Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
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Nous remercions Diana Adjaoud pour son assistance technique. Ces travaux ont été appuyés par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (2015-2020), de Génome Québec (2016-2019) et de Génome Canada (2016-2019) à E.B.A. E.B.A. est chercheur principal au Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L.M et N.S.K. ont une bourse de doctorat du FRQ-S. H.B a obtenu une bourse de doctorat du Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique de Tunisie et de la Fondation Cole.

1. Purification d'affinité GSH-agarose du complexe Gst-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase
<ol><li>Utilisez le pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) bactéries expression construire pour transformer BL21 (DE3) bactéries (voir Tableau des matériaux)23. Cette construction permet l'expression du domaine ring1B murine 1-159 fusionné au domaine BMI1 1-109 avec l'étiquette de TPS dans l'épine dorsale pGEX-6P-2.</li>
	<li>Effectuer une culture de démarrage...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

Il y a plusieurs avantages d'établir l'ubiquitination in vitro robuste et les essais de deubiquitination pour des protéines d'intérêt. Ces essais peuvent être utilisés pour : (i) établir des conditions optimales et définir l'exigence minimale pour ces réactions, (ii) déterminer les constantes cinétiques et biochimiques enzymatiques, (iii) définir les rôles des cofacteurs ou des inhibiteurs qui peuvent avoir un impact sur ces réactions, (iv) identifier les interfaces d'interaction, (v) tester l'impact des mu...

L'ubiquitination est l'une des modifications post-traductionnelles les plus conservées et est essentielle pour une grande variété d'organismes, y compris la levure, les plantes et les vertébrés. L'ubiquitination consiste en l'attachement covalent de l'ubiquitine, un polypeptide d'acide aminé hautement conservé 76, pour cibler les protéines et se produit en trois étapes séquentielles impliquant trois enzymes, c'est-à-dire E1-activation, E2-conjugué et E3 ligase1, 2,3. Cette modification post-traductionnelle joue un rôle central dans un large éventail de processus biologiques. En effet, les ligases E3, qui fournissent la spécificité de la réaction, constituent une grande superfamille d'enzymes et sont les enzymes les plus abondantes du système d'ubiquitine4,5,6. Les effets en aval de l'ubiquitination des protéines dépendent de la nature de la modification : monoubiquitination, multi-monoubiquitination et polyubiquitination linéaire ou ramifiée. La monoubiquitination est rarement associée à la dégradation protéasomal, mais au lieu de cela cette modification est impliquée dans la médiation de divers événements de signalisation. La polyubiquitination implique le N-terminal ou les résidus de lysine dans la molécule d'ubiquitine elle-même, et le destin d'une protéine polyubiquitinated dépend de quel résidu est impliqué dans l'extension de la chaîne d'ubiquitine. On sait depuis longtemps que la polyubiquitination médiée par la lysine 48 de l'ubiquitine induit une dégradation protéasomale. Au contraire, la polyubiquitination par lysine 63 de l'ubiquitine est souvent associée à l'activation des protéines7,8,9. Semblable à d'autres modifications post-traductionnelles importantes, l'ubiquitination est réversible et l'élimination de l'ubiquitine des protéines est assurée par des protéases spécifiques appelées deubiquitinases (DUB), qui ont émergé comme régulateurs importants des processus cellulaires 2 (en) , 10. Fait important, de nombreux DUB sont hautement spécialisés, et régulent, par la déubiquitination, des substrats spécifiques, ce qui indique qu'un équilibre fin entre l'ubiquitination et la deubiquitination est essentiel pour la fonction protéique. Les E3 et les DUB, ainsi que les machines de dégradation protéasome et les facteurs accessoires, forment le système de protéasome d'Ubiquitin (UPS, avec les gènes de '1200) qui règle les voies de signalisation principales, dont plusieurs sont associées à la croissance et à la prolifération cellulaires, détermination du destin cellulaire, différenciation, migration cellulaire et mort cellulaire. Fait important, la déréglementation de plusieurs cascades de signalisation impliquant l'ubiquitination favorise la tumorigénèse et les maladies de neurodégénérescence5,11,12,13, 14.
