Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
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다이애나 아드자우드에게 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (2015-2020), 게놈 퀘벡 (2016-2019) 및 게놈 캐나다 (2016-2019)에서 E.B.A. E.B.B.A.에 대한 보조금에 의해 지원되었다 퐁 드 라 레체 뒤 Québec-Santé의 수석 학자입니다. L.M과 N.S.K.는 FRQ-S에서 박사 학위를 취득했습니다. H.B는 고등 교육부와 튀니지 과학 연구와 콜 재단에서 박사 학위를 받았다.

1. GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 유비퀴틴 리가제 복합체의 GSH-아가로즈 선호도 정화
<ol><li>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159 aa)-BMI1(1-109aa) 박테리아 발현 구조를 사용하여 BL21(DE3) 박테리아를 변형시키는 구조(재료표참조)23. 이러한 컨스트럭트는 pGEX-6P-2 백본에서 GST 태그를 사용하여 BMI1 도메인 1-109에 융합된 뮤린 RING1B 도메인 1-159의 발현을 허용한다.</li>
	<li>100 μg/mL 암피실린 과 5...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

관심 있는 단백질에 대 한 강력한 시험관 내 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 어설션을 확립하는 몇 가지 장점이 있습니다. 이러한 분석에 사용할 수 있습니다: (i) 최적의 조건을 설정 하 고 이러한 반응에 대 한 최소한의 요구 사항을 정의, (ii) 효소 운동 및 생 화학 상수를 결정, (iii) 이러한 반응에 영향을 미칠 수 있는 공동 인자 또는 억제제의 역할을 정의, (iv) 상호 작용 인터페이스를 식별, (v) 인공 ?...

