Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

אנו מודים לדיאנה אדז'נו לקבלת סיוע טכני. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים ממדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה של קנדה (2015-2020), הגנום קוויבק (2016-2019) ו הגנום קנדה (2016-2019) כדי E.B.A. E.B.A. הוא מלומד בכיר של כפות דה לה Recherche du קוויבק-סנטרה (FRQ-S). ל-L. M ו-N.S.K. יש מלגת דוקטורט מ-FRQ-S. ה. ב. הייתה מלגת דוקטורט מהמשרד להשכלה גבוהה וממחקר מדעי של תוניסיה וקרן קול.

1. GSH-לטיהור אהדה של GT-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 אוביקוויב לילגאוס קומפלקס
<ol><li>השתמש pGEX6p2rbs-GT-RING1B (1-159 aa)-BMI1 (1-109aa) חיידקים ביטוי לבנות להפוך BL21 (DE3) חיידקים (ראה טבלת חומרים)23. בונה זה מאפשר את הביטוי של מורטין RING1B תחום 1-159 התמזגו BMI1 תחום 1-109 עם תג GT ב pGEX-6P-2 השדרה.</li>
	<li>לבצע תרבות התחל...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+structure+and+function+of+the+deubiquitinases.">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unravelling+of+the+ubiquitin+system.">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li><li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+cell-cycle+control+and+cancer.">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li><li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy.">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Ligases:+Structure,+Function,+and+Regulation.">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li><li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages.">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li><li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code.">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li><li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation.">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li><li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity.">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li><li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense:+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing.">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li><li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation.">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li><li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers.">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li><li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response.">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li><li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast.">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li><li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control.">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li><li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions.">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li><li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter.">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li><li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B.">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li><li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB.">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li><li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1:+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression.">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li><li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas.">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li><li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma,+lung+adenocarcinoma,+meningioma,+and+other+cancers.">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li><li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma.">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li><li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility.">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li><li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma.">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li><li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors.">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li><li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation.">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li><li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma.">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li><li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2++flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation.">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1.">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385 (2018).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAP1/ASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer.">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li><li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O.">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression.">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair.">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li><li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response.">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression.">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li><li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells.">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1.">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li><li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

ישנם מספר יתרונות של יצירת עמידות בפני מבחנה אוביקוויטיות ומוסר דאוביסטי לחלבונים של עניין. מאמר זה יכול לשמש ל: (i) לבסס תנאים אופטימליים ולהגדיר דרישה מינימלית לתגובות אלה, (ii) לקבוע הקבועים אנזימטית וביוכימיים (iii) להגדיר את התפקידים של קופנים או מעכבי שיכולים להשפיע על תגובות אלה, (iv) זיה?...