L'ubiquitination joue un rôle omniprésent dans la biologie de la chromatine et les processus dépendants de l'ADN15,16,17. Par exemple, la monoubiquitination de l'histone H2A sur la lysine 119 (ci-après H2A K119ub) est une modification post-traduction essentielle impliquée dans la répression transcriptionnelle et la réparation de l'ADN18,19,20, 21,22. H2A K119ub est catalysé par le Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), qui joue un rôle clé dans le maintien de l'information épigénétique et est fortement conservé de Drosophila à l'homme. Canonical PRC1 est constitué notamment par le RING1B et BMI1, qui sont le complexe de base E3 ubiquitin ligase responsable de l'événement d'ubiquitination mentionné ci-dessus22,23. Dans Drosophila, La monoubiquitination H2A (H2A K118ub qui correspond à H2A K119ub chez les mammifères) est inversée par le DUB Calypso, qui interagit avec Le Comb sexuel supplémentaire (ASX) formant le polycomb-répressif DUB (PR-DUB) complexe24. L'ortholog mammifère de calypso, BAP1, est un suppresseur de tumeur supprimé ou inactivé dans diverses malignités humaines25,26,27,28, 29 Ans et plus , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33. BAP1 régule les processus dépendants de l'ADN dans le noyau et l'apoptose à médiation calcique à l'endoplasmique33,34,35,36 ,36, 37 Ans, états-unis ( , 38 Annonces , 39 Ans et plus qu'ils , 40 ans, états-unis ( , 41 Ans, états-unis ( , 42. BAP1 assemble des complexes protéiques multi-subunit contenant des régulateurs de transcription notamment ASXL1, ASXL2 et ASXL3 (ASXLs), trois orthologues de l'ASX38,43. ASXLs utilisent le domaine DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), également appelé domaine ASXM, pour stimuler l'activité BAP1 DUB35,36,44. Par conséquent, ASXLs jouent des rôles importants en coordonnant l'activité DEB DEB de BAP1 à la chromatine et plus largement sa fonction de suppresseur de tumeur.
Plusieurs méthodes existent pour étudier les processus d'ubiquitination et de déubiquitination. Notamment, les essais biochimiques utilisant des protéines purifiées des bactéries restent très puissants en démontrant l'ubiquitination directe de, ou l'élimination de l'ubiquiitin de, substrats spécifiques. Ces expériences peuvent être menées pour étudier une gamme de paramètres tels que la détermination de l'exigence de complexes minimaux, la détermination des réactions cinétiques, la définition des relations structure/fonction, et la compréhension de l'impact des pathologies mutations génétiques. Ici, nous fournissons des protocoles pour mener des réactions d'ubiquitination et de deubiquitination sur des substrats de chromatine avec des composants purifiés. En tant que système modèle, l'ubiquitination in vitro et la deubiquitination de la protéine nucléosomale H2A sont présentées. Les protéines purifiées par les bactéries assemblées dans des complexes minimaux de RING1B/BMI1 et BAP1/DEUBAD sont utilisées respectivement pour l'ubiquitination ou la déubiquitination du H2A nucléosomal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans diverses voies de signalisation et est notamment impliquée dans la coordination de la fonction de chromatine et des processus associés à l'ADN. Cette modification implique une action séquentielle de plusieurs enzymes, y compris E1 ubiquiitin-activation, E2 ubiquiitin-conjugué et E3 ubiquiitin-ligase et est inversée par deubiquitinases (DUBs). L'ubiquitination induit la dégradation des protéines ou l'altération de la fonction protéique, y compris la modulation de l'activité enzymatique, l'interaction protéine-protéine et la localisation subcellulaire. Une étape critique dans la démonstration de l'ubiquitination ou de la déubiquitination des protéines est d'effectuer des réactions in vitro avec des composants purifiés. Les réactions efficaces d'ubiquitination et de deubiquitination pourraient être grandement affectées par les différents composants utilisés, les cofacteurs enzymatiques, les conditions tampons et la nature du substrat.  