유비퀴틴화는 번역 후 가장 보존된 변형 중 하나이며 효모, 식물 및 척추동물을 포함한 다양한 유기체에 매우 중요합니다. 유비퀴틴은 단백질을 표적으로 하는 76개의 아미노산 폴리펩티드를 고도로 보존한 유비퀴틴의 공유 부착으로 구성되며, 즉 E1-활성화, E2-컨쥬게이팅 및 E3 리가제1과 관련된 3가지 순차적 단계에서 발생합니다. 2,3. 이 번역 후 수정은 생물학적 과정의 넓은 스펙트럼에서 중심 역할을한다. 실제로 반응의 특이성을 제공하는 E3 ligases는 효소의 큰 슈퍼 패밀리를 구성하며 유비퀴틴 시스템 4,5,6의가장 풍부한 효소입니다. 단백질 유비퀴틴화의 하류 효과는 단핵화, 다중 단핵화, 선형 또는 분기된 폴리유퀴틴화와 같은 변형의 특성에 따라 달라집니다. 단핵화는 거의 프로테아소말 분해와 관련이 없지만, 대신이 수정은 다양한 신호 이벤트를 중재하는 데 관여합니다. 폴리비퀴틴화는 유비퀴틴 분자 자체에서 N 말단 또는 리신 잔기와 관련이 있으며, 폴리유비퀴틴 단백질의 운명은 유비퀴틴 사슬 연장에 관여하는 잔류물에 달려 있습니다. 유비퀴틴의 리신(48)에 의해 매개된 폴리유비퀴틴화는 프로테아소탈화를 유도하는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 반대로, 유비퀴틴의 리신(63)을 통한 폴리유비퀴틴화는 종종단백질 활성화 7,8,9와연관된다. 다른 중요한 번역 후 수정과 유사하게, 유비퀴틴은 가역적이며 단백질에서 유비퀴틴 제거는 세포 과정의 중요한 규제 기관으로 부상한 듀비퀴타제(DUBs)라고 불리는 특정 프로테아제에 의해 보장됩니다. 2개 , 10. 중요한 것은, 많은 DUBs는 고도로 전문화되어 있으며, 단백질 기능에 유비퀴틴화와 듀비퀴틴화 사이의 미세한 균형이 중요하다는 것을 나타내는, 듀비퀴틴화를 통해 조절한다. E3s와 DUBs는 프로테아좀 분해 기계 및 액세서리 요인과 함께 유비퀴틴 프로테아좀 시스템(UPS, >1200 유전자)을 형성하여 세포 성장 및 증식과 관련된 주요 신호 전달 경로를 조절합니다. 세포 운명 결정, 분화, 세포 이동 및 세포 사멸. 중요한 것은, 유비퀴틴화를 수반하는 몇몇 신호 폭포의 규제 완화는 종양발생 및 신경 변성 질환을 촉진5,11,12,13, 14.
유비퀴틴화는 염색질 생물학 및 DNA 의존적 과정에 만연한 역할을 한다15,16,17. 예를 들어, 리신 119(이하 H2A K119ub)에 대한 히스톤 H2A의 단일화는 전사 억압 및 DNA 수리에 관여하는 중요한 번역 후 변형(18,19,20, 21,22. H2A K119ub는 후성 유전학 정보의 유지보수에 중요한 역할을하고 매우 인간에 드로 소필라에서 보존 폴리 콤 억압 단지 1 (PRC1)에 의해 촉매된다. 정식 PRC1은 특히 RING1B 및 BMI1에 의해 구성되며, 이는 전술한 유비퀴틴이벤트(22,23)를담당하는 핵심 E3 유비퀴틴 리가제 복합체이다. Drosophila에서,H2A 단핵화 (H2A K118ub 포유류에서 H2A K119ub에 해당) DUB 칼립소에 의해 반전된다, 이는 폴리 콤 억압 DUB (PR-DUB) 복합체를형성하는 추가 섹스 빗 (ASX)와 상호 작용. 칼립소, BAP1의포유류 직교는 다양한 인간 악성 종양에서 삭제 또는 비활성화된 종양억제제(25,26,27,28, 29세 , 30개 , 31세 , 32세 , 33. BAP1은 핵및 칼슘 신호 매개 세포자멸에서 DNA 의존적 과정을 조절하는 33,34,35,36, 37세 , 38세 , 39세 , 40 , 41세 , 42. BAP1은 특히 ASXL1, ASXL2 및 ASXL3 (ASXL), ASX38,43의3 개의 정형 고리를 포함하는 전사 조절기를 포함하는 다중 소단위 단백질 복합체를 조립한다. ASXL은 BAP1 DUB 활동35,36,44를자극하기 위해 ASXM 도메인이라고도 하는 DEUBiquitinase ADaptor(DEUBAD) 도메인을 사용합니다. 그러므로, ASXL는 염색질에 있는 BAP1 DUB 활동을 조정하고 더 넓게 그것의 종양 억제기 기능에 있는 중요한 역할을 합니다.
유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 과정을 연구하기 위한 몇 가지 방법이 존재한다. 특히, 박테리아에서 정제 된 단백질을 사용하여 생화학 분석은 특정 기질에서 유비퀴틴의 직접 유비퀴틴 또는 제거를 입증하는 데 매우 강력합니다. 이러한 실험은 최소 복합체의 요구 사항 결정, 반응 역학 결정, 구조/기능 관계 정의 및 병리학의 영향 이해와 같은 다양한 매개 변수를 조사하기 위해 수행될 수 있습니다. 유전자 돌연변이. 여기에서, 우리는 정제된 분대를 가진 염색질 기판에 유비퀴틴화 및 deubiquitination 반응을 수행하는 프로토콜을 제공합니다. 모델 시스템으로서, 체외 에서 유비퀴틴화 및 핵소체 H2A 단백질의 듀비퀴틴화가 제시된다. RING1B/BMI1 및 BAP1/DEUBAD의 최소 복합체로 조립된 박테리아 정제 단백질은 각각 뉴클레오소좀 H2A의 유비퀴틴화 또는 듀비퀴틴화에 사용됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

