Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

Vi takker Diana Adjaoud for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genova Quebec (2016-2019) og Genova Canada (2016-2019) til E.B.A. E.B.A. er seniorforsker i fonds de la Recherche du Québec-santé (FRQ-S). L. M og N.S.K. har et doktorgradsstipend fra FRQ-S. H. B hadde et doktorgradsstipend fra departementet for høyere utdanning og fra Scientific Research i Tunisia og Cole Foundation.

1. GSH-agarose affinitet rensing av GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin Ligase kompleks
<ol><li>Bruk pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) bakterie uttrykk til å transformere BL21 (DE3)-bakterier (se tabell over materialer)23. Denne konstruksjonen gjør at uttrykket av murine RING1B domene 1-159 smeltet til BMI1 domene 1-109 med GST tag i pGEX-6P-2 ryggrad.</li>
	<li>Utføre en natt starter kultur av vaksinere RIL-bakterier uttrykker GST-RING1B (1-159 AA)-BMI...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+structure+and+function+of+the+deubiquitinases.">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unravelling+of+the+ubiquitin+system.">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li><li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+cell-cycle+control+and+cancer.">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li><li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy.">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Ligases:+Structure,+Function,+and+Regulation.">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li><li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages.">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li><li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code.">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li><li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation.">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li><li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity.">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li><li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense:+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing.">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li><li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation.">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li><li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers.">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li><li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response.">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li><li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast.">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li><li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control.">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li><li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions.">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li><li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter.">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li><li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B.">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li><li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB.">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li><li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1:+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression.">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li><li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas.">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li><li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma,+lung+adenocarcinoma,+meningioma,+and+other+cancers.">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li><li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma.">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li><li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility.">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li><li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma.">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li><li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors.">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li><li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation.">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li><li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma.">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li><li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2++flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation.">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1.">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385 (2018).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAP1/ASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer.">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li><li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O.">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression.">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair.">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li><li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response.">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression.">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li><li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells.">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1.">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li><li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

Det er flere fordeler ved å etablere robuste in vitro ubiqitinering og deubiquitination analyser for proteiner av interesse. Disse analysene kan brukes til å: (i) etablere optimale forhold og definere minimale krav til disse reaksjonene, (II) bestemme enzymatisk kinetisk og biokjemiske konstanter, (III) definere rollene til kofaktorer eller hemmere som kan påvirke disse reaksjonene, (IV) identifisere interaksjon grensesnitt, (v) teste effekten av kunstige eller sykdom-tilknyttede mutasjoner og (vi) etablere analysen f...

