Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
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私たちは、技術支援のためにダイアナ・アジャウドに感謝します。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(2015-2020)、ゲノムケベック(2016-2019)、ゲノムカナダ(2016-2019)からE.B.A.E.B.A.への助成金によって支援されました。L.M.とN.S.K.はFRQ-Sから博士号を取得しています。H.Bは、高等教育省とチュニジアの科学研究とコール財団から博士号を取得しました。

1. GSH-アガロース親和性浄化 GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3ユビキチン・リガセ・コンプレックス
<ol><li>pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1-109aa)細菌発現構築物を使用してBL21(DE3)細菌を形質転換する(材料の表を参照)23。この構成により、pGEX-6P-2バックボーンにGSTタグを持つBMI1ドメイン1-109に融合したマウスリング1Bドメイン1-159の発現が可能になります。</li>
	<li>100 μg/mLア...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+structure+and+function+of+the+deubiquitinases.">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unravelling+of+the+ubiquitin+system.">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li><li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+cell-cycle+control+and+cancer.">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li><li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy.">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Ligases:+Structure,+Function,+and+Regulation.">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li><li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages.">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li><li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code.">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li><li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation.">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li><li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity.">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li><li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense:+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing.">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li><li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation.">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li><li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers.">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li><li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response.">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li><li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast.">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li><li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control.">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li><li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions.">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li><li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter.">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li><li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B.">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li><li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB.">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li><li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1:+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression.">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li><li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas.">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li><li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma,+lung+adenocarcinoma,+meningioma,+and+other+cancers.">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li><li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma.">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li><li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility.">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li><li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma.">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li><li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors.">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li><li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation.">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li><li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma.">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li><li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2++flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation.">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1.">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385 (2018).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAP1/ASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer.">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li><li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O.">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression.">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair.">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li><li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response.">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression.">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li><li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells.">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1.">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li><li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

目的のタンパク質に対して、インビトロユビキチン化およびデュビキチン化アッセイを確立することにはいくつかの利点があります。これらのアッセイは、(i)最適な条件を確立し、これらの反応に対する最小限の要件を定義し、(ii)酵素運動および生化学的定数を決定し、(iii)これらの反応に影響を与える可能性のある補因子または阻害剤の役割を定義する、(iv)相互作用インタフェースを同定...