유비퀴틴화는 다양한 신호 경로에서 중요한 역할을 하며 염색질 기능 및 DNA 관련 과정의 조정에 특히 관여하는 번역 후 수정입니다. 이 수정은 E1 유비퀴틴 활성화, E2 유비퀴틴-컨쥬게이팅 및 E3 유비퀴틴-리가제 및 듀비퀴틴-리가제를 포함한 여러 효소의 순차적 작용을 수반하며 듀비퀴틴아제(DUBs)에 의해 역전된다. 유비퀴틴화는 효소 활성의 변조, 단백질-단백질 상호 작용 및 세포외 국소화를 포함한 단백질 기능의 저하 또는 단백질 기능의 변경을 유도합니다. 단백질 유비퀴틴화 또는 듀비퀴틴화를 입증하는 중요한 단계는 정제된 성분으로 시험관 내 반응을 수행하는 것입니다. 효과적인 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응은 사용되는 다양한 성분, 효소 보조 인자, 완충조건 및 기질의 성질에 의해 크게 영향을 받을 수 있다.  여기서는 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 마우스 폴리콤 억압 복합체 1(PRC1), BMI1 및 RING1B, 리신 119에 대한 히스톤 H2A를 모노비퀴틴화하는 E3 유비퀴틴 리가제의 최소한의 성분을 사용하여 이러한 반응을 설명한다. 핵소종 H2A의 듀비퀴틴화는 인간 듀비퀴티나제 BAP1 및 그 보조 인자 ASXL2의 DEUBiquitinase ADaptor(DEUBAD) 도메인에 의해 형성된 최소한의 폴리콤 억압적 듀비퀴타제(PR-DUB) 복합체를 사용하여 수행된다. 이러한 유비퀴틴화/듀비퀴틴화 분석은 포유류 세포로부터 정제된 박테리아 정제 단백질 또는 네이티브 뉴클레오좀으로 재구성된 재조합 뉴클레오좀의 맥락에서 수행될 수 있다. 우리는 이 반응에 중요한 영향을 미칠 수 있는 복잡성을 강조하고 우리는 이 프로토콜의 일반적인 원리가 그밖 E3 유비퀴틴 ligases 및 deubiquitinases에 신속하게 적응될 수 있다는 것을 건의합니다.

GST-BMI1 및 RING1B 단백질은 박테리아에서 잘 생성되며 수용성 분획에서 쉽게 추출될 수 있습니다. 도 1A는 GST-BMI1-RING1B 복합체의 전형적인 정제를 위한 쿠마시 블루 염색을 나타낸다. GST-BMI1 및 RING1B 대역은 각각 예상 분자량, ~45 kDa 및 ~13 kDa로 마이그레이션됩니다. 특히 E3 리가제 복합체는 매우 낮은 수준의 박테리아 단백질 오염 물질 및/또는 분해 산물?...