Ici, nous fournissons des protocoles étape par étape pour effectuer des réactions d'ubiquitination et de déubiquitination. Nous illustrons ces réactions en utilisant des composants minimes de la souris Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, et RING1B, une ligase d'ubiquitine E3 qui monoubiquitinates histone H2A sur la lysine 119. La deubiquitination de H2A nucléosomal est exécutée utilisant un complexe minimal de Deubiquitinase répressif de Polycomb (PR-DUB) formé par le BAP1 deubiquitinase humain et le domaine d'ADaptor de DEUBiquitinase (DEUBAD) de son co-facteur ASXL2. Ces essais d'ubiquitination/deubiquitination peuvent être effectués dans le contexte des nucléosomes recombinants reconstitués avec des protéines bactéries purifiées ou des nucléosomes indigènes purifiés à partir de cellules de mammifères. Nous soulignons les subtilités qui peuvent avoir un impact significatif sur ces réactions et nous proposons que les principes généraux de ces protocoles puissent être rapidement adaptés à d'autres ligases et deubiquitinases ubiquitine e3.

Les protéines GST-BMI1 et RING1B sont bien produites par les bactéries et peuvent être facilement extraites dans la fraction soluble. La figure 1A montre une coloration bleue Coomassie pour une purification typique du complexe GST-BMI1-RING1B. Les bandes GST-BMI1 et RING1B migrent au poids moléculaire prévu, soit 45 kDa et 13 kDa respectivement. Notamment le complexe de ligase E3 est très homogène avec de très faibles niveaux de bactéries protéines ...

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans les processus cellulaires et est étroitement coordonnée par la désubiquitination. Les défauts dans les deux réactions sous-tendent les pathologies humaines. Nous fournissons des protocoles pour mener la réaction d'ubiquitination et de deubiquitination in vitro utilisant des composants purifiés.

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Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Compte tenu de la complexité des réactions d’ubiquitination et de dubiquitination à l’intérieur des cellules, il est important d’établir des analyses in vitro avec des composants purifiés définis. Cela aide à comprendre les mécanismes de l’ubiquitination et de la déubiquitination et aussi à déterminer comment les mutations associées aux gènes qui codent les enzymes responsables de cette réaction peuvent causer des maladies humaines. Nous pouvons identifier les domaines et les motifs de ces composants qui conduisent ces réactions.Nous pouvons également développer des analyses d’écran à haut débit qui peuvent être utilisées pour dépister les inhibiteurs de petites molécules qui peuvent être développés comme thérapeutiques potentielles. Pour commencer la lyse bactérienne, ajouter le PMSF et le cocktail antiprotéase dans le tampon de lyse glacée A.Ajouter 25 milliltères du tampon de lyse A dans la bouteille contenant des granulés bactérieux et résuspendre la pastille. Transférer le lysate contenant des bactéries dans un tube pour la sonication.Utilisez un sonicateur de sonde pour sonifier le lysate à 70% d’amplitude de sortie pendant 30 secondes, quatre à cinq fois. Puis centrifugeuse à 21 000 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir incubé les bactéries lysate avec des perles GSH pendant cinq heures selon le manuscrit, transférer les perles avec 10 millilters de tampon dans une colonne de chromatographie vide.Ensuite, ajoutez 1,5 milliltres de tampon A contenant 25 millimolaires de glutathion dans la colonne et recueillez l’élitution par gravité en microtubes de 1,5 millilitre. Répétez la procédure d’élitution quatre fois avec le tampon frais A un traitement continu