Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
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हम तकनीकी सहायता के लिए डायना Adaoud धन्यवाद. यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (2015-2020), जीनोम क्यूबेक (2016-2019) और जीनोम कनाडा (2016-2019) से ई.बी.ए. ई.बी.ए. के एक वरिष्ठ विद्वान हैं, जो फोंड्स डे ला रीचरेचे डुक्यू-सेंट (एफआरक्यू) के एक वरिष्ठ विद्वान हैं। एल.एम. और एन.एस.के. एच.बी. उच्च शिक्षा मंत्रालय से और ट्यूनीशिया और कोल फाउंडेशन के वैज्ञानिक अनुसंधान से पीएचडी छात्रवृत्ति थी.

1. GSH-agarose आत्मीयता शुद्धि जीएसटी-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubicuitin लिगास परिसर
<ol><li>PGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1-109aa) बैक्टीरिया अभिव्यक्ति का उपयोग BL21 (DE3) बैक्टीरिया को बदलने के लिए निर्माण (सामग्री की तालिकादेखें)23. यह निर्...

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	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. 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ब्याज के प्रोटीन के लिए इन विट्रो सर्वव्यापकता और deubicuitination assays में मजबूत स्थापित करने के कई फायदे हैं. इन परखों का उपयोग करने के लिए किया जा सकता है: (i) इष्टतम परिस्थितियों की स्थापना और इन प्रतिक्रियाओं के ?...