ユビキチン化は、翻訳後の最も保存された修飾の1つであり、酵母、植物、脊椎動物を含む多種多様な生物にとって重要です。ユビキチンは、高度に保存された76アミノ酸ポリペプチドであるユビキチンの共生結合から成り、タンパク質を標的とし、3つの酵素、すなわち、E1活性化、E2-共役およびE3リゲス1を含む3つの順次ステップで起こる。 2,3.この翻訳後の改変は、生物学的プロセスの広いスペクトルで中心的な役割を果たしています。実際、反応の特異性を提供するE3リチウムは、酵素の大きなスーパーファミリーを構成し、ユビキチン系4、5、6の最も豊富な酵素である。タンパク質ユビキチン化の下流効果は、単一ユビキチン化、多単一ビキチン化、線形または分岐ポリユビキチン化の性質に依存する。モノウビキチン化はプロテアソーム分解と関連することはほとんどないが、代わりにこの修飾は様々なシグナルイベントの媒次に関与する。ポリウビキチン化は、ユビキチン分子自体のN末端またはリジン残基を含み、ポリユビキチン化タンパク質の運命は、ユビキチン鎖拡張に関与する残基に依存する。ユビキチンのリジン48によって媒介されるポリウビキチン化がプロテアソーム分解を誘導することを長い間知られている。反対に、ユビキチンのリジン63を介したポリウビキチン化は、しばしばタンパク質活性化7、8、9と関連している。他の重要な翻訳後修飾と同様に、ユビキチンは可逆的であり、タンパク質からのユビキチン除去は、細胞プロセスの重要な調節剤として出現したドゥビキチナーゼ(DUB)と呼ばれる特定のプロテアーゼによって保証される。2,10.重要なことに、多くのDUBは高度に専門化されており、また、デュビキチン化を通じて、特定の基質を調節し、タンパク質機能に対するユビキチン化とデュビキチン化の微妙なバランスが重要であることを示す。E3とDUBは、プロテアソーム分解機構およびアクセサリ因子と共に、主要なシグナル伝達経路を調節するユビキチンプロテアソームシステム(UPS、>1200遺伝子)を形成し、そのうちのいくつかは細胞増殖および増殖に関連する。細胞の運命の決定、分化、細胞移動、および細胞死。重要なことに、ユビキチン化を伴ういくつかのシグナル伝達カスケードの規制緩和は、腫瘍形成および神経変性疾患5、11、12、13を促進する。14.
ユビキチン化は、クロマチン生物学およびDNA依存プロセス15、16、17において広範な役割を果たす。例えば、リジン119上のヒストンH2Aの単一化化(以下、H2A K119ub)は、転写抑圧およびDNA修復18、19、20に関与する重要な翻訳後修飾である。 21、22。H2A K119ubは、エピジェネティック情報の維持に重要な役割を果たし、ショウジョウバエからヒトへの高度に保存されているポリコム抑圧複合体1(PRC1)によって触媒される。正規PRC1は、特に、上記のユビキチン化イベント22、23を担うコアE3ユビキチンリゲス複合体であるリング1BおよびBMI1によって構成される。ショウジョウバエでは、H2Aモノビキチン化(哺乳類のH2A K119ubに相当するH2A K118ub)は、ポリコム抑圧DUB(PR-DUB)複合体24を形成する追加のセックスコーム(ASX)と相互作用するDUBカリプソによって逆転される。カリプソの哺乳類のオルソログ、BAP1は、様々なヒト悪性腫瘍25、26、27、28、および様々なヒト悪性腫瘍において削除または不活性化された腫瘍抑制剤である。 29歳,30歳,31歳,32歳,33.BAP1は、小プラズム網膜33、34、35、36、核およびカルシウムシグナル伝達媒介アポトーシスにおけるDNA依存的プロセスを調節する。37歳,38歳,39歳,40歳,41歳,42.BAP1は、特にASXL1、ASXL2およびASXL3(ASXLs)、ASX38、43の3つのオルソログを含むマルチサブユニットタンパク質複合体を組み立てる。AsxLsは、DEUビクチネーゼアダプター(DEUBAD)ドメインを使用し、ASXMドメインとも呼び、BAP1 DUB活性35、36、44を刺激する。したがって、APLはクロマチンにおけるBAP1 DUB活性を調整する上で重要な役割を果たし、より広範に腫瘍抑制機能を果たす。
ユビキチン化およびデュビキチン化プロセスを研究するいくつかの方法が存在します。.特に、細菌から精製されたタンパク質を用いて生化学的アッセイは、特定の基質からのユビキチンの直接ユビキチン化または除去を実証する上で非常に強力なままである。これらの実験は、最小限の複合体の要件の決定、反応運動学の決定、構造/機能関係の定義、病理学的影響の理解などのパラメータの範囲を調査するために行うことができます。遺伝子の突然変異。ここでは、精製成分を用いてクロマチン基質に対してユビキチン化およびデュービキチン化反応を行うプロトコルを提供する。モデルシステムとして、ヌクレオソームH2Aタンパク質のインビトロユビキチン化およびデュビキチン化が提示される。RING1B/BMI1およびBAP1/DEUBADの最小限の複合体で組み立てられた細菌精製タンパク質は、それぞれヌクレオソームH2Aのユビキチン化またはデュビキチン化に使用されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

ユビキチン化は、様々なシグナル伝達経路において重要な役割を果たし、クロマチン機能とDNA関連プロセスの調整に特に関与する翻訳後修飾である。この修飾は、E1ユビキチン活性化、E2ユビキチン結合およびE3ユビキチン-リガゼを含むいくつかの酵素の逐次作用を伴い、デュビキチナーゼ(DUB)によって逆転される。ユビキチン化は、酵素活性の変調、タンパク質とタンパク質の相互作用および細胞下局在化を含むタンパク質機能の分解またはタンパク質機能の変化を誘発する。タンパク質ユビキチン化またはデュビキチン化を実証する上で重要なステップは、精製された成分を用いてインビトロ反応を行うことです。有効なユビキチン化およびデュビキチン化反応は、使用される異なる成分、酵素共因子、緩衝条件、および基板の性質によって大きく影響を受ける可能性があります。 ここでは、ユビキチン化およびデュビキチン化反応を行うためのステップバイステップのプロトコルを提供する。これらの反応は、マウスポリコム抑圧複合体1(PRC1)、BMI1、およびRING1B、リジン119上のヒストンH2Aを単一ユビキチン化するE3ユビキチンリゲスを用いて示す。ヌクレオソームH2Aのデュビキチン化は、ヒトデュビキチネーゼBAP1およびDEUBiquitinaseeAAptor(DEUBAD)ドメインの共因子ASXL2によって形成された最小限のポリコム抑圧デュビキチネーゼ(PR-DUB)複合体を用いて行われる。これらのユビキチン化/デュビキチン化アッセイは、細菌精製タンパク質または哺乳動物細胞から精製された天然核ソームで再構成された組換えヌクレオソームのいずれかの文脈で行うことができる。我々は、これらの反応に重大な影響を及ぼす可能性のある複雑さを強調し、これらのプロトコルの一般的な原理が他のE3ユビキチンリガスおよびデュビキチナーゼに迅速に適応できることを提案する。

GST-BMI1およびRING1Bタンパク質は細菌でよく産生され、可溶性画分で容易に抽出することができる。図1Aは、GST-BMI1-RING1B複合体の典型的な精製のためのクマシーブルー染色を示す。GST-BMI1およびRING1Bバンドは、それぞれ予想分子量、~45 kDaおよび~13 kDaで移動します。特にE3リゲス複合体は、細菌タンパク質汚染物質および/または分解産物の非常に低?...