des fractions élucidées selon le manuscrit. Pour commencer, resuspendez les granulés de bactéries His-BAP1 et MBP-DEUBAD dans 25 milliltères de tampon de lyse glacée B.Mix 25 milliltères de chaque lysate et incuber sur la glace pendant 15 minutes.Sonicate, puis centrifugeuse du lysate à 21 000 fois g pendant 20 minutes. Après centrifugation lysate, filtrer le lysate à travers un filtre à seringue pore de 0,45 micromètre dans une bouteille et le mélanger avec les perles Nickel NTA. Incuber à quatre degrés Celsius en secouant pendant cinq heures.Après ça, faites tourner les perles à 25 000 fois g pendant trois minutes. Utilisez une pipette pour sauver le surnatant dans un tube de 50 millilitres que le flux à travers. Laver les perles avec cinq milliltères de tampon B, contenant 20 millimolaires d’imidazole, six fois avec une centrifugeuse de trois minutes.Après le dernier lavage, transférer les perles avec 10 milliltères de tampon B dans une colonne de chromatographie vide et ajouter un millilitre de tampon B contenant 200 millimolaires d’imidazole. Recueillir l’élitution par gravité en microtubes de 1,5 millilitre contenant de la TNT et de l’EDTA. Répétez la procédure d’élitution quatre fois et mettre en commun les fractions allongées désirées dans un tube de 15 millilitres.Ajouter le tampon C pour diluer le complexe élucidé trois fois. Ensuite, transférez l’elution diluée aux perles d’amylose préparées dans des tubes et incubez pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec des secousses. Le matin, centrifugez les tubes à 2500 fois g pendant trois minutes et gardez le supernatant dans un tube de 15 millilitres comme écoulement à travers.Lavez les perles liées aux protéines avec cinq milliltères de tampon C pendant cinq à six fois. Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon D au complexe purifié His-BAP1/MBP-DEUBAD sur les perles d’agarose d’amylose pour faire une solution de perles à 50%. Transférer 20 microlitres de la solution de perles à 50% dans un tube de microcentrifugeuse et ajouter 20 microlitres de deux fois tampon échantillon Laemmli pour L’analyse bleue SDS-PAGE et Coomassie.Conservez le reste de la solution de perles à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Après culture, les cellules HEK293T, plaquent 12 millions de cellules en 20 milliltères de médias complets dans un plat de culture de 15 centimètres, un jour avant la transfection. Après une journée, sous le capot de la culture cellulaire, aspirer les médias et fournir 12 milliltères de sérum médias libres.Transfect les cellules avec 21 microgrammes de pCDNA plat-H2A utilisant 63 microlitres de PEI à un milligramme par millilitre. Après 12 heures, passer à un milieu complet. Après la récolte des cellules selon le manuscrit, résuspendez la pastille cellulaire dans environ 10 volumes de tampon E contenant nem pour inhiber les deubiquitinases et vous couvez sur la glace pendant 20 minutes.Après centrifugation à 3000 fois g pendant cinq minutes, jeter le supernatant. Lavez la pastille de chromatine deux fois avec 10 volumes de tampon E d’abord, puis lavez-la deux fois avec le tampon F.Resuspendez la chromatine en cinq milliltères de tampon F et traitez la pastille avec de la nucléase micrococcique à la concentration de trois unités par millilitre pendant 10 minutes à température ambiante. Après incubation, transférer un aliquot de 40 microlitres du mélange dans un tube de 1,5 millilitre pour l’analyse des fragments d’ADN nucléosomal.Ajouter 40 microlitres de phénol-chloroforme et 20 microlitres de six fois tampon de chargement de l’ADN. Vortex et tourner à 18 000 fois g pendant deux minutes. Puis transférer 15 microlitres de la phase aqueuse dans un gel agarose de 2% pour charger l’ADN.Après avoir arrêté la réaction et la centrifugation selon le manuscrit, incuber la fraction soluble de