אוביקווינציה היא אחת השינויים השכיחים ביותר שלאחר ההעברה והיא קריטית עבור מגוון רחב של אורגניזמים כולל שמרים, צמחים ובעלי חוליות. אוביקווינציה מורכבת ההחזקה הקוולנטי של אוביקוויב, 76 שמרו באופן מאוד polypeptide חומצות אמינו, כדי למקד את החלבונים ומתרחשת בשלושה צעדים רציפים מעורבים שלושה אנזימים, כלומר, E1-הפעלה, E2-מעלה מעלה ו E3 ליגאז1, 2,3. השינוי הפוסט-טרנסלייתי הזה ממלא תפקידים מרכזיים בספקטרום רחב של תהליכים ביולוגיים. אכן, E3 ליגסים, אשר לספק את הספציפיות של התגובה, מהווים משפחה גדולה של אנזימים הם האנזימים הנפוצים ביותר של מערכת אוביקוויב4,5,6. השפעות הזרם המורד של אוביקוויטיות בחלבון תלויות באופי השינוי: מונאובינציה, רב-מונאובינציה, ולינארית או מסוpolyubiquitination. לעתים נדירות משויכת השפלה פרוטאספאל, אבל במקום זה שינוי מעורב במדיגדירוג אירועים שונים איתות. Polyubiquitination מערבת את N-מסוף או שאריות ליזין ב-אוביקוויב מולקולה עצמה, ואת גורלו של חלבון polyubiquitinated תלוי שבו שאריות מעורב בשלוחה אוביקוויב שרשרת. זה כבר זמן רב ידוע כי polyubiquitination תיווך על ידי ליזין 48 של אוביקוויב מעורר השפלה פרוטאספאואל. להיפך, polyubiquitination דרך ליזין 63 של אוביקוויבאין קשורה לעתים קרובות עם הפעלת חלבון7,8,9. בדומה שינויים חשובים אחרים לאחר שלאחר ההעברה, אוביקווינציה היא הפיכה ו אוביקוויב הסרת חלבונים מובטחת על ידי פרוטסים ספציפיים כינה דאוביטיות (DUBs), אשר התפתחה כרגולטורים חשובים של תהליכים סלולריים מיכל השני , 10. חשוב, dubs רבים מאוד מתמחה, ו לווסת, באמצעות דאוביציה, מצעים ספציפיים, המציין כי איזון עדין בין אוביקווינציה ו דאוביציה הוא קריטי לתפקוד החלבון. E3s ו DUBs, יחד עם מכונות השפלה פרוטאסדום וגורמי עזר, טופס אוביקוויב פרוטאסאט מערכת (UPS, עם > 1200 גנים) אשר מווסת מסלולים איתות העיקריים, כמה מהם משויכים צמיחת התאים והתפשטות, קביעת גורל התא, בידול, תא הגירה, ומוות תאים. חשוב מכך, רגולציה של מספר אותות מפלים מעורבים אוביקווינציה מקדמת טומגנזה ומחלות נוירוניוון5,11,12,13, . ארבע עשרה
אוביקווינציה ממלאת תפקידים בביולוגיה כרומטין ותהליכים תלויי-DNA15,16,17. למשל, מונביוביטיות של היסטון H2A על ליזין 119 (להלן H2A K119ub) הוא שינוי קריטי שלאחר ההמרה מעורב הדיכוי הטרנססקריפט ותיקון DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub הוא מזרז על ידי מתחם מורכב של פוליקומב דכ1 (PRC1), אשר ממלאת תפקיד מרכזי בתחזוקת מידע אפיגנטי והוא שימור מאוד מ דרוזוהילה לאדם. PRC1 קאנוני הוא היווה בעיקר על ידי RING1B ו BMI1, אשר הם הליבה E3 אוביקוויב ליגאז מורכבים אחראי על האירוע הנ ל אוביקווינציה22,23. ב דרוזוהילה, H2A מונבינציה (H2A K118ub המקבילה H2A K119ub ב מחאלינים) הפוכה על ידי ה-דאב קליפסו, אשר מקיים אינטראקציה עם מסרק סקס נוסף (asx) היוצרים את קומפלקס הפוליקומב הדכאני (PR-דאב)24. משתיק היונקים של קליפסו, BAP1, הוא מדכא הגידול נמחק או מופעל ב ממאירות שונים של בני אדם25,26,27,28, בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33. BAP1 