Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
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Ringraziamo Diana Adjaoud per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) e Genome Canada (2016-2019) a E.B.A. E.B.A. è uno studioso senior del Fonds de la Recherchetchedu duébec-Santé (FRQ-S). L.M e N.S.K. hanno una borsa di dottorato dal FRQ-S. H.B ha ricevuto una borsa di studio presso il Ministero dell'istruzione superiore e dalla ricerca scientifica della Tunisia e dalla Fondazione Cole.

1. GSH-agarose Affinity Purification del GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase Complex
<ol><li>Utilizzare il costrutto di espressione batterica pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) per trasformare i batteri BL21 (DE3) (vedere Tabella deimateriali)23. Questo costrutto consente l'espressione del dominio murine RING1B 1-159 fuso al dominio BMI1 1-109 con il tag GST nella backbone pGEX-6P-2.</li>
	<li>Eseguire una coltura di avviamento durante la notte inoc...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB.">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li><li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1:+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression.">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li><li>Harbour, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma,+lung+adenocarcinoma,+meningioma,+and+other+cancers.">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li><li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma.">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li><li>Goldstein, A. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma.">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li><li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors.">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li><li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation.">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li><li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma.">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li><li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2++flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation.">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1.">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385 (2018).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAP1/ASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer.">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li><li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O.">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression.">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair.">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li><li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response.">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression.">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li><li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells.">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1.">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li><li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

Ci sono diversi vantaggi di stabilire robusti saggi di ubiquitinazione in vitro e deubiquitinazione per le proteine di interesse. Questi saggi possono essere utilizzati per: (i) stabilire condizioni ottimali e definire requisiti minimi per queste reazioni, (ii) determinare costanti cinetiche e biochimiche enzimatiche, (iii) definire i ruoli dei cofattori o inibitori che possono influenzare queste reazioni, (iv) identificare le interfacce di interazione, (v) testare l'impatto di mutazioni artificiali o associate alla mala...

L'ubiquitinazione è una delle modifiche post-traduzionali più conservate ed è fondamentale per un'ampia varietà di organismi, tra cui lievito, piante e vertebrati. L'ubiquitinazione consiste nell'attaccamento covalente dell'ubiquitina, un polipeptide da 76 amminoacidi altamente conservato, per colpire le proteine e si verifica in tre fasi sequenziali che coinvolgono tre enzimi, vale a dire, l'attivazione di E1, la coniugazione E2 e la ligase1: 2,3. Questa modifica post-traduzionale svolge un ruolo centrale in un ampio spettro di processi biologici. Infatti, i legamenti E3, che forniscono la specificità della reazione, costituiscono una grande superfamiglia di enzimi e sono gli enzimi più abbondanti del sistema di ubiquitina4,5,6. Gli effetti a valle dell'ubiquitinazione proteica dipendono dalla natura della modificazione: monoubiquitinazione, multimonoscanto e poliubiquitinazione lineare o ramificata. La monoubiquitinazione è raramente associata alla degradazione proteasomica, ma questa modifica è coinvolta nella mediazione di vari eventi di segnalazione. La poliubiquitinazione coinvolge i residui di lisina o di lisina nella molecola di ubiquitina stessa, e il destino di una proteina poliubificata dipende da quale residuo è coinvolto nell'estensione della catena di ubiquitina. È noto da tempo che la poliubiquitinazione mediata dalla lisina 48 dell'ubiquitina induce la degradazione proteasomica. Al contrario, la poliubiquitinazione via lisina 63 di ubiquitina è spesso associata all'attivazione della proteina7,8,9. Simile ad altre importanti modifiche post-traduzionali, l'ubiquitinazione è reversibile e la rimozione dell'ubiquitina dalle proteine è garantita da proteasi specifici rivolte deubiquitinase (DUB), che sono emerse come importanti regolatori dei processi cellulari 2 Il nome del sistema , 10. È importante sottolineare che molti DUB sono altamente specializzati e regolano, attraverso la deubiquitinazione, substrati specifici, indicando che un sottile equilibrio tra ubiquitazione e deubiquitinazione è fondamentale per la funzione proteica. Gli E3 e i DUB, insieme ai meccanismi proteasomeri di degradazione e ai fattori accessori, formano il sistema Ubiquitin Proteasome System (UPS, con geni >1200) che regola i principali percorsi di segnalazione, molti dei quali sono associati alla crescita cellulare e alla proliferazione, determinazione del destino cellulare, differenziazione, migrazione cellulare, e la morte delle cellule. È importante sottolineare che la deregolazione di diverse cascate di segnalazione che coinvolgono l'ubiquitazione promuove la tumoralgenesi e le malattie di neurodegenerazione5,11,12,13, 14.
