Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
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Wir danken Diana Adjaoud für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) und Genome Canada (2016-2019) an E.B.A. E.B.A. unterstützt, der ein leitender Wissenschaftler des Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S) ist. L.M und N.S.K. haben ein Promotionsstipendium der FRQ-S. H.B. erhielt ein Promotionsstipendium des Ministeriums für Hochschulbildung und der wissenschaftlichen Forschung Tunesiens und der Cole Foundation.

1. GSH-Agarose Affinitätsreinigung des GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase Complex
<ol><li>Verwenden Sie das PGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) Bakterienexpressionkonstrukt, um BL21 (DE3) Bakterien zu transformieren (siehe Tabelle der Materialien)23. Dieses Konstrukt ermöglicht die Expression der murinen RING1B-Domäne 1-159, die mit der BMI1-Domäne 1-109 mit GST-Tag im pGEX-6P-2-Backbone verschmolzen wird.</li>
	<li>Führen Sie eine Nacht-Starte...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+structure+and+function+of+the+deubiquitinases.">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unravelling+of+the+ubiquitin+system.">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li><li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+cell-cycle+control+and+cancer.">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li><li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy.">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Ligases:+Structure,+Function,+and+Regulation.">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li><li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages.">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li><li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code.">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li><li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation.">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li><li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity.">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li><li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense:+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing.">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li><li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation.">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li><li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers.">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li><li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response.">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li><li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast.">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li><li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control.">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li><li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions.">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li><li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter.">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li><li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B.">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li><li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB.">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li><li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1:+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression.">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li><li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas.">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li><li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma,+lung+adenocarcinoma,+meningioma,+and+other+cancers.">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li><li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma.">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li><li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility.">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li><li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma.">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li><li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors.">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li><li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation.">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li><li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma.">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li><li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2++flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation.">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1.">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385 (2018).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAP1/ASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer.">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li><li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O.">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression.">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair.">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li><li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response.">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression.">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li><li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells.">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1.">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li><li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

Es gibt mehrere Vorteile der Etablierung robuster In-vitro-Ubiquitination und Deubiquitination Assays für Proteine von Interesse. Diese Assays können verwendet werden, um: (i) optimale Bedingungen zu schaffen und minimale Anforderungen für diese Reaktionen zu definieren, (ii) enzymatische kinetische und biochemische Konstanten zu bestimmen, (iii) die Rolle von Kofaktoren oder Inhibitoren zu definieren, die diese Reaktionen beeinflussen können, (iv) Identifizierung von Wechselwirkungsschnittstellen, (v) Untersuchung d...