Ubiqitinering er en av de mest bevarte post-translational modifikasjoner og er avgjørende for et bredt spekter av organismer, inkludert gjær, planter og virveldyr. Ubiqitinering består av kovalente feste av ubiquitin, en svært bevart 76 aminosyre polypeptid, å målrette proteiner og forekommer i tre sekvensielle trinn som involverer tre enzymer, dvs., E1-aktivering, E2-bøye og E3 ligase1, 2,3. Dette post-translational modifikasjon spiller sentrale roller i et bredt spekter av biologiske prosesser. Faktisk er E3 ligases, som gir spesifisitet av reaksjonen, utgjør en stor overfamilie av enzymer og er de mest tallrike enzymer i ubiquitin system4,5,6. Den nedstrøms effekten av protein ubiqitinering avhenger av innholdet i endringen: monoubiquitination, multi-monoubiquitination, og lineær eller utvidet polyubiquitination. Monoubiquitination er sjelden forbundet med proteasomal degradering, men i stedet denne endringen er involvert i formidling ulike signalnettverk hendelser. Polyubiquitination involverer N-Terminal eller lysin rester i ubiquitin molekyl selv, og skjebnen til en polyubiquitinated protein avhenger av hvilke rester er involvert i ubiquitin kjeden forlengelse. Det har lenge vært kjent at polyubiquitination formidlet av lysin 48 av ubiquitin induserer proteasomal degradering. Tvert imot, polyubiquitination via lysin 63 av ubiquitin er ofte forbundet med protein aktivisering7,8,9. I likhet med andre viktige post-translational modifikasjoner, ubiqitinering er reversibel og ubiquitin fjerning av proteiner er sikret ved spesifikk proteaser betegnes deubiquitinases (DUBs), som har dukket opp som viktige regulatorer av cellulære prosesser 2 andre priser , 10. viktigere, mange DUBs er høyt spesialiserte, og regulerer gjennom deubiquitination, spesifikke underlag, noe som indikerer at en fin balanse mellom ubiqitinering og deubiquitination er kritisk for protein funksjon. E3s og DUBs, sammen med proteasomet ned brytnings maskiner og tilbehørs faktorer, danner Ubiquitin Proteasomet system (UPS, med > 1200 gener) som regulerer store signal veier, hvorav flere er forbundet med cellevekst og spredning, celle skjebne besluttsomhet, differensiering, celle migrasjon, og celle død. Viktigere, dereguleringen av flere signalering kaskader involverer ubiqitinering fremmer tumorigenesis og neurodegeneration sykdommer5,11,12,13, 14i det.
Ubiqitinering spiller gjennomgripende roller i kromatin biologi og DNA-avhengige prosesser15,16,17. For eksempel, monoubiquitination av histone H2A på lysin 119 (heretter H2A K119ub) er en kritisk post-translational modifikasjon involvert i transcriptional undertrykkelse og DNA reparasjon18,19,20, 21,22. H2A K119ub er katalysert av Polycomb undertrykkende Complex 1 (PRC1), som spiller en nøkkelrolle i opprettholdelsen av epigenetic informasjon og er svært bevart fra Drosophila til mennesker. Kanonisk PRC1 er konstituert spesielt av RING1B og BMI1, som er kjernen E3 ubiquitin ligase kompleks ansvarlig for ovennevnte ubiqitinering hendelse22,23. I Drosophila, H2A MONOUBIQUITINATION (H2A K118ub som tilsvarer H2A K119ub i mammalians) er reversert av dub Calypso, som samhandler med ytterligere sex kam (ASX) danner Polycomb-undertrykkende dub (pr-DUB) kompleks24. Pattedyr ortholog av Calypso, BAP1, er en svulst Suppressor slettet eller deaktivert i ulike menneskelige ondartet25,26,27,28, 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33. BAP1 regulerer DNA-avhengige prosesser i kjernen og kalsium-signalering-mediert apoptose på endoplasmatiske retikulum33,34,35,36, 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 42. BAP1 samler multi-delenhet protein komplekser inneholder transkripsjon regulatorer spesielt ASXL1, ASXL2 og ASXL3 (ASXLs), tre orthologues av ASX38,43. ASXLs bruke DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domene, også kalt ASXM domene, for å stimulere BAP1 dub aktivitet35,36,44. Derfor ASXLs spille viktige roller i å koordinere BAP1 DUB aktivitet på kromatin og mer generelt sin tumor Suppressor funksjon.
Det finnes flere metoder for å studere ubiqitinering og deubiquitination prosesser. Biokjemiske analyser som bruker proteiner renset fra bakterier er fortsatt svært kraftige i å demonstrere direkte ubiqitinering av, eller fjerning av ubiquitin fra, spesifikke underlag. Disse eksperimentene kan gjennomføres for å undersøke en rekke parametre som å bestemme kravet om minimale komplekser, bestemme reaksjoner Kinetics, definere struktur/funksjon relasjoner, og forstå virkningen av patologisk genmutasjoner. Her gir vi protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner på kromatin underlag med renset komponenter. Som et modell system, in vitro ubiqitinering og deubiquitination av nucleosomal H2A protein er presentert. Bakterier-renset proteiner montert i minimale komplekser av RING1B/BMI1 og BAP1/DEUBAD brukes for ubiqitinering eller deubiquitination av nucleosomal H2A, henholdsvis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

Ubiqitinering er en post-translational modifikasjon som spiller viktige roller i ulike signalering veier og er spesielt involvert i samordning av kromatin funksjon og DNA-assosiert prosesser. Denne endringen innebærer en sekvensiell handling av flere enzymer inkludert E1 ubiquitin-aktivering, E2 ubiquitin-bøye og E3 ubiquitin-ligase og reverseres av deubiquitinases (DUBs). Ubiqitinering induserer degradering av proteiner eller endring av protein funksjon inkludert modulering av enzymatisk aktivitet, protein-protein interaksjon og subcellulære lokalisering. Et kritisk skritt i å demonstrere protein ubiqitinering eller deubiquitination er å utføre in vitro reaksjoner med renset komponenter. Effektive ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner kan bli sterkt påvirket av de ulike komponentene som brukes, enzym co-faktorer, buffer forhold, og arten av underlaget.  Her gir vi trinn-for-trinn protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner. Vi illustrerer disse reaksjonene ved hjelp av minimale komponenter av musen Polycomb undertrykkende Complex 1 (PRC1), BMI1, og RING1B, en E3 ubiquitin ligase som monoubiquitinates histone H2A på lysin 119. Deubiquitination av nucleosomal H2A utføres ved hjelp av en minimal Polycomb undertrykkende Deubiquitinase (PR-DUB) kompleks dannet av den menneskelige Deubiquitinase BAP1 og DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domenet til co-Factor ASXL2. Disse ubiqitinering/deubiquitination analysene kan gjennomføres i sammenheng med enten rekombinant nucleosomes tilberedt med bakterier-renset proteiner eller innfødte nucleosomes renset fra pattedyrceller. Vi fremhever vanskelighetene som kan ha en betydelig innvirkning på disse reaksjonene, og vi foreslår at de generelle prinsippene for disse protokollene raskt kan tilpasses andre E3-ubiquitin ligases og deubiquitinases.