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

ユビキチン化および細胞内のデュビキチン化反応の複雑さを考えると、定義された精製成分を用いたインビトロアッセイを確立することが重要である。これは、ユビキチン化およびデュビキチン化のメカニズムを理解し、また、この反応を担う酵素をコードする遺伝子に関連する突然変異がヒト疾患を引き起こす方法を決定するのに役立ちます。これらの反応を促進するこれらの成分のドメインとモチーフを特定することができます。また、潜在的な治療薬として開発できる低分子阻害剤のスクリーニングに使用できる高スループットスクリーンアッセイを開発することもできます。細菌のリシスを開始するには、氷冷リシスバッファーAにPMSFと抗プロテアーゼカクテルを追加します。超音波処理のためにチューブ内の細菌を含むライセートを転送します。プローブ超音波処理器を使用して、30秒、4〜5回、70%出力振幅でlysateを超音波処理します。その後、摂氏4度で20分間21,000倍gで遠心分離機。原稿に従って5時間GSHビーズで菌溶解物をインキュベートした後、10ミリルターのバッファーとともにビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移します。次に、25ミリモルグルタチオンを含む緩衝液Aの1.5ミリルターをカラムに加え、重力による溶出を1.5ミリリットルマイクロチューブに集める。新鮮な緩衝液Aを用いて、その溶出手順を原稿に従って溶出した分画の継続処理を4回繰り返す。まず、氷冷ライシスバッファーB.Mix 25ミリルターの氷冷ライシスバッファーB.Mix 25ミリルターでHis-BAP1とMBP-DEUBAD細菌ペレットを再中断し、氷の上で15分間インキュベートします。ソニッケートし、20分間21,000回gでリセートを遠心分離します。遠心分離を取り付けた後、0.45マイクロメートルの細孔注射器フィルターを通してリセートをボトルにフィルターし、ニッケルNTAビーズと混ぜます。5時間揺れで摂氏4度でインキュベートします。その後、ビーズを25,000回gで3分間回転させます。ピペットを使用して、流れとして50ミリリットルのチューブに上清を保存します。20ミリモルイミダゾールを含むバッファーBの5ミリルターでビーズを洗浄し、3分間の遠心分離機で6回。最後の洗浄後、10ミリルターのバッファーBを含むビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移し、200ミリモルイミダゾールを含む緩衝液Bの1ミリリットルを加える。DTTおよびEDTAを含む1.5ミリリットルマイクロチューブに重力による溶出を収集する。溶出手順を4回繰り返し、所望の溶出した分画を15ミリリットルのチューブにプールします。緩衝液Cを加え、溶出した複合体を3回希釈する。その後、希釈した溶出液をチューブ内の準備されたアミロースビーズに移し、振盪で摂氏4度で一晩インキュベートします。午前中、チューブを2、500回gで3分間遠心し、流れとして15ミリリットルチューブに上清を保ちます。5ミリルターのバッファーCでタンパク質結合ビーズを5〜6回洗浄します。次に、精製されたHis-BAP1/MBP-DEUBAD複合体に500マイクロリットルのバッファーDをアミロースアガロースビーズに加え、50%ビーズ溶液を作ります。50%ビーズ溶液の20マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに移し、SDS-PAGEおよびクマシーブルー分析のために2倍のレムリサンプルバッファーの20マイクロリットルを加えます。将来の使用のためにマイナス80°Cで残りのビーズ溶液を保管してください。HEK293T細胞を培養した後、トランスフェクションの1日前の15センチメートル培養皿で完全培地20ミリルターに1200万個の細胞をプレートする。1日後、細胞培養フードの下で、吸気培地を12ミリルターの無血清培地で供給する。1ミリリットル当たり1ミリグラムで63マイクロリットルのPEIを使用して、21マイクログラムのpCDNAフラットH2Aで細胞をトランスフェクトする。12時間後、培地を完了するように変更します。原稿に従って細胞を収穫した後、NEMを含む約10体積の緩衝E中の細胞ペレットを再懸濁して、デュビキチナーゼを阻害し、氷上で20分間インキュベートする。3,000回gで5分間遠心分離した後、上清を捨てる。クロマチンペレットを10容量のバッファーEで2回洗浄し、次にバッファーFで2回洗浄し、クロマチンをバッファーFの5ミリルターで再懸濁し、マイクロコッカスヌクレアーゼでペレットを1ミリリットル当たり3単位の濃度で室温で10分間処理します。インキュベーション後、ヌクレオソームDNA断片を分析するために、混合物の40マイクロリットルのアリコートを1.5ミリリットルチューブに移す。40マイクロリットルのフェノールクロロホルムと20マイクロリットルの6倍のDNAローディングバッファーを加えます。渦と2分間18,000回gで回転する。