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

세포 내부의 유비퀴티니션 및 비비퀴티니션 반응의 복잡성을 감안할 때 정의된 정제 성분을 사용하여 체외 분석서를 확립하는 것이 중요합니다. 이것은 유비퀴티뉴션과 비비퀴티뉴션의 메커니즘을 이해하고 또한 이 반응에 책임 있는 효소를 인코딩하는 유전자와 관련되었던 돌연변이가 인간 적인 질병을 일으키는 원인이 될 수 있는 방법을 결정하는 것을 돕습니다. 이러한 반응을 유도하는 이러한 구성 요소의 도메인과 모티브를 식별할 수 있습니다.우리는 또한 잠재적인 치료로 개발될 수 있는 작은 분자 억제제를 위해 스크린하기 위하여 이용될 수 있는 높은 처리량 스크린 assays를 개발할 수 있습니다. 박테리아 용액을 시작하려면, 얼음 차가운 용해 버퍼 A.add 25 밀리터리시스 버퍼 A의 25 밀리터를 박테리아 펠릿을 포함하는 병에 넣고 펠릿을 다시 중단하십시오. 초음파 처리를 위해 튜브에 박테리아를 함유 한 용양을 옮김.프로브 초음파 처리기를 사용하여 30초 에서 5배 동안 70%의 출력 진폭으로 용액을 초음파 처리합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 20 분 동안 21, 000 배 g에서 원심 분리기. 원고에 따라 5 시간 동안 GSH 구슬로 박테리아를 배양 한 후, 빈 크로마토그래피 컬럼으로 버퍼의 10 밀리터와 함께 구슬을 전송합니다.그런 다음, 1.5 밀리터리 A의 완충제 A를 첨가하여 25 밀리머 글루타티온을 컬럼에 넣고 중력에 의한 용출을 1.5 밀리리터 마이크로튜브로 수집한다. 용출 절차를 네 번 반복 신선한 버퍼A 원고에 따라 용출 분획의 계속 처리. 시작하려면, 얼음 차가운 용해 버퍼 B.Mix 25 밀리터의 25 밀리터에서 His-BAP1 및 MBP-DEUBAD 박테리아 펠릿을 15 분 동안 얼음에 배양하십시오.20분 동안 21, 000배 g에서 lysate을 원심분리합니다. lysate 원심분리 후, 병에 0.45 마이크로 미터 모공 주사기 필터를 통해 lysate을 필터링하고 니켈 NTA 구슬과 혼합. 섭씨 4도에서 5시간 동안 흔들리면 배양하세요.그 후, 3 분 동안 25, 000 배 g에서 구슬을 회전. 파이펫을 사용하여 50 밀리리터 튜브에 체퍼를 저장합니다. 구슬을 완충 B 5밀리터로 씻어내고, 20밀리머 이미다졸을 함유하고, 3분 원심분리기로 6회 세척합니다.마지막 세척 후, 빈 크로마토그래피 컬럼에 버퍼 B의 10 밀리터트로 구슬을 전송하고 200 밀리머 이미다졸을 포함하는 버퍼 B의 1 밀리리터를 추가합니다. DTT및 EDTA를 포함하는 1.5 밀리리터 마이크로튜브로 중력에 의한 용출을 수집합니다. 용출 절차를 네 번 반복하고 원하는 용출 된 분획을 15 밀리리터 튜브로 풀.버퍼 C를 추가하여 용출된 복잡한 을 세 번 희석시 보입니다. 그런 다음 희석된 용출을 튜브에 준비된 아밀로오스 구슬로 옮기고 밤새 섭씨 4도에서 흔들어 서 배양합니다. 아침에는 튜브를 2, 500배에서 3분간 원심분리하고 15밀리리터 튜브에 체퍼를 유지합니다.5 밀리터리 C의 5밀리터로 단백질 바운드 구슬을 5~6회 세척합니다. 그런 다음 500 마이크로리터의 완충제 D를 아밀로오스 아가로스 비드에 정제된 His-BAP1/MBP-DEUBAD 컴플렉스에 추가하여 50%의 비드 솔루션을 만듭니다. 50% 비드 용액의 마이크로리터 20개를 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 분석을 위해 2회 Laemmli 샘플 버퍼 20마이크로리터를 추가합니다.향후 사용량을 위해 남은 비드 솔루션을 영하 80도에 저장합니다. HEK293T 세포를 배양한 후, 15센티미터 배양 접시에 20밀리터의 1,200만 개의 세포를 배양한 후, 하루 전에 는 트랜스펙트 전에. 하루 후, 세포 배양 후드 에서, 흡인 매체와 세럼 무료 미디어의 12 밀리터공급.밀리리터 당 1 밀리그램에서 PEI의 63 마이크로 리터를 사용하여 pCDNA 플랫-H2A의 21 마이크로그램으로 세포를 트랜스펙트. 12시간 후에 는 중간을 완료하도록 변경합니다. 원고에 따라 세포를 수확한 후, NEM을 함유하는 완충제 E의 약 10부에서 세포 펠릿을 재보중단하고 20분 동안 얼음에 배양한다.원심분리 후 3, 000배 g에서 5분간, 상체를 폐기하십시오. 10권의 완충제 E로 염색체 펠릿을 두 번 세척한 다음 완충F 5밀리터에서 크롬타틴을 두 번 세척하고 실온에서 10분 동안 밀리리터당 3단위의 농도로 소우주 뉴클레아제로 펠릿을 치료한다. 