L'ubiquitazione svolge ruoli pervasivi nella biologia della cromatina e nei processi dipendenti dal DNA15,16,17. Per esempio, la monoubiquitinazione dell'istono H2A sulla lisina 119 (qui dopo H2A K119ub) è una modifica fondamentale post-traduzionale coinvolta nella repressione trascrizionale e nella riparazione del DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub è catalizzato dal Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), che svolge un ruolo chiave nel mantenimento delle informazioni epigenetiche ed è altamente conservato dalla Drosophila all'uomo. Canonical PRC1 è costituito in particolare dal RING1B e BMI1, che sono il complesso principale E3 ubiquitin ligase responsabile del suddetto evento di ubiquitinazione22,23. In Drosophila, la monoubiquitinazione H2A (H2A K118ub che corrisponde a H2A K119ub nei mammiferi) è invertita dal DUB Calypso, che interagisce con Additional Sex Comb (ASX) formando il complesso DUB policomb-repressivo (PR-DUB)24. L'ortologo mammifero di calypso, BAP1, è un soppressore tumorale cancellato o inattivato in varie neoplasie umane25,26,27,28, 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33.BAP1 regola i processi dipendenti dal DNA nel nucleo e l'apoptosi mediata dalla segnalazione del calcio al reticolo endoplasmico33,34,35,36, 37 Mi lasa' di , 38 Mi lasa , 39 mila: l'altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 42. BAP1 assembla complessi proteici multi-subunità contenenti regolatori di trascrizione in particolare ASXL1, ASXL2 e ASXL3 (ASXL), tre ortologhi di ASX38,43. Gli ASXL utilizzano il dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), anche chiamato dominio ASXM, per stimolare l'attività BAP1 DUB35,36,44. Quindi, gli ASXL svolgono un ruolo importante nel coordinare l'attività di BAP1 DUB alla cromatina e più in generale la sua funzione di soppressore tumorale.
Esistono diversi metodi per studiare i processi di ubiquitinazione e deubiquitinazione. In particolare, i saggi biochimici che utilizzano proteine purificate dai batteri rimangono molto potenti nel dimostrare l'ubiquitinazione diretta o la rimozione dell'ubiquitina da substrati specifici. Questi esperimenti possono essere condotti per studiare una serie di parametri come la determinazione del requisito di complessi minimi, la determinazione della cinetica delle reazioni, la definizione delle relazioni struttura/funzione e la comprensione dell'impatto mutazioni genetiche. Qui, forniamo protocolli per condurre reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione su substrati di cromatina con componenti purificati. Come sistema modello, viene presentata l'ubiquitinazione in vitro e la deubiquitinazione della proteina H2A nucleosomica. Le proteine purificate dai batteri assemblate in complessi minimi di RING1B/BMI1 e BAP1/DEUBAD vengono utilizzate rispettivamente per l'ubiquitinazione o la deubiquitinazione del nucleosomal H2A.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante in vari percorsi di segnalazione ed è particolarmente coinvolta nel coordinamento della funzione della cromatina e dei processi associati al DNA. Questa modifica comporta un'azione sequenziale di diversi enzimi, tra cui E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjuging e E3 ubiquitin-ligase ed è invertita da deubiquitinaes (DUB). L'ubiquitinazione induce la degradazione delle proteine o l'alterazione della funzione proteica, compresa la modulazione dell'attività enzimatica, l'interazione proteina-proteina e la localizzazione subcellulare. Un passo fondamentale nella dimostrazione dell'ubiquitinazione proteica o della deubiquitinazione è quello di eseguire reazioni in vitro con componenti purificati. Un'efficace ubiquitinazione e reazioni di deubiquitinazione potrebbero essere fortemente influenzate dai diversi componenti utilizzati, dai co-fattori enzimatici, dalle condizioni di buffer e dalla natura del substrato.  Qui, forniamo protocolli passo-passo per condurre reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione. Illustriamo queste reazioni utilizzando componenti minimi del mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, e RING1B, un E3 ubiquitin ligase che monoubiquizza istone H2A sulla lisina 119. La deubiquitinazione del nucleosomal H2A viene eseguita utilizzando un complesso minimo Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) formato dal deubiquitinase BAP1 umano e dal dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) del suo co-fattore ASXL2. Questi saggi di ubiquitinazione/deubiquitinazione possono essere condotti nel contesto di nucleosomi ricombinanti ricostituiti con proteine purificate dai batteri o nucleosomi nativi purificati dalle cellule dei mammiferi. Mettiamo in evidenza la complessità che può avere un impatto significativo su queste reazioni e proponiamo che i principi generali di questi protocolli possano essere rapidamente adattati ad altri legamenti e deubiquitinasi E3.