次に、2%アガロースゲルで水相の15マイクロリットルを転写し、DNAをロードする。原稿による反応と遠心分離を停止した後、可溶クロマチン分率を15ミリリットルチューブに一晩振盪して摂氏4度でインキュベートする。バッファーGでビーズを6回洗い、5ミリルターのバッファーGを持つビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移します。ビーズ結合型ヌクレオソームを、フラグ溶出ペプチドの1ミリリットル当たり200マイクログラム、pH 8で1~5モルトリスを含む260マイクロリットルの緩衝Gで希釈します。冷たい部屋で3回、1時間のヌクレオソームをエルクする。ユビキチン化アッセイを行うために、まず精製されたヌクレオソームのマイクログラムを40マイクロリットルのバッファーHに追加し、その後、UBE1の250ナノグラム、UBおよびE2 UB結合酵素の672ナノグラムおよびBMI1-RING1B E3ユビキチンリガー複合体の1マイクログラムを含む酵素溶液ミックスを加える。時折揺れで摂氏37度で3時間反応をインキュベートします。2回のLaemmliサンプルバッファーの40マイクロリットルを加えることによって反応を停止し、ウェスタンブロッティングによるヒストンH2AK119ユビキチン化を分析します。インビトロ・デュビキチン化アッセイを行うために、精製されたヌクレオソームを40マイクロリットルのバッファーIおよび1マイクログラムの細菌で再懸濁し、His-BAP1/MBP-DEUBADビーズを精製した。チューブを摂氏37度のインキュベーターに3時間置き、時折揺れでデュービキチン化反応を行います。次に、2回のレムリバッファーの40マイクロリットルを加えて反応を停止し、免疫ブロッティングにより分析します。この実験では、GST-BM1-RING1B複合体の典型的な精製のためのクマシーブルー染色は、GSTアフィニティービーズを使用して、バンドがそれぞれ約45キロダルトンと13キロダルトンの周りに予想モル重量で移動することを示しています。同様に、His-BAP1 MBP-DEUBAD複合体の精製は、それぞれ約90キロダルトンと55キロダルトンのバンドを有する比較的高い均質製剤をもたらした。一方、精製されたヌクレオソーム画分は、本質的には、高濃縮単核体画分の存在を示す147塩基対バンドによって構成される。精製されたヌクレオソームのクマシーブルー染色は、量論量を有する4つのヒストンサブユニットの典型的なバンドパターンを示す。BMI1-RING1B複合体を有するヒストンH2Aのユビキチン化は、非修飾形態のレベルが付随的に減少している間にタンパク質のユビキチン化形態の時間依存性の増加を示す。ユビキチン化反応は、事実上すべてのH2Aタンパク質がH2A K119ubに変換されるため、合計です。一方、デュビキチン化アッセイは、天然核組を実施した。これらのヌクレオソームをBAP1-DEUBADでインキュベートした後、H2A K119ubシグナルの時間依存的な減少が観察された。ユビキチン化およびデュビキチン化反応の成功は、タンパク質の精製方法によって異なります。我々は良好な収量を必要とし、タンパク質の再懸濁および精製のための緩衝剤の使用は生化学的反応と互換性があるべきである。このユビキチン化およびデュービキチン化アッセイが十分に確立されている場合、我々は影響活性化剤および阻害剤ならびに疾患関連遺伝子突然変異の影響をテストすることができる。この方法は、いくつかの実験室の貢献によって確立されており、ユビキチン化およびデュビキチン化のメカニズムを理解するのに非常に有用である。いくつかの化学物質は危険であり、フード内で操作する必要があります。これには、フェノールクロロホルム、酸、塩基、還元剤が含まれる。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

効力決意アッセイにおけるペプチドアゴニストの連続希釈のために調剤自動アコースティック

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

ネイティブ電気泳動、インゲルアッセイおよび電気溶出を用いたミトコンドリア電子輸送鎖のスーパーコンプレックスの解析

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

小規模な比色試金の細胞内乳酸と線虫の線虫のピルビン酸

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

培養色素脱失活動の定量化

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

インビトロとプランタにおけるRING型E3ユビキチンリガーゼの機能特性評価

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

ラベルフリーインピーダンスベースのGPCRアッセイにおけるスループット向上のためのステップワイズドージングプロトコル

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...