מסדיר את התהליכים התלויים ב-DNA בגרעין ובסידן-איתות-בתיווך ואפופטוזיס ב-הרשת האנדופלזמית33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 מרכיב מערכות מרובות חלבון משנה המכילה ומווסתים שעתוק בעיקר ASXL1, ASXL2 ו ASXL3 (asxls), שלושה orthologues של asxls38,43. Asxls להשתמש במתאם דוסי ביקווינואז (דאובאד) דומיין, גם נקרא תחום asxls, כדי לעורר BAP1 דאב פעילות35,36,44. מכאן, ASXLs לשחק תפקידים חשובים בתיאום פעילות BAP1 דאב ב כרומטין ובאופן כללי יותר פונקציית מדכא הגידול שלה.
מספר שיטות קיימות כדי ללמוד אוביקווינציה ותהליכי דאובינציה. בעיקר, ביוכימיים אומר שימוש בחלבונים מטוהרים מחיידקים להישאר חזק מאוד להפגין אוביקווינציה ישירה של, או הסרת אוביקוויב מ, מצעים ספציפיים. ניתן לערוך ניסויים אלה כדי לחקור מגוון של פרמטרים כגון קביעת הדרישה של מתחמים מינימליים, קביעת מכלול התגובות הקינטיקה, הגדרת יחסי מבנה/תפקוד, והבנת ההשפעה של פתולוגי . מוטציות גנים כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כדי לבצע אוביקווינציה ותגובות דאוטיות על מצעים כרומטין עם רכיבים מטוהרים. כמערכת מודל, בתוך מבחנה אוביקווינציה ו דאוביטיות של החלבון H2A של נוקלאוטיזומיום מוצג. חיידקים מטוהרים חלבונים התאספו במערכות מינימליות של RING1B/BMI1 ו BAP1/דאובאד משמשים עבור אוביקווינציה או דאוביטינציה של נוקלאוטיל H2A, בהתאמה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי, שמנגן תפקידים חשובים במסלולי איתות שונים, והוא מעורב בעיקר בתיאום תפקוד כרומטין ותהליכים הקשורים ל-DNA. שינוי זה כולל פעולה רציפה של אנזימים מספר כולל E1 אוביקוויב-הפעלה, E2 אוביקוויב-מעלה-מעלה ו-E3 אוביקוויב-ligase והוא הפוך על ידי דאוביטיות (DUBs). אוביקווינציה גורמת השפלה של חלבונים או שינוי של פונקציית החלבון כולל אפנון של פעילות אנזימטית, חלבון-חלבון אינטראקציה ולוקליזציה subcellular. צעד קריטי להפגין אוביקוויטיות חלבון או דאובינציה היא לבצע תגובות מחוץ לחומרים עם רכיבים מטוהרים. התגובות אוביקוויטיות יעיל והתגובה הדו יכול להיות מושפע מאוד על ידי רכיבים שונים המשמשים, האנזים שיתוף גורמים, מאגר תנאים, ואת האופי של המצע.  כאן, אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד לניהול אוביקווינציה ותגובות דאוטיות. אנו ממחישים את התגובות הללו באמצעות רכיבים מינימליים של מתחם העכבר polycomb סרק מורכב 1 (PRC1), BMI1, ו RING1B, E3 אוביקוויב ליגאז לפני שהוא H2A על ליזין 119. דאוביטיות של נוקלאוטיז H2A מבוצע באמצעות מורכבות מינימלית של הפולימסרק (PR-דאב) המורכב על ידי האדם deubiquitinase BAP1 והמתאם הדו (דאובאד) התחום של הגורם המשותף שלה ASXL2. ניתן לנהל את הרקומביננטי האלה בהקשר של מישהו משני הצדדים בחלבונים מטוהרים בחיידקים או בנוקלאוזומים מקומיים מטוהרים מתאי מיונקים. אנו מדגישים את המורכבויות שיכולה להשפיע באופן משמעותי על תגובות אלה ואנו מציעים כי העקרונות הכלליים של הפרוטוקולים הללו יכולים להתאים במהירות ל-E3 אחרים ולליקוויטיות.