Le proteine GST-BMI1 e RING1B sono ben prodotte nei batteri e possono essere facilmente estratte nella frazione solubile. La figura 1A mostra una colorazione blu Coomassie per una tipica purificazione del complesso GST-BMI1-RING1B. Le bande GST-BMI1 e RING1B migrano al peso molecolare previsto, rispettivamente 45 kDa e 13 kDa. In particolare il complesso della ligia E3 è altamente omogeneo con livelli molto bassi di contaminanti proteici batterici e/o prodot...

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l'ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Data la complessità delle reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione all'interno delle cellule è importante stabilire saggi in vitro con componenti purificati definiti. Questo aiuta a comprendere i meccanismi di ubiquitinazione e deubiquitinazione e anche a determinare come le mutazioni associate ai geni che codificano gli enzimi responsabili di questa reazione possono causare malattie umane. Possiamo identificare i domini e i motivi in questi componenti che guidano queste reazioni.Possiamo anche sviluppare test dello schermo ad alta produttività che possono essere utilizzati per lo schermo per inibitori di piccole molecole che possono essere sviluppati come potenziali terapie. Per iniziare la lisi batterica, aggiungere PMSF e cocktail antiproteasi nel tampone di lisi ghiacciata A.Aggiungere 25 millilter del tampone di lisi A nella bottiglia contenente pellet batterico e rimescolare il pellet. Trasferire il lisato contenente batteri in un tubo per la sonicazione.Utilizzare un sonicatore a sonda per sonicare il lisato con un'ampiezza di uscita del 70% per 30 secondi, da quattro a cinque volte. Quindi centrifugare a 21.000 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver incubato il batterio lisciviato con perline GSH per cinque ore secondo il manoscritto, trasferire le perline insieme a 10 millilter di tampone in una colonna cromatografica vuota.Quindi, aggiungere 1,5 millilter di tampone A contenente 25 glutatione millimolare nella colonna e raccogliere l'eluizione per gravità in microtubi da 1,5 millilitri. Ripetere la procedura di eluizione quattro volte con tampone fresco A un trattamento continuo delle frazioni eluizzate secondo il manoscritto. Per iniziare, rimescolare il pellet batterico His-BAP1 e MBP-DEUBAD in 25 millilter di tampone di lisi ghiacciata B.Mescolare 25 millilter di ogni lisato e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.Sonicare e poi centrifugare il lisato a 21.000 volte g per 20 minuti. Dopo la centrifugazione del lysate, filtrare il lysate attraverso un filtro siringa a poro da 0,45 micrometri in una bottiglia e mescolarlo con le perline Nickel NTA. Incubare a quattro gradi Celsius tremando per cinque ore.Dopodi tempo, gira giù per le perline a 25.000 volte g per tre minuti. Utilizzare una pipetta per salvare il supernatante in un tubo da 50 millilitri man mano che il flusso scorre. Lavare le perline con cinque millilter di tampone B, contenenti 20 imidazolo millimolare, sei volte con centrifuga di tre minuti.Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perline con 10 millilter di tampone B in una colonna cromatografica vuota e aggiungere un millilitro di tampone B contenente 200 millimolare imidazolo. Raccogliere l'eluizione per gravità in microtubi da 1,5 millilitri contenenti DTT ed EDTA. Ripetere la procedura di eluizione quattro volte e mettere in comune le frazioni eluizzate desiderate in un tubo da 15 millilitri.Aggiungere il buffer C per diluire il complesso eluitato tre volte. Quindi trasferire l'eluizione diluita alle perline di amilosio preparate in tubi e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con tremori. Al mattino, centrifuga i tubi a 2.500 volte g per tre minuti e mantieni il supernatante in un tubo da 15 millilitri mentre fluiscono.Lavare le perline legate alla proteina con cinque millilter di tampone C per cinque o sei volte. Aggiungere quindi 500 microlitri di tampone D al complesso Depurato His-BAP1/MBP-DEUBAD sulle perline di agarosio amilosio per creare una soluzione di tallone al 50%. Trasferire 20 microlitri della soluzione di perline al 50% su un tubo di microcentrifugo e aggiungere 20 microlitri di tampone campione Laemmli due volte per l'analisi blu SDS-PAGE e Coomassie.Conservare la soluzione di perline rimanente a meno 80 gradi Celsius per un utilizzo futuro. Dopo aver coltura le cellule HEK293T, placcare 12 milioni di cellule in 20 millilter di mezzi completi in un piatto di coltura di 15 centimetri, un giorno prima della trasfezione. Dopo un giorno, sotto la cappa di coltura cellulare, aspirare i mezzi e fornire 12 millilter di mezzi senza siero.Trasfetto le cellule con 21 microgrammi di pCDNA flat-H2A utilizzando 63 microlitri di PEI a un milligrammo per millilitro. Dopo 12 ore, passare al mezzo