यूबीक्विटीशन सबसे संरक्षित पोस्ट-अनुवाद संशोधनों में से एक है और खमीर, पौधों और कशेरुकियों सहित जीवों की एक विस्तृत विविधता के लिए महत्वपूर्ण है। यूबीक्विटीन में सर्वव्यापक लगाव, एक अत्यधिक संरक्षित 76 एमिनो एसिड पॉलीपेप्टाइड, प्रोटीन को लक्षित करने के लिए होते हैं और तीन अनुक्रमिक चरणों में होते हैं जिनमें तीन एंजाइम शामिल होते हैं, अर्थात, ई1-सक्रियीकरण, E2-कंजुगाटिंग और E3 ligase1, 2,3. इस पोस्ट-अनुवाद संशोधन जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत स्पेक्ट्रम में केंद्रीय भूमिका निभाता है. वास्तव में, E3 ligases, जो प्रतिक्रिया की विशिष्टता प्रदान करते हैं, एंजाइमों का एक बड़ा superfamily का गठन और सर्वव्यापकन प्रणाली4,5,6के सबसे प्रचुर मात्रा में एंजाइमों रहे हैं. प्रोटीन सर्वव्यापकता के डाउनस्ट्रीम प्रभाव संशोधन की प्रकृति पर निर्भर करते हैं: एक-एक-मोनोबिक्विटीशन, और रैखिक या शाखाकृत बहुविक्षिका। Monoubiquitination शायद ही कभी proteasomal गिरावट के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन इसके बजाय इस संशोधन विभिन्न संकेतन घटनाओं मध्यस्थता में शामिल है. बहु-टर्मिनल या सर्वव्यापक अणु में लाइसिन अवशेष शामिल हैं, और एक बहुविक्विटीनाट प्रोटीन की नियति इस बात पर निर्भर करती है कि सर्वव्यापक श्रृंखला विस्तार में अवशेष किस अवशेष को शामिल किया जाता है। यह लंबे समय से ज्ञात किया गया है कि सर्वव्यापकता के लाइसिन 48 द्वारा मध्यस्थता की गई पॉलीयुबिक्विटेशन प्रोटीसोमल अवक्रमण को प्रेरित करती है। इसके विपरीत, यूबिक्विटिन के लाइसिन 63 के माध्यम से बहु-विक्विक्विटीकरण प्रायः प्रोटीन सक्रियण7,8,9के साथ जुड़ा होता है । अन्य महत्वपूर्ण पोस्ट-अनुवाद संशोधनों की तरह, सर्वव्यापकता उत्क्रमणीय है और प्रोटीन से सर्वव्यापकहटाने को विशिष्ट प्रोटीज़ द्वारा सुनिश्चित किया जाता है जिसे डेयूबिक्विटिनेस (डीयूबी) कहा जाता है, जो सेलुलर प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में उभरा है। २ , 10. महत्वपूर्ण बात यह है कि कई डब्बा अत्यधिक विशिष्ट होते हैं, और deubiquitination, विशिष्ट substrates के माध्यम से विनियमित, यह दर्शाता है कि सर्वव्यापकता और deubiquitination के बीच एक अच्छा संतुलन प्रोटीन समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. E3s और DUBs, proteasome गिरावट मशीनरी और सहायक कारकों के साथ, Ubicuitin Proteasome प्रणाली के रूप में (यूपीएस, के साथ gt; 1200 जीन) जो प्रमुख संकेतन रास्ते को नियंत्रित करता है, जिनमें से कई सेल विकास और प्रसार के साथ जुड़े रहे हैं, सेल भाग्य निर्धारण, भेदभाव, सेल प्रवास, और सेल मौत. महत्वपूर्ण बात यह है कि सर्वव्यापकता से जुड़े कई संकेतन झरनाों का विनियमन ट्यूमरीजनन और तंत्रिकाजनन रोगों को बढ़ावा देता है5,11,12,13, 14.
यूबीक्विटीयन क्रोमैटिन जीव विज्ञान और डीएनए पर निर्भर प्रक्रियाओं15,16,17में व्यापक भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, lysine 119 पर histone H2A के monoubicuination (बाद H2A K119ub) एक महत्वपूर्ण पोस्ट-अनुवाद संशोधन ट्रांसक्रिप्शनल दमन और डीएनए की मरम्मत में शामिल है18,19,20, 21,22. H2A K119ub Polycomb दमनकारी परिसर 1 (PRC1) द्वारा उत्प्रेरित है, जो epigenetic जानकारी के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और अत्यधिक Drosophila से मानव के लिए संरक्षित है. विहित PRC1 विशेष रूप से RING1B और BMI1 द्वारा गठित किया गया है, जो कोर E3 सर्वव्यापक लिगेस परिसर के ऊपर उल्लिखित सर्वव्यापकता घटना22,23के लिए जिम्मेदार हैं. Drosophilaमें, H2A monoubiquitination (H2A K118ub जो स्तनधारी में H2A K119ub से मेल खाती है) DUB Calypso द्वारा उलट है, जो अतिरिक्त सेक्स कंघी (ASX) के साथ सूचना का आदान-देना Polycomb-दबाव DUB (पीआर-DUB) परिसर24. कैलिप्सोका स्तनधारी ऑर्थोलॉग , BAP1, एक ट्यूमर निरोधक है जो विभिन्न मानव द्रोहों में नष्ट या निष्क्रिय है25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 केंद्रक और कैल्शियम-संकेतन-मध्यस्थ एपोप्टोसिस में अंत:द्रव्यीय रेटिकुलम33,34,35,36में डीएनए पर निर्भर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 बहु-सबयूनिट प्रोटीन परिसरों जिसमें प्रतिलेखन विनियामक विशेष रूप से ASXL1, ASXL2 और ASXL3 (ASXLs), ASX38,43के तीन ऑर्थोलॉग शामिल हैं . ASXLs का उपयोग करें DEUBiCuitinase ADaptor (DEUBAD) डोमेन, भी कहा जाता है ASXM डोमेन, BAP1 DUB गतिविधि को प्रोत्साहित करने केलिए 35,36,44. इसलिए, ASXLs क्रोमैटिन पर BAP1 DUB गतिविधि समन्वय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और अधिक मोटे तौर पर अपने ट्यूमर suppressor समारोह.
सर्वव्यापकता और विमुक्तीकरण प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कई विधियाँ मौजूद हैं। विशेष रूप से, बैक्टीरिया से शुद्ध प्रोटीन का उपयोग कर जैव रासायनिक assays के प्रत्यक्ष सर्वव्यापकता का प्रदर्शन करने में बहुत शक्तिशाली रहते हैं, या से सर्वव्यापकता को हटाने, विशिष्ट substrates. इन प्रयोगों को न्यूनतम परिसरों की आवश्यकता का निर्धारण, प्रतिक्रियाओं गतिकी का निर्धारण, संरचना/ जीन उत्परिवर्तन. यहाँ, हम शुद्ध घटकों के साथ क्रोमैटिन substrates पर सर्वव्यापकता और deubitination प्रतिक्रियाओं का संचालन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। एक आदर्श प्रणाली के रूप में, इन विट्रो सर्वव्यापकता और न्यूक्लिओसोमल एच 2 ए प्रोटीन का विमुक्तिकरण प्रस्तुत किया जाता है। RING1B/BMI1 और BAP1/DEUBAD के न्यूनतम परिसरों में इकट्ठे बैक्टीरिया-शुद्ध प्रोटीन का उपयोग क्रमशः न्यूक्लिओसोमल एच 2 ए के सर्वव्यापकता या वियूबिक्विटिनेशन के लिए किया जाता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