Ubiquitination ist eine der am besten erhaltenen post-translationalen Modifikationen und ist entscheidend für eine Vielzahl von Organismen, einschließlich Hefe, Pflanzen und Wirbeltiere. Ubiquitination besteht aus der kovalenten Anhaftung von Ubiquitin, einem hochkonservierten 76-Aminosäure-Polypeptid, an Zielproteinen und erfolgt in drei aufeinanderfolgenden Schritten mit drei Enzymen, d.h. E1-aktivierend, E2-konjugierend und E3-Ligase1, 2,3. Diese posttranslationale Modifikation spielt eine zentrale Rolle in einem breiten Spektrum biologischer Prozesse. Tatsächlich bilden die E3-Ligasen, die die Spezifität der Reaktion liefern, eine große Überfamilie von Enzymen und sind die am häufigsten vorkommenden Enzyme des Ubiquitinsystems4,5,6. Die nachgelagerten Wirkungen der Proteinubiquitination hängen von der Art der Modifikation ab: Monoubiquitination, Multimonoubiquitination und lineare oder verzweigte Polyubiquitination. Monoubiquitination ist selten mit proteasomaler Degradation verbunden, aber stattdessen ist diese Modifikation bei der Vermittlung verschiedener Signalereignisse beteiligt. Polyubiquitination beinhaltet das N-Terminal oder die Lysin-Rückstände im Ubiquitin-Molekül selbst, und das Schicksal eines polyubiquitinierten Proteins hängt davon ab, welche Rückstände an der Ubiquitin-Kettenverlängerung beteiligt sind. Es ist seit langem bekannt, dass Polyubiquitination durch Lysin 48 von Ubiquitin vermittelt proteasomal Abbau induziert. Im Gegenteil, Polyubiquitination über Lysin 63 von Ubiquitin ist oft mit Proteinaktivierungassoziiert 7,8,9. Ähnlich wie bei anderen wichtigen posttranslationalen Modifikationen ist die Ubiquitination reversibel und die Ubiquitinentfernung von Proteinen wird durch spezifische Proteasen, die als Deubiquitinasen (DUBs) bezeichnet werden, gewährleistet, die sich als wichtige Regulatoren zellulärer Prozesse herauskristallisiert haben. 2 , 10. Wichtig ist, dass viele DUBs hochspezialisiert sind und durch Deubiquitination spezifische Substrate regulieren, was darauf hindeutet, dass ein feines Gleichgewicht zwischen Ubiquitination und Deubiquitination für die Proteinfunktion entscheidend ist. E3s und DUBs bilden zusammen mit den Proteasomenabbaumaschinen und Zubehörfaktoren das Ubiquitin Proteasome System (UPS, mit >1200 Genen), das wichtige Signalwege reguliert, von denen einige mit Zellwachstum und -proliferation verbunden sind, Zellschicksalsbestimmung, Differenzierung, Zellmigration und Zelltod. Wichtig ist, dass die Deregulierung mehrerer Signalkaskaden mit Ubiquitination Tumorgenese und Neurodegenerationerkrankungen5,11,12,13 , 14.
Ubiquitination spielt eine allgegenwärtige Rolle in der Chromatinbiologie und DNA-abhängigen Prozessen15,16,17. Zum Beispiel ist die Monoubiquitination des Histones H2A auf Lysin 119 (im Folgenden H2A K119ub) eine kritische posttranslationale Modifikation, die an der Transkriptionsrepression und DNA-Reparatur beteiligt ist18,19,20, 21,22. H2A K119ub wird durch den Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) katalysiert, der eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung epigenetischer Informationen spielt und von Drosophila bis zum Menschen hochkonserviert ist. Canonical PRC1 besteht insbesondere aus dem RING1B und BMI1, die der Kern Komplex E3 ubiquitin ligase sind, der für das oben erwähnte Ubiquitinationsereignis22,23verantwortlich ist. In Drosophilawird die H2A-Monoubiquitination (H2A K118ub, die H2A K119ub bei Säugetieren entspricht) durch den DUB Calypso umgekehrt, der mit Additional Sex Comb (ASX) interagiert und den Polycomb-repressiven DUB (PR-DUB) Komplexbildet 24. Der Säugetierortholog von calypso, BAP1, ist ein Tumorsuppressor, der bei verschiedenen menschlichen Malignomen gelöscht oder inaktiviert wurde25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 reguliert DNA-abhängige Prozesse im Zellkern und Calcium-Signal-vermittelte Apoptose am endoplasmatischen Retikulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 montiert Multi-Subunit-Proteinkomplexe, die Transkriptionsregler, insbesondere ASXL1, ASXL2 und ASXL3 (ASXLs), drei Orthologues von ASX38,43enthalten. ASXLs verwenden die Domäne DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), auch ASXM-Domäne, um die BAP1 DUB-Aktivität35,36,44zu stimulieren. Daher spielen ASXLs eine wichtige Rolle bei der Koordination der BAP1 DUB-Aktivität bei Chromatin und allgemeiner seiner Tumorsuppressorfunktion.
Es gibt mehrere Methoden, um Ubiquitination und Deubiquitination Prozesse zu studieren. Insbesondere biochemische Assays mit Proteinen, die von Bakterien gereinigt werden, sind nach wie vor sehr mächtig, wenn es um die direkte Ubiquitinierung oder Entfernung von Ubiquitin aus bestimmten Substraten geht. Diese Experimente können durchgeführt werden, um eine Reihe von Parametern zu untersuchen, wie z. B. die Bestimmung der Anforderung von minimalen Komplexen, die Bestimmung der Reaktionskinetik, die Definition von Struktur-/Funktionsbeziehungen und das Verständnis der Auswirkungen pathologischer Genmutationen. Hier bieten wir Protokolle zur Durchführung von Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen auf Chromatinsubstraten mit gereinigten Komponenten. Als Modellsystem wird in vitro Ubiquitination und Deubiquitination von nukleosomalem H2A-Protein vorgestellt. Bakteriengereinigte Proteine, die in minimalen Komplexen von RING1B/BMI1 und BAP1/DEUBAD zusammengesetzt sind, werden zur Ubiquitination bzw. Deubiquitination von nukleosomalem H2A verwendet.