completo. Dopo aver raccolto le cellule secondo il manoscritto, rimescolare il pellet cellulare in circa 10 volumi di tampone E contenente NEM per inibire le deubiquitinasi e si incuba sul ghiaccio per 20 minuti.Dopo la centrifugazione a 3.000 volte g per cinque minuti, scartare il supernatante. Lavare il pellet di cromatina due volte con 10 volumi di tampone E prima e poi lavare due volte con tampone F.Resuspend la cromatina in cinque millilter del tampone F e trattare il pellet con nucleasi micrococcica alla concentrazione di tre unità per millilitro per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, trasferire un'aliquota di 40 microlitri della miscela in un tubo da 1,5 millilitri per l'analisi di frammenti di DNA nucleosomico.Aggiungere 40 microlitri di fenolo-cloroformio e 20 microlitri di tampone di carico del DNA sei volte superiore. Vortice e rotazione a 18.000 volte g per due minuti. Quindi trasferire 15 microlitri della fase acquosa in un gel di agarosio al 2% per caricare il DNA.Dopo aver interrotto la reazione e la centrifugazione secondo il manoscritto, incubare la frazione solubile di cromatina con perline di resina anticarro in un tubo da 15 millilitri durante la notte a quattro gradi Celsius con tremori. Lavare le perline sei volte con tampone G.Trasferire le perline con cinque millilter di tampone G in una colonna cromatografica vuota. Diluire i nucleosomi legati del tallone con 260 microlitri di tampone G contenenti 200 microgrammi per millilitro di peptide di eluizione della bandiera e da uno a cinque tris molare a pH otto.Elute i nucleosomi tre volte, un'ora nella stanza fredda. Per eseguire il test di ubiquitinazione, aggiungere prima un microgrammo dei nucleosomi purificati in 40 microlitri di tampone H.Successivamente, aggiungere una miscela di soluzione enzimatica contenente 250 nanogrammi di UBE1, 672 nanogrammi di enzimi coniuganti UB ed E2 UB e un microgrammo di complesso di ubiquitina ligasi BMI1-RING1B E3 nel tubo. Incubare la reazione per tre ore a 37 gradi Celsius con occasionali scosse.Interrompere la reazione aggiungendo 40 microlitri di due volte Laemmli Sample Buffer e analizzare l'ubiquitinazione dell'istono H2AK119 mediante macchia occidentale. Per eseguire il saggio di deubiquitinazione in vitro riprendo i nucleosomi purificati in 40 microlitri del tampone I e un microgrammo di batteri purificavano le perline His-BAP1/MBP-DEUBAD. Posizionare il tubo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre ore per eseguire la reazione di deubiquitinazione con agitazioni occasionali.Quindi interrompere la reazione aggiungendo 40 microlitri di tampone Laemmli due volte e analizzare mediante immunoblotting. In questo esperimento, la colorazione blu coomassie per una tipica purificazione del complesso GST-BM1-RING1B usando perline di affinità GST, mostra che le bande migrano al peso molare previsto rispettivamente intorno a 45 kilodalton e 13 kilodalton. Allo stesso modo, la purificazione del complesso His-BAP1 MBP-DEUBAD ha anche portato a preparazioni omogenee relativamente elevate con bande rispettivamente di circa 90 kilodalton e 55 kilodaltoni.D'altra parte la frazione nucleosomica purificata è essenzialmente composta da una banda di 147 coppie di basi che indica la presenza di frazione mononucleosomiale altamente arricchita. La colorazione blu coomassie dei nucleosomi purificati mostra un tipico modello a banda delle quattro subunità istono con quantità stechiometriche. L'ubiquitinazione dell'istone H2A con il complesso BMI1-RING1B mostra un aumento dipendente dal tempo della forma ubiquitinata della proteina mentre i livelli della forma non modificata sono concomitanti diminuiti.La reazione di ubiquitinazione è totale in quanto praticamente tutte le proteine H2A vengono trasformate in H2A K119ub. D'altra parte, il saggio di deubiquitinazione è stato condotto nucleosomi nativi. Dopo l'incubazione di questi nucleosomi con BAP1-DEUBAD è stata osservata una riduzione dipendente dal tempo del segnale H2A K119ub.Il successo delle reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione dipende dal modo in cui la proteina viene purificata. Abbiamo bisogno di una buona resa e l'uso tampone per la resuspensione e la purificazione delle proteine dovrebbe essere compatibile con le reazioni biochimiche. Quando questi test di ubiquitinazione e deubiquitinazione sono ben consolidati, possiamo testare gli attivatori e gli inibitori dell'effetto delle mutazioni geniche associate alla malattia.Questo metodo è stato stabilito con il contributo di diversi laboratori e sono molto utili per comprendere i meccanismi di ubiquitinazione e deubiquitinazione. Diverse sostanze chimiche sono pericolose e devono essere manipolate nel cofano. Questo include fenolo-cloroformio, acidi, basi e agenti riducenti.

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