인큐베이션 후, 뉴클레오소피 DNA 단편의 분석을 위해 혼합물의 40 마이크로리터 알리쿼트를 1.5 밀리리터 튜브로 이송한다.페놀 클로로폼 40마이크로리터와 6배의 DNA 적재 버퍼20마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이와 2 분 동안 18, 000 배 g에서 회전. 그런 다음 DNA를 로드하기 위해 2%아가로즈 젤로 수성 상15마이크로리터를 전달합니다.원고에 따른 반응과 원심분리를 중지한 후, 15밀리리터 튜브에서 15밀리리터 튜브에 반플래그 수지 구슬로 수용성 크로마틴 분획을 4°C에서 흔들어 보냅니다. 버퍼 G.버퍼 G.Transfer 5 밀리터링 G로 구슬을 빈 크로마토그래피 컬럼으로 6번 세척합니다. 비드의 바운드 뉴클레오소좀을 260 마이크로리터의 완충G로 희석하여 깃발 용출 펩타이드의 밀리리터당 200 마이크로그램, pH 8에서 1~5개의 어금니 트리를 함유한다.차가운 방에서 한 시간, 세 번 뉴클레오좀을 엘ute. 유비퀴티닝 분석법을 수행하기 위해 먼저 정제뉴클레오종의 마이크로그램 1개를 버퍼 H.After에 추가하여 UBE1 250 나노그램, UB 및 E2 UB의 나노그램 250나노그램을 함유한 효소 용액 믹스를 추가하여 효소를 결합하고 BMI1-RING1B E3 의 마이크로그램을 복합 튜브에 결합하였다. 37도에서 3시간 동안 반응을 배양하여 가끔 씩씩한 흔들림을 가합니다.2회 Laemmli 샘플 버퍼의 40 마이크로리터를 첨가하여 반응을 멈추고 서부 블로팅에 의한 히스톤 H2AK119 유비퀴티네이션을 분석한다. 시험관 내 비비퀴티네이션 분석체를 수행하기 위해 정제된 뉴클레오소이소40 마이크로리터의 완충제 I및 박테리아의 1마이크로그램이 정제된 그의-BAP1/MBP-DEUBAD 구슬을 정제하였다. 튜브를 37°C의 인큐베이터에 놓아 가끔 씩 씩씩하게 흔들리는 비비퀴티니션 반응을 수행합니다.그런 다음 2회 Laemmli 버퍼의 40 마이크로리터를 첨가하여 반응을 멈추고 면역 블로팅에 의해 분석한다. 이 실험에서, GST 선호도 구슬을 사용하여 GST-BM1-RING1B 단지의 전형적인 정화를 위한 쿠마시 블루 염색은 밴드가 각각 약 45킬로달톤과 13킬로달톤의 예상 어금니 무게로 이동하는 것을 보여준다. 마찬가지로 His-BAP1 MBP-DEUBAD 단지의 정화는 각각 90킬로달톤과 55킬로달톤의 밴드로 비교적 높은 균질성 제제를 낳았다.한편, 정제된 뉴클레오소말 분획은 본질적으로 147개의 염기 쌍 대역에 의해 구성되어 고농축 단핵소말 분획의 존재를 나타낸다. 정제된 뉴클레오좀의 쿠마시 블루 염색은 스토이치오메트릭 양을 가진 4개의 히스톤 서브유닛의 전형적인 밴드 패턴을 나타낸다. BMI1-RING1B 복합체를 가진 히스톤 H2A의 유비퀴티뉴션은 비수정 형태의 수준이 수반적으로 감소하는 동안 단백질의 유비쿼터티드 형태의 시간 의존적 증가를 나타낸다.유비퀴티온 반응은 거의 모든 H2A 단백질이 H2A K119ub로 변환됨에 따라 총이다. 한편, 귀비퀴틴화 분석은 토착 뉴클레오좀을 실시했다. BAP1-DEUBAD를 가진 이들 뉴클레오좀의 배큐베이션에 따라 H2A K119ub 신호의 시간 의존적 감소가 관찰되었다.유비퀴틴화 및 비비퀴틴화 반응의 성공은 단백질이 정제되는 방식에 달려 있습니다. 우리는 좋은 수율이 필요하고 단백질 재서스펜션 및 정제를 위한 완충제 사용은 생화학 반응과 호환되어야 합니다. 이 유비퀴티뉴션 및 비비퀴티니션 어약이 잘 확립되면 영향 활성제 및 억제제뿐만 아니라 질병 관련 유전자 돌연변이의 영향을 테스트할 수 있습니다.이 방법은 여러 실험실의 기여에 의해 설립되었으며 유비쿼터티및 비쿼터티니션의 메커니즘을 이해하는 데 매우 유용합니다. 몇몇 화학 물질은 유해하고 후드에서 조작될 필요가 있습니다. 여기에는 페놀 클로로폼, 산, 염기 및 감소제가 포함됩니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

연구

생화학

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

시험관 내 링 타입 E3 유비퀴틴 리가제의 기능적 특성화

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

라벨없는 임피던스 기반 GPCR 분석에서 처리량 증가를위한 단계별 투약 프로토콜

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...