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		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in verschiedenen Signalwegen spielt und insbesondere an der Koordination von Chromatinfunktion und DNA-assoziierten Prozessen beteiligt ist. Diese Modifikation beinhaltet eine sequenzielle Wirkung mehrerer Enzyme, einschließlich E1-Ubiquitin-aktivierend, E2-Ubiquitin-konjugating und E3-Ubiquitin-Ligase und wird durch Deubiquitinasen (DUBs) umgekehrt. Ubiquitination induziert Abbau von Proteinen oder Veränderung der Proteinfunktion einschließlich Modulation der enzymatischen Aktivität, Protein-Protein-Interaktion und subzelluläre Lokalisierung. Ein entscheidender Schritt beim Nachweis der Proteinubiquitination oder Deubiquitination ist die Durchführung von In-vitro-Reaktionen mit gereinigten Komponenten. Effektive Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen könnten stark durch die verschiedenen verwendeten Komponenten, Enzym-Co-Faktoren, Pufferbedingungen und die Art des Substrats beeinflusst werden.  Hier bieten wir Schritt-für-Schritt-Protokolle zur Durchführung von Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen. Wir veranschaulichen diese Reaktionen mit minimalen Komponenten der Maus Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1 und RING1B, einer E3-Ubiquitinligase, die Denton H2A auf Lysin 119 monoubiquitiniert. Die Deubiquitination von nukleosomaler H2A erfolgt mit einem minimalen Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) Komplex, der durch die menschliche Deubiquitinase BAP1 und die DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) Domäne seines Co-Faktors ASXL2 gebildet wird. Diese Ubiquitination/Deubiquitination Assays können im Kontext entweder rekombinanter Nukleosomen durchgeführt werden, die mit bakteriellen gereinigten Proteinen oder einheimischen Nukleosomen, die aus Säugetierzellen gereinigt werden, rekonstituiert wurden. Wir weisen auf die Feinheiten hin, die einen erheblichen Einfluss auf diese Reaktionen haben können, und schlagen vor, dass die allgemeinen Prinzipien dieser Protokolle rasch an andere E3-Ubiquitinligasen und Deubiquitinasen angepasst werden können.

GST-BMI1- und RING1B-Proteine sind gut in Bakterien produziert und können leicht in der löslichen Fraktion extrahiert werden. Abbildung 1A zeigt eine Coomassie-Blaufärbung für eine typische Reinigung des GST-BMI1-RING1B-Komplexes. Die Bänder GST-BMI1 und RING1B wandern mit dem erwarteten Molekulargewicht von 45 kDa bzw. 13 kDa. Insbesondere der E3-Ligase-Komplex ist sehr homogen mit sehr niedrigen Konzentrationen von Bakterienproteinen Verunreinigungen u...

