ubiquitinligase, at monoubiquitinates Histon H2A på lysin 119. Deubiquitination af nukleosomal H2A udføres ved hjælp af et minimalt Polycomb repressive Deubiquitinase (PR-DUB) kompleks dannet af den humane deubiquitinase BAP1 og DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domæne af dets co-faktor ASXL2. Disse allestedsnærværende/deubiquitination assays kan udføres i forbindelse med enten rekombinante nukleosomer rekonstitueret med bakterier-oprenset proteiner eller indfødte nukleosomer renset fra pattedyrceller. Vi fremhæver de snørklede, der kan have en betydelig indvirkning på disse reaktioner, og vi foreslår, at de generelle principper i disse protokoller hurtigt kan tilpasses andre E3 ubiquitin ligaser og deubiquitinaser.

GST-BMI1 og RING1B proteiner er godt produceret i bakterier og kan let udvindes i den opløselige fraktion. Figur 1a viser en Coomassie blå farvning for en typisk rensning af GST-BMI1-RING1B komplekset. GST-BMI1 og RING1B-båndet migrerer med den forventede molekylvægt, ~ 45 kDa og ~ 13 kDa hhv. Især E3 ubiquitinligase-komplekset er meget homisk med meget lave niveauer af bakterie proteiner forurenende stoffer og/eller nedbrydningsprodukter. Desuden, den s...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Allestedsnærværende er en post-translationel modifikation, der spiller en vigtig rolle i cellulære processer og er tæt koordineret af deubiquitination. Defekter i begge reaktioner ligger til grund for humane patologier. Vi leverer protokoller til gennemførelse af allestedsnærværende og deubiquitination reaktion in vitro ved hjælp af rensede komponenter.

In vitro-allestedsnærværende og Deubiquitinationassays af Nukleosomale histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