GT-BMI1 וחלבונים RING1B מיוצרים היטב בחיידקים ניתן לחלץ בקלות בשבר מסיסים. איור 1A מראה כתמים כחולים coomassie עבור טיהור אופייני של מתחם GT-BMI1-RING1B. GT-BMI1 ו RING1B הלהקות להגר במשקל מולקולרי צפוי, ~ 45 kDa ו ~ 13 kDa בהתאמה. בעיקר מורכבות E3 ליגאז הוא הומוגנית מאוד עם רמות נמוכות מא?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי המשחק תפקידים חשובים בתהליכים סלולריים והוא מתואם באופן הדוק על ידי דאובינציה. פגמים בשתי התופעות מתחת לפתווגיות אנושיות. אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע התגובה אוביקווינציה ותגובת דאוביטיות באמצעות רכיבים מטוהרים.

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

בהתחשב במורכבות של התגובות בכל מקום ו deubiquitination בתוך התאים חשוב להקים במבחנה assays עם רכיבים מטוהרים מוגדרים. זה עוזר להבין את המנגנונים של בכל מקום ודוביקינציה וגם לקבוע כיצד מוטציות הקשורות לגנים המקודדים את האנזימים האחראים לתגובה זו יכולות לגרום למחלות אנושיות. אנו יכולים לזהות את התחומים ואת המוטיבים ברכיבים אלה המניעים תגובות אלה.אנחנו יכולים גם לפתח מסיונות מסך תפוקה גבוהה שניתן להשתמש בהם כדי לסנן עבור מעכבי מולקולה קטנה שניתן לפתח כטיפולים פוטנציאליים. כדי להתחיל תזה חיידקים, להוסיף קוקטייל PMSF ו antiprotease לתוך חיץ תרסיס קר קרח A.Add 25 מיליליטר של מאגר תזה A לתוך הבקבוק המכיל גלולת חיידקים ולתלות מחדש את גלולה. מעבירים את ליט המכיל חיידקים בצינור עבור sonication.השתמש sonicator בדיקה כדי sonicate lysate ב 70% משרעת פלט במשך 30 שניות, ארבע עד חמש פעמים. ואז צנטריפוגה ב 21, 000 פעמים g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה של החיידקים lysate עם קדרים GSH במשך חמש שעות על פי כתב היד, להעביר את חרוזים יחד עם 10 מיליליטר של חיץ לתוך עמוד כרומטוגרפיה ריקה.לאחר מכן, להוסיף 1.5 מיליליטר של חיץ A המכיל גלוטתיון 25 מילימולרית לתוך העמוד ולאסוף את האלוטיון על ידי כוח הכבידה לתוך 1.5 microtubes מיליליטר. חזור על הליך האלוטיון ארבע פעמים עם חיץ טרי A המשך טיפול של שברים אלוט על פי כתב היד. כדי להתחיל, תן שימוש חוזר כדורי חיידקים His-BAP1 ו- MBP-DEUBAD ב 25 מיליליטר של חיץ תזה קרה קרח B.Mix 25 מיליליטר של כל ליסאט ודגירה על קרח במשך 15 דקות.Sonicate ולאחר מכן צנטריפוגה lysate ב 21, 000 פעמים גרם במשך 20 דקות. לאחר צנטריפוגה lysate, לסנן את lysate דרך מסנן מזרק נקבובית 0.45 מיקרומטר לתוך בקבוק ומערבבים אותו עם חמוזי ניקל NTA. דגירה בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות במשך חמש שעות.לאחר מכן, לסובב את חרוזים ב 25, 000 פעמים g במשך שלוש דקות. השתמש פיפטה כדי להציל את supernatant בצינור 50 מיליליטר כמו הזרימה דרך. לשטוף את חרוזים עם חמישה מיליליטר של חיץ B, המכיל 20 imidazole מילימולאר, שש פעמים עם שלוש דקות צנטריפוגה.לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את חרוזים עם 10 מיליליטר של חיץ B לתוך עמוד כרומטוגרפיה ריקה ולהוסיף מיליליטר אחד של חיץ B המכיל 200 מילימולרים imidazole. לאסוף את האלוטיון על ידי כוח הכבידה לתוך 1.5 microtubes מיליליטר המכיל DTT ו EDTA. חזור על הליך האלוטיון ארבע פעמים ובריכה שברים אלוט הרצוי לתוך צינור 15 מיליליטר.הוסף מאגר C כדי לדלל את המתחם האלותי שלוש פעמים. לאחר מכן מעבירים את האלוטיון המדולל אל גם בצינורות ומדגרים במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ברעידות. בבוקר, צנטריפוגה הצינורות ב 2, 500 פעמים גרם במשך שלוש דקות ולשמור את supernatant בצינור 15 מיליליטר כמו לזרום דרך.לשטוף את חמוזי חלבון כרוך עם חמישה מיליליטר של חיץ C במשך חמש עד שש פעמים. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מאגר D למתחם המטוהר His-BAP1/MBP-DEUBAD על גם 50%. העבר 20 מיקרוליטרים של פתרון 50%חרוזים לצינור מיקרוצנטריפוגה והוסף 20 מיקרוליטרים של מאגר מדגם לאמלי פעמיים לניתוח SDS-PAGE וכחול קומאסי.אחסן את פתרון חרוזים הנותרים במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לאחר תרבות תאי HEK293T, צלחת 12 מיליון תאים ב 20 מיליליטר של מדיה מלאה בצלחת תרבות 15 ס"מ, יום אחד לפני transfection. אחרי יום אחד, מתחת למכסה המנוע של תרבות התאים, שאף מדיה ואספקה עם 12 מיליליטר של מדיה חופשית בסרום.