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Angesichts der Komplexität der Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen in den Zellen ist es wichtig, In-vitro-Assays mit definierten gereinigten Komponenten zu etablieren. Dies hilft, die Mechanismen der Ubiquitination und Deubiquitination zu verstehen und auch zu bestimmen, wie Mutationen im Zusammenhang mit Genen, die die Enzyme kodieren, die für diese Reaktion verantwortlich sind, menschliche Krankheiten verursachen können. Wir können die Bereiche und Motive in diesen Komponenten identifizieren, die diese Reaktionen antreiben.Wir können auch Bildschirmtests mit hohem Durchsatz entwickeln, die verwendet werden können, um auf kleine Molekülinhibitoren zu untersuchen, die als potenzielle Therapeutika entwickelt werden können. Um mit der Bakterienlyse zu beginnen, fügen Sie PMSF und Antiprotease-Cocktail in den eiskalten Lysepuffer A. Fügen Sie 25 Milliliter des Lysepuffers A in die Flasche mit Bakterienpellet ein und setzen Sie das Pellet wieder auf. Übertragen Sie das lysathaltige Bakterien in ein Rohr zur Beschallung.Verwenden Sie einen Sondenschalltonor, um das Lysat bei 70%Output-Amplitude für 30 Sekunden, vier- bis fünfmal zu beschallen. Dann Zentrifuge bei 21.000 mal g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation der Bakterien lysiert mit GSH-Perlen für fünf Stunden nach dem Manuskript, übertragen Sie die Perlen zusammen mit 10 Milliliter Puffer in eine leere Chromatographie-Säule.Dann fügen Sie 1,5 Milliliter Puffer A mit 25 Millimolar Glutathion in die Spalte und sammeln Sie die Elution durch Schwerkraft in 1,5 Milliliter Mikroröhren. Wiederholen Sie das Elutionsverfahren viermal mit frischem Puffer A eine weitere Behandlung der eluierten Fraktionen nach dem Manuskript. Zunächst sollten die Bakterienpellets His-BAP1 und MBP-DEUBAD in 25 Millilitere eiskaltelysepuffer B.Mix 25 Milliliter jedes Lysats wieder ausgesetzt und 15 Minuten lang auf Eis brütet werden.Das Lysat 21.000 mal g 20 Minuten lang beschallen und zentrifugieren. Nach der Lysatzentrifugation das Lysat durch einen 0,45 Mikrometer Porenspritzenfilter in eine Flasche filtern und mit den Nickel NTA Perlen vermischen. Bei vier Grad Celsius mit Schütteln für fünf Stunden inkubieren.Danach drehen Sie die Perlen bei 25.000 mal g für drei Minuten. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand in einem 50-Milliliter-Rohr zu speichern, während der Durchfluss durchfließt. Waschen Sie die Perlen mit fünf MilliliterPuffer B, die 20 Millimolar Imidazol enthalten, sechsmal mit dreiminütiger Zentrifuge.Nach der letzten Wäsche die Perlen mit 10 Milliliter Puffer B in eine leere Chromatographiesäule geben und einen Milliliter Puffer B mit 200 Millimolar-Imidazol hinzufügen. Sammeln Sie die Elution durch Schwerkraft in 1,5 Milliliter Mikroröhren, die DTT und EDTA enthalten. Wiederholen Sie den Elutionsvorgang viermal und bündeln Sie die gewünschten eluierten Fraktionen in einem 15-Milliliter-Rohr.Fügen Sie Puffer C hinzu, um den eluierten Komplex dreimal zu verdünnen. Dann die verdünnte Elution auf die vorbereiteten Amyloseperlen in Röhren übertragen und über Nacht bei vier Grad Celsius mit Schütteln bebrüten. Am Morgen zentrieren Sie die Rohre bei 2, 500 mal g für drei Minuten und halten Sie den Überstand in einem 15 Milliliter Rohr als Durchfluss.Waschen Sie die proteingebundenen Perlen mit fünf MilliliterPuffer C fünf- bis sechsmal. Dann fügen Sie 500 Mikroliter Puffer D in den gereinigten His-BAP1/MBP-DEUBAD-Komplex auf den Amylose-Agarose-Perlen hinzu, um eine 50%ige Perlenlösung herzustellen. 20 Mikroliter der 50%perlenlösung in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen und 20 Mikroliter des zweifachen Laemmli-Probenpuffers für die SDS-PAGE- und Coomassie-Blauanalyse hinzufügen.Bewahren Sie die verbleibende Perlenlösung bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung auf. Nach der Kultur der HEK293T-Zellen, Platte 12 Millionen Zellen in 20 Milliliter von kompletten Medien in einem 15 Zentimeter Kulturgericht, einen Tag vor der Transfektion. Nach einem Tag, unter der Zellkulturhaube, aspirieren Medien und Versorgung mit 12 Milliliter serum freie Medien.Transfekte die Zellen mit 21 Mikrogramm pCDNA flat-H2A mit 63 Mikroliter PEI bei einem Milligramm pro Milliliter. Wechseln Sie nach 12 Stunden auf das komplette Medium. Nach der Ernte der Zellen nach dem Manuskript, resuspendieren Sie das Zellpellet in etwa 10 Bände Puffer E enthalten NEM, um Deubiquitinasen zu hemmen und Sie brüten auf Eis für 20 Minuten.Nach der Zentrifugation bei 3.000 mal g für fünf Minuten, entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Chromatinpellet zweimal mit 10 Bändepuffer E und waschen Sie dann