I betragtning af kompleksiteten af ubiquitinations- og deubiquitinationsreaktionerne inde i cellerne er det vigtigt at etablere in vitro-analyser med definerede rensede komponenter. Dette hjælper med at forstå mekanismerne i allestedsnærværende og deubiquitination og også til at bestemme, hvordan mutationer forbundet med gener, der koder de enzymer, der er ansvarlige for denne reaktion kan forårsage sygdomme hos mennesker. Vi kan identificere de domæner og motiver i disse komponenter, der driver disse reaktioner.Vi kan også udvikle høj overførselshastighed skærm analyser, der kan bruges til at screene for små molekylehæmmere, der kan udvikles som potentielle terapeutiske. For at begynde bakterier lysis, tilsæt PMSF og antiprotease cocktail i iskold lysis buffer A.Add 25 millilters af lysis buffer A i flasken indeholder bakterier pellet og resuspend pellet. Overfør lysatet indeholdende bakterier i et rør til sonikering.Brug en sondesonicator til at sonikere lysatet ved 70%output amplitude i 30 sekunder, fire til fem gange. Derefter centrifuge ved 21, 000 gange g i 20 minutter ved fire grader Celsius. Efter inkubation af bakterierne lysate med GSH perler i fem timer i henhold til manuskriptet, overføre perlerne sammen med 10 millilters af buffer i en tom kromatografi kolonne.Derefter tilsættes 1,5 millilters buffer A indeholdende 25 millimolar glutathion i kolonnen og indsamle elution ved tyngdekraft i 1,5 milliliter mikrorør. Gentag elueringsproceduren fire gange med frisk buffer A en fortsat behandling af de eluterede fraktioner i henhold til manuskriptet. Til at begynde, resuspend his-BAP1 og MBP-DEUBAD bakterier pellets i 25 millilters af iskold lysis buffer B.Mix 25 millilters af hver lysate og inkubere på is i 15 minutter.Sonikere og derefter centrifuge lysatet ved 21, 000 gange g i 20 minutter. Efter lysatcentrifugering filtreres lysatet gennem et 0,45 mikrometer poresprøjtefilter i en flaske og blandes med Nikkel NTA-perlerne. Inkuberes ved fire grader Celsius med rystelser i fem timer.Derefter drejes perlerne ned ved 25,000 gange g i tre minutter. Brug en pipette til at gemme supernatanten i et 50 milliliterrør, når strømmen igennem. Vask perlerne med fem millilters af buffer B, indeholdende 20 millimolar imidazol, seks gange med tre minutters centrifuge.Efter den sidste vask overføres perlerne med 10 fræsere buffer B til en tom kromatografikolonne, og der tilsættes en milliliter buffer B indeholdende 200 millimolar imidazol. Elutionen opsamler ved tyngdekraft i 1,5 millilitermikrorør, der indeholder DTT og EDTA. Gentag elueringsproceduren fire gange, og sammenfed de ønskede eluterede fraktioner i et 15 milliliterrør.Tilføj buffer C for at fortynde det eluterede kompleks tre gange. Overfør derefter den fortyndede elution til de forberedte amyloseperler i rør og inkuberes natten over ved fire grader Celsius med omrystning. Om morgenen centrifuger rørene ved 2,500 gange g i tre minutter og hold supernatanten i et 15 milliliterrør som gennemstrømning.Vask proteinbundne perler med fem fræsere af buffer C i fem til seks gange. Derefter tilsættes 500 mikroliter buffer D til det rensede His-BAP1/MBP-DEUBAD kompleks på amylose agarose perler for at lave en 50% perleopløsning. Overfør 20 mikroliter af 50%perleopløsningen til et mikrocentrifugerør og tilsæt 20 mikroliter af to gange Laemmli Sample Buffer til SDS-PAGE og Coomassie blå analyse.Opbevar den resterende perleløsning på minus 80 grader Celsius til fremtidig brug. Efter kultur hek293T celler, plade 12 millioner celler i 20 millilters af komplette medier i en 15 centimeter kultur parabol, en dag før transfektion. Efter en dag, under cellekulturhætten, aspirat medier og forsyning med 12 millilters af serum frie medier.Transfect cellerne med 21 mikrogram pCDNA flad-H2A ved hjælp af 63 mikroliter PEI på en milligram pr. milliliter. Efter 12 timer skal du skifte til komplet medium. Efter høst af cellerne i henhold til manuskriptet, resuspend cell pellet i omkring 10 mængder af buffer E indeholder NEM at hæmme deubiquitinases og du inkubere på is i 20 minutter.Efter centrifugering ved 3,000 gange g i fem minutter, kassér supernatanten. Kromatinpilleren vaskes to gange med 10 volumener buffer E først, og vask derefter to gange med bufferen F.Resuspend kromatin i fem fræsere buffer F, og pellet med mikrokokkernekerne behandles ved koncentrationen af tre enheder pr. milliliter i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation overføres en 40 mikroliter aliquot af blandingen til et 1,5 milliliterrør til analyse af nukleosomale DNA-fragmenter.Der tilsættes 40 mikroliter fenolchloroform og 20 mikroliter af seks gange DNA-belastningsbuffer. Vortex og spin på 18, 000 gange g i to minutter. Overfør derefter 15 mikroliter af den vandige fase i en 2% agarosegel for at indlæse DNA'et.Efter at have stoppet reaktionen og centrifugering i henhold til manuskriptet, inkuberes den opløselige kromatinfraktion med anti-flag harpiksperler i et 15 milliliterrør natten over ved fire grader Celsius med omrystning. Vask perlerne seks gange med buffer G.Overfør perlerne med fem millilters af buffer G i en tom kromatografi kolonne. Begudlerens bundne nukleosomer fortyndes med 260 mikroliter buffer G indeholdende 200 mikrogram pr. milliliter flagelutionpetid og et til fem molar Tris ved pH otte.Elute nukleosomer tre gange, en time i det kolde rum. For at udføre ubiquitinationsanalyse, først tilføje et mikrogram af de rensede nukleosomer i 40 mikroliter af buffer H.After at, tilføje en enzymopløsning mix indeholdende 250 nanogram UBE1, 672 nanogram UB og E2 UB konjugerende enzymer og et mikrogram BMI1-RING1B E3 ubiquitin ligase kompleks i røret. Inkuber reaktionen i tre timer ved 37 grader Celsius med lejlighedsvis rystelser.Stop reaktionen ved at tilføje 40 mikroliter af to gange Laemmli Sample Buffer og analysere histon H2AK119 ubiquitination ved vestlige blotting. At udføre in vitro deubiquitination assay resuspend de rensede nukleosomer i 40 mikroliter buffer I og et mikrogram bakterier renset His-BAP1/MBP-DEUBAD perler. Røret anbringes i en inkubator ved 37 grader Celsius i tre timer for at udføre deubiquitinationsreaktionen med lejlighedsvis omrystning.Derefter stoppe reaktionen ved at tilføje 40 mikroliter af to gange Laemmli buffer og analysere ved immunblotting. I dette eksperiment viser Coomassie blå farvning for en typisk rensning af GST-BM1-RING1B-komplekset ved hjælp af GST affinitetsperler, at båndene vandrer med forventet kindtandvægt på omkring henholdsvis 45 kilodalton og 13 kilodaltons. Tilsvarende resulterede rensningen af Hans-BAP1 MBP-DEUBAD-komplekset også i relativt høje homogene præparater med bånd på henholdsvis ca. 90 kilodalton og 55 kilodaltons.På den anden side består den rensede nukleosomale fraktion hovedsagelig af et 147 basisparbånd, der angiver tilstedeværelsen af stærkt beriget mononukleosomfraktion. Coomassie blå farvning af rensede nukleosomer viser et typisk båndmønster af de fire histoneunderenheder med støkiometriske mængder. Ubiquitination af histon H2A med BMI1-RING1B-komplekset viser en tidsafhængig forøgelse af proteinets ubiquitinerede form, mens niveauet af den ikke-modificerede form samtidig er faldet.Allestedsnærværende reaktion er total, da stort set alle H2A-proteiner omdannes til H2A K119ub. På den anden side, deubiquitination assay blev gennemført indfødte nukleosomer. Efter inkubation af disse nukleosomer med BAP1-DEUBAD blev der observeret en tidsafhængig reduktion af H2A K119ub-signalet.Succesen med allestedsnærværende og deubiquitinationsreaktioner afhænger af den måde, hvorpå proteinet renses. Vi har brug for et godt udbytte, og bufferbrugen til tilbagekald af protein og rensning bør være forenelig med biokemiske reaktioner. Når denne allestedsnærværende og deubiquitination assays er veletableret, kan vi teste de påvirker aktivatorer og inhibitorer samt virkningen af sygdoms tilknyttede genmutationer.Denne metode er blevet fastlagt ved bidrag fra flere laboratorier og er meget nyttige til at forstå mekanismerne for allestedsnærværende og deubiquitination. Flere kemikalier er farlige og skal manipuleres i kølerhjelmen. Dette omfatter phenol-chloroform, syrer, baser, og reduktionsmidler.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiseret Akustisk Udlevering til seriel fortynding af peptid agonister i Potens Bestemmelse assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstituering af nucleosomer med differentielt isotopmærkede Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse af superkomplekser af den mitokondrieelektron transportkæde med indfødte elektroforese, in-gel analyser og elektrolysering

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantificering af hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funktionel karakterisering af RING type E3 Ubiquitin-Ligaser in vitro og i planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Trinvis doseringprotokol for øget overførselstid i label-free impedansbaserede GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...