chromatine avec des perles de résine anti-drapeau dans un tube de 15 millilitres pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec secousses. Lavez les perles six fois avec le tampon G.Transférez les perles avec cinq milliltères de G tampon dans une colonne de chromatographie vide. Diluer les nucléosomes liés de la perle avec 260 microlitres de G tampon contenant 200 microgrammes par millilitre de peptide d’élitution du drapeau et un à cinq tris molaires au pH huit.Elute les nucléosomes trois fois, une heure dans la chambre froide. Pour effectuer l’analyse d’ubiquitination, ajoutez d’abord un microgramme des nucléosomes purifiés dans 40 microlitres d’enzymes conjuguées H.After tampon, ajoutez un mélange de solutions enzymatiques contenant 250 nanogrammes d’UBE1, 672 nanogrammes d’enzymes conjuguées UB et E2 UB et un microgramme d’ubiquitine BMI1-RING1B E3 complexe de ligastine dans le tube. Incuber la réaction pendant trois heures à 37 degrés Celsius avec des secousses occasionnelles.Arrêtez la réaction en ajoutant 40 microlitres de deux fois Tampon échantillon Laemmli et d’analyser l’ubiquitination histone H2AK119 par ballonnement occidental. Pour effectuer le test de déubiquitination in vitro, réutilisez les nucléosomes purifiés dans 40 microlitres de tampon I et un microgramme de bactéries purifiées perles His-BAP1/MBP-DEUBAD. Placez le tube dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois heures pour effectuer la réaction de désubiquitination avec des secousses occasionnelles.Puis arrêter la réaction en ajoutant 40 microlitres de deux fois tampon Laemmli et d’analyser par immunoblotting. Dans cette expérience, la coloration bleue Coomassie pour une purification typique du complexe GST-BM1-RING1B à l’aide de perles d’affinité de TPS montre que les bandes migrent à un poids molaire prévu autour de 45 kilodaltons et 13 kilodaltons respectivement. De même, la purification du complexe His-BAP1 MBP-DEUBAD a également donné lieu à des préparations homogènes relativement élevées avec des bandes d’environ 90 kilodaltons et 55 kilodaltons respectivement.D’autre part, la fraction nucléosomale purifiée est essentiellement composée par une bande de 147 paires de base indiquant la présence d’une fraction mononucléosomale hautement enrichie. La coloration bleue coomassie des nucléosomes purifiés montre un modèle typique de bande des quatre sous-unités d’histone avec des quantités stoichiométriques. L’ubiquitination de l’histone H2A avec le complexe BMI1-RING1B montre une augmentation dépendante du temps de la forme ubiquitinated de la protéine tandis que les niveaux de la forme non modifiée sont simultanément diminués.La réaction d’ubiquitination est totale car pratiquement toutes les protéines H2A sont transformées en H2A K119ub. D’autre part, l’essai de déubiquitination a été mené nucléosomes indigènes. Après incubation de ces nucléosomes avec BAP1-DEUBAD, une réduction dépendante du temps du signal H2A K119ub a été observée.Le succès des réactions d’ubiquitination et de dubiquitination dépend de la façon dont la protéine est purifiée. Nous avons besoin d’un bon rendement et l’utilisation tampon pour la résuspension et la purification des protéines doit être compatible avec les réactions biochimiques. Lorsque ces analyses d’ubiquitination et de déubiquitination sont bien établies, nous pouvons tester les activateurs et inhibiteurs affectifs ainsi que l’impact des mutations génétiques associées à la maladie.Cette méthode a été établie par la contribution de plusieurs laboratoires et sont très utiles pour comprendre les mécanismes d’ubiquitination et de déubiquitination. Plusieurs produits chimiques sont dangereux et doivent être manipulés dans le capot. Ceci inclut le phénol-chloroforme, les acides, les bases, et les agents réducteurs.

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