zweimal mit Puffer F.Resuspend das Chromatin in fünf Milliliter Puffer F und behandeln Sie das Pellet mit Mikrokokken-Nuklease in der Konzentration von drei Einheiten pro Milliliter für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation einen 40-Mikroliter-Aliquot der Mischung zur Analyse nukleosomaler DNA-Fragmente in ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen.40 Mikroliter Phenol-Chlorform und 20 Mikroliter sechsfachen DNA-Ladepuffer hinzufügen. Wirbel und Drehen bei 18.000 mal g für zwei Minuten. Dann übertragen Sie 15 Mikroliter der wässrigen Phase in einem 2%Agarose-Gel, um die DNA zu laden.Nachdem Die Reaktion und Zentrifugation nach dem Manuskript gestoppt wurde, inkubieren Sie die lösliche Chromatinfraktion mit Anti-Flag-Harzperlen in einem 15-Milliliter-Rohr über Nacht bei vier Grad Celsius mit Schütteln. Waschen Sie die Perlen sechsmal mit Puffer G.Transfer die Perlen mit fünf Milliliter Puffer G in eine leere Chromatographie-Säule. Verdünnen Sie die gebundenen Nukleosomen der Perle mit 260 Mikroliter Puffer G, die 200 Mikrogramm pro Milliliter Flaggenelutionspeptid und ein bis fünf molar Tris bei pH acht enthalten.Elute die Nukleosomen dreimal, eine Stunde im kalten Raum. Um einen Ubiquitinationstest durchzuführen, fügen Sie zunächst ein Mikrogramm der gereinigten Nukleosomen in 40 Mikroliter Puffer H hinzu. Danach fügen Sie einen Enzymlösungsmix mit 250 Nanogramm UBE1, 672 Nanogramm UB und E2 UB konjugierenden Enzymen und einem Mikrogramm BMI1-RING1B E3-Ubiquit-Ligase-Komplex in die Röhre ein. Inkubieren Sie die Reaktion für drei Stunden bei 37 Grad Celsius mit gelegentlichem Schütteln.Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 40 Mikroliter des zweifachen Laemmli-Probenpuffers hinzufügen und die Histon-H2AK119-Ubiquitination durch Western-Blotting analysieren. Zur Durchführung des In-vitro-Deubiquitinations-Assays setzen Sie die gereinigten Nukleosomen in 40 Mikroliter Puffer I und einem Mikrogramm von Bakterien gereinigt His-BAP1/MBP-DEUBAD Perlen. Legen Sie die Röhre in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei Stunden, um die Deubiquitinationsreaktion mit gelegentlichem Schütteln durchzuführen.Dann stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 40 Mikroliter des zweifachen Laemmli Puffer summieren und durch Immunoblotting analysieren. In diesem Experiment zeigt Die Coomassie-Blaufärbung für eine typische Reinigung des GST-BM1-RING1B-Komplexes mit GST-Affinitätsperlen, dass die Bänder bei erwarteten Molengewichten um 45 Kilodalton bzw. 13 Kilodaltonwandern. Ebenso führte die Reinigung des His-BAP1 MBP-DEUBAD-Komplexes zu relativ hohen homogenen Präparaten mit Bändern um 90 Kilodalton bzw. 55 Kilodalton.Auf der anderen Seite besteht die gereinigte nukleosomale Fraktion im Wesentlichen aus einem 147 Basispaarband, das auf das Vorhandensein einer hoch angereicherten mononukleosomalen Fraktion hinweist. Die Coomassie-blaue Färbung von gereinigten Nukleosomen zeigt ein typisches Bandmuster der vier Histon-Untereinheiten mit stoichiometrischen Mengen. Die Ubiquitination des Histon-H2A mit dem BMI1-RING1B-Komplex zeigt eine zeitabhängige Zunahme der ubiquitinierten Form des Proteins, während gleichzeitig die Konzentrationen der nicht modifizierten Form verringert werden.Die Ubiquitinationsreaktion ist insgesamt, da praktisch alle H2A-Proteine in H2A K119ub umgewandelt werden. Auf der anderen Seite wurde Deubiquitination Assay durchgeführt native Nukleosomen. Nach der Inkubation dieser Nukleosomen mit BAP1-DEUBAD wurde eine zeitabhängige Reduktion des H2A K119ub-Signals beobachtet.Der Erfolg von Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen hängt von der Art und Weise ab, wie das Protein gereinigt wird. Wir brauchen einen guten Ertrag, und die Puffernutzung für die Proteinresuspension und -reinigung sollte mit biochemischen Reaktionen kompatibel sein. Wenn diese Ubiquitination und Deubiquitination Assays gut etabliert sind, können wir die Affektoren und Inhibitoren sowie die Auswirkungen von krankheitsassoziierten Genmutationen testen.Diese Methode wurde durch den Beitrag mehrerer Laboratorien etabliert und ist sehr nützlich, um die Mechanismen der Ubiquitination und Deubiquitination zu verstehen. Mehrere Chemikalien sind gefährlich und müssen in der Haube manipuliert werden. Dazu gehören Phenol-Chloroform, Säuren, Basen und Reduktionsmittel.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Forschung

Biochemie

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funktionelle Charakterisierung von RING-Typ E3 Ubiquitin Ligases In Vitro und In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impeddance-Based GPCR Assays

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...