לתפור את התאים עם 21 מיקרוגרם של pCDNA שטוח-H2A באמצעות 63 microliters של PEI במיליגרם אחד למיליליטר. לאחר 12 שעות, יש לשנות למדיום מלא. לאחר קצירת התאים על פי כתב היד, להשתמש מחדש את גלולת התא בכ -10 כרכים של חיץ E המכיל NEM כדי לעכב deubiquitinases ואתה דגירה על קרח במשך 20 דקות.לאחר צנטריפוגה ב 3, 000 פעמים g במשך חמש דקות, להשליך את העל טבעי. לשטוף את גלולת הכרומטין פעמיים עם 10 כרכים של חיץ E הראשון ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם חיץ F.Resuspend הכרומטין בחמישה מיליליטר של חיץ F ולטפל גלולה עם גרעין מיקרוקוקל בריכוז של שלוש יחידות למיליליטר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, להעביר aliquot 40 microliter של התערובת לצינור 1.5 מיליליטר לניתוח של שברי DNA נוקליוזומלי.הוסף 40 מיקרוליטרים של פנול-כלורופורם ו-20 מיקרוליטרים של מאגר טעינת דנ"א פי שש. מערבולת ולסובב ב 18, 000 פעמים g במשך שתי דקות. לאחר מכן להעביר 15 microliters של השלב הממימי בג'ל 2%agarose לטעון את ה-DNA.לאחר עצירת התגובה והצנטריפוגה על פי כתב היד, הדגירה את שבר הכרומטין המסיס עם קדילי שדון נגד דגל בצינור 15 מיליליטר לילה בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות. לשטוף את חרוזים שש פעמים עם חיץ G.Transfer את חרוזים עם חמישה מיליליטר של חיץ G לתוך עמוד כרומטוגרפיה ריקה. לדלל את הנוקלאוזומים הקשורים של חרוז עם 260 microliters של חיץ G המכיל 200 מיקרוגרם למיליליטר של פפטיד אלוטיון דגל ואחד עד חמישה אחד טוחן Tris ב pH שמונה.תחשוף את הנוקלאוזומים שלוש פעמים, שעה אחת בחדר הקר. כדי לבצע בדיקה בכל מקום, ראשית להוסיף מיקרוגרם אחד של נוקלאוזומים מטוהרים ב 40 microliters של חיץ H.After, להוסיף תערובת פתרון אנזים המכיל 250 ננוגרם של UBE1, 672 ננוגרם של UB ו E2 UB אנזימים באוב ומיקרוגרם אחד של BMI1-RING1B E3 תרכובת רצועות ubiquitin לתוך הצינור. הדגירה את התגובה במשך שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות מדי פעם.לעצור את התגובה על ידי הוספת 40 microliters של שני פעמים Laemmli מדגם Buffer ולנתח histone H2AK119 בכל מקום על ידי כתמים מערביים. כדי לבצע את בדיקת הדאוביקינטיה במבחנה, יש להשתמש מחדש בגרעין המטוהר ב-40 מיקרוליטרים של חיץ I ומיקרוגרם אחד של חיידקים מטוהרים חנוזי His-BAP1/MBP-DEUBAD. מניחים את הצינור באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות כדי לבצע את תגובת deubiquitination עם רעידות מדי פעם.ואז לעצור את התגובה על ידי הוספת 40 microliters של מאגר Laemmli פעמיים לנתח על ידי immunoblotting. בניסוי זה, כתמים כחולים קומאסי לטיהור טיפוסי של תסביך GST-BM1-RING1B באמצעות חסידי זיקה GST, מראה כי הלהקות נודדות במשקל טוחנת צפוי סביב 45 קילודאלטון ו 13 קילודלטון בהתאמה. באופן דומה הטיהור של מתחם MBP-DEUBAD His-BAP1 הביא גם להכנות הומוגניות גבוהות יחסית עם להקות סביב 90 קילודאלטון ו -55 קילודאלטון בהתאמה.מצד שני השבר הגרעיני המטוהר מורכב למעשה על ידי רצועת זוג בסיס 147 המציין את נוכחותו של שבר מונונוקלוזומלי מועשר מאוד. כתמים כחולים קומאסיים של נוקלאוזומים מטוהרים מראים תבנית רצועה טיפוסית של ארבע תת-יוניות היסטון עם כמויות סטואיכומטריות. בכל מקום של histone H2A עם קומפלקס BMI1-RING1B מראה עלייה תלוית זמן של הצורה בכל מקום של החלבון בעוד רמות הטופס ללא שונה הם ירדו בו זמנית.התגובה בכל מקום היא הכוללת כמו כמעט כל החלבונים H2A הופכים H2A K119ub. מצד שני, בדיקה deubiquitination נערך נוקלאוזומים מקומיים. בעקבות הדגירה של נוקלאוזומים אלה עם BAP1-DEUBAD נצפתה הפחתה תלוית זמן של אות H2A K119ub.ההצלחה של תגובות בכל מקום ו deubiquitination תלויים באופן החלבון מטוהרים. אנו זקוקים לתפוקה טובה והשימוש במאגר עבור שימוש חוזר בחלבון וטיהור צריך להיות תואם לתגובות ביוכימיות. כאשר בדיקה זו בכל מקום ו deubiquitination מבוססים היטב אנו יכולים לבדוק את מפעילי ומעכבים להשפיע, כמו גם את ההשפעה של מוטציות גנים הקשורים למחלות.שיטה זו הוקמה על ידי תרומתן של מספר מעבדות והן שימושיות מאוד להבנת המנגנונים של בכל מקום ודוביקינציה. כמה כימיקלים מסוכנים וצריך לתמרן אותם בשכונה. זה כולל פנול-כלורופורם, חומצות, בסיסים, והפחתת סוכנים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

אפיון פונקציונלי של מסוג הטבעת E3 ליגטיות בתוך מבחנה ובפלאנטה

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...