यूबीक्विटीशन एक पोस्ट-अनुवादीय संशोधन है जो विभिन्न संकेतन पथों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और विशेष रूप से क्रोमैटिन समारोह और डीएनए-संबद्ध प्रक्रियाओं के समन्वय में शामिल है। इस संशोधन में कई एंजाइमों की अनुक्रमिक क्रिया शामिल है, जिनमें E1 सबेक्विटिन-सक्रिय, E2 सबविक्विटीन-कंजुगाऔर और E3 सबबीक्विटिन-लिगाज़ शामिल हैं और इसे डेयूबिक्विटिनेस (डीयूबी) द्वारा उलट दिया गया है। यूबीक्विटीन प्रोटीन की गिरावट या एंजाइमी गतिविधि, प्रोटीन प्रोटीन बातचीत और subcellular स्थानीयकरण के मॉडुलन सहित प्रोटीन समारोह में परिवर्तन लाती है। प्रोटीन सर्वव्यापकता या deubicuitination का प्रदर्शन करने में एक महत्वपूर्ण कदम शुद्ध घटकों के साथ इन विट्रो प्रतिक्रियाओं में प्रदर्शन करने के लिए है। प्रभावी सर्वव्यापकता और deubicuitination प्रतिक्रियाओं बहुत इस्तेमाल किया विभिन्न घटकों से प्रभावित किया जा सकता है, एंजाइम सह कारक, बफर स्थितियों, और सब्सट्रेट की प्रकृति.  यहाँ, हम सर्वव्यापकता और deubicuitination प्रतिक्रियाओं के संचालन के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. हम माउस Polycomb दमनकारी परिसर 1 (PRC1), BMI1, और RING1B, एक E3 ubicuitin ligase कि monoubiquitines histone H2A के न्यूनतम घटकों का उपयोग कर इन प्रतिक्रियाओं वर्णन lysine 119 पर. न्यूक्लिओसोमल एच 2 ए का डियूबिक्विटिनेशन अपने सह-कारक ASXL2 के मानव डेउबिक्विटिनेस BAP1 और DEUBiQuitinase ADaptor (DEUBAD) डोमेन द्वारा गठित एक न्यूनतम पॉलीकॉम्ब दमनकारी Deubiquitinase (पीआर-DUB) परिसर का उपयोग करके किया जाता है। ये सर्वव्यापकता/देवत्व परख या तो पुनः संयोजक न्यूक्लिओसोम के संदर्भ में आयोजित किया जा सकता है जो बैक्टीरिया-शुद्ध प्रोटीन या स्तनधारी कोशिकाओं से शुद्ध देशी न्यूक्लिओसोम के साथ पुनर्गठित होता है। हम जटिलताओं है कि इन प्रतिक्रियाओं पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है पर प्रकाश डाला और हम प्रस्ताव है कि इन प्रोटोकॉल के सामान्य सिद्धांतों को तेजी से अन्य E3 ubicuitin ligases और deubicuitinas के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

GST-BMI1 और RING1B प्रोटीन बैक्टीरिया में अच्छी तरह से उत्पादित कर रहे हैं और घुलनशील अंश में आसानी से निकाला जा सकता है. चित्र 1A GST-BMI1-RING1B परिसर के एक विशिष्ट शुद्धि के लिए एक Coomasie नीले दाग से प?...

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

यूबीक्विटीशन एक पोस्ट-ट्रांस्लेशनल संशोधन है जो सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और डियूबिक्विटिनेशन द्वारा कसकर समन्वित होता है। दोनों प्रतिक्रियाओं में दोष मानव रोगों के तहत. हम शुद्ध घटकों का उपयोग कर इन विट्रो में सर्वव्यापकता और deubicuitination प्रतिक्रिया के संचालन के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

इन विट्रो Ubicuitination और न्यूक्लिओसोमल हिस्टोन्स के Deubiquitination परख

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

स्वचालित ध्वनिक शक्ति निर्धारण assays में पेप्टाइड agonists के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए वितरण

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones साथ nucleosomes का पुनर्गठन

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

मूल विलासितालयों, इन-जेल एसेज़ और इलेक्ट्रोलाउशन के साथ मिटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन के सुपरकॉम्प्लेक्सेस का विश्लेषण करना

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

छोटे पैमाने पर वर्णमिति की परख Intracellular स्तनपान और पाइरूवेट में निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

विट्रो में हाइपोपिग्मेंटेशन गतिविधि का प्रमाणन

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

शारीरिक रूप से सक्रिय Thylakoids के अलगाव और ऊर्जा पर निर्भर प्रोटीन परिवहन परख में उनके उपयोग

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

पेप्टाइड संवर्धन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाना

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

अभिव्यक्ति, शुद्धि, क्रिस्टलीकरण, और फ्जाइम परख के Fumarylacetoaceate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

रिंग-टाइप E3 सर्वव्यापी लिगैसइन विट्रो और प्लांटा में कार्यात्मक लक्षण वर्णन

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

लेबल-फ्री बाधा-आधारित जीपीसीआर अखस में वृद्धि थ्रूपुट के लिए स्टेपवाइज डोजिंग प्रोटोकॉल

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...