GST-BMI1 og RING1B proteiner er godt produsert i bakterier og kan lett utvinnes i løselig brøk. Figur 1a viser en Coomassie blå farging for en typisk rensing av gst-BMI1-RING1B-komplekset. GST-BMI1 og RING1B-båndene migrerer ved forventet molekylvekt, ~ 45 kDa og ~ 13 kDa hhv. Spesielt E3 ligase komplekset er svært homogen med svært lave nivåer av bakterier proteiner forurensninger og/eller fornedrelse produkter. Videre er støkiometri av renset komple...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiqitinering er en post-translational modifikasjon som spiller viktige roller i cellulære prosesser og er tett koordinert av deubiquitination. Defekter i begge reaksjonene ligger til grunn menneskelige patologi. Vi tilbyr protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjon in vitro ved hjelp av renset komponenter.

In vitro Ubiqitinering og Deubiquitination analyser av Nucleosomal Histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Gitt kompleksiteten i ubiquitination og deubiquitination reaksjoner inne i cellene er det viktig å etablere in vitro analyser med definerte rensede komponenter. Dette bidrar til å forstå mekanismene for ubiquitination og deubiquitination og også for å bestemme hvordan mutasjoner forbundet med gener som koder enzymene som er ansvarlige for denne reaksjonen, kan forårsake menneskelig sykdom. Vi kan identifisere domenene og motivene i disse komponentene som driver disse reaksjonene.Vi kan også utvikle høy gjennomstrømning skjermanalyser som kan brukes til å screene for små molekylhemmere som kan utvikles som potensielle terapeutiske midler. For å starte bakterier lysis, tilsett PMSF og antiprotease cocktail i iskald lysis buffer A.Legg 25 millilters av lysis buffer A i flasken som inneholder bakterier pellet og resuspend pellet. Overfør lysatet som inneholder bakterier i et rør for sonikering.Bruk en sonde sonicator å sonikere lysatet på 70% utgang amplitude i 30 sekunder, fire til fem ganger. Deretter sentrifuge på 21, 000 ganger g i 20 minutter ved fire grader Celsius. Etter inkubering av bakteriene lysate med GSH perler i fem timer i henhold til manuskriptet, overføre perlene sammen med 10 millilters av buffer til en tom kromatografi kolonne.Deretter legger du til 1,5 millilters buffer A som inneholder 25 millimolar glutation i kolonnen og samle elution av tyngdekraften i 1,5 milliliter mikrorør. Gjenta elution prosedyren fire ganger med fersk buffer A en fortsette behandling av de rømte fraksjonene i henhold til manuskriptet. Til å begynne med, resuspend His-BAP1 og MBP-DEUBAD bakterier pellets i 25 millilters av iskald lysis buffer B.Mix 25 millilters av hver lysate og inkubere på is i 15 minutter.Sonicate og sentrifuger deretter lysatet på 21 000 ganger g i 20 minutter. Etter lysate sentrifugering, filtrerer lysatet gjennom et 0,45 mikrometer poresprøytefilter i en flaske og bland det med Nikkel NTA-perlene. Inkuber ved fire grader Celsius med risting i fem timer.Deretter spinner du ned perlene på 25.000 ganger g i tre minutter. Bruk en pipette til å lagre supernatanten i et 50 milliliter rør som strømmen gjennom. Vask perlene med fem millilters av buffer B, som inneholder 20 millimolar imidazol, seks ganger med tre minutters sentrifuge.Etter siste vask, overfør perlene med 10 millilters buffer B til en tom kromatografikolonne og legg til en milliliter buffer B som inneholder 200 millimolar imidazol. Samle elution ved tyngdekraften i 1,5 milliliter mikrorør som inneholder DTT og EDTA. Gjenta elution prosedyren fire ganger og pool de ønskede eluted fraksjoner i en 15 milliliter tube.Legg til buffer C for å fortynne det eluted komplekset tre ganger. Deretter overfører du den fortynnede elutasjonen til de tilberedte amyloseperlene i rør og inkuberer over natten ved fire grader Celsius med risting. Om morgenen sentrifuger rørene på 2, 500 ganger g i tre minutter og hold supernatanten i et 15 milliliter rør som strømmer gjennom.Vask proteinbundne perler med fem millilters buffer C i fem til seks ganger. Deretter legger du til 500 mikroliter buffer D til det rensede His-BAP1/MBP-DEUBAD-komplekset på amylose agarose perler for å lage en 50% perleløsning. Overfør 20 mikroliter av 50% perleløsning til et mikrocentrifugerør og legg til 20 mikroliter to ganger Laemmli Sample Buffer for SDS-PAGE og Coomassie blå analyse.Oppbevar den gjenværende perleløsningen ved minus 80 grader Celsius for fremtidig bruk. Etter kulturen hek293T celler, plate 12 millioner celler i 20 millilters av komplette medier i en 15 centimeter kultur rett, en dag før transfection. Etter en dag, under cellekulturhetten, aspirerer media og leverer med 12 millilters serumfrie medier.Transfect cellene med 21 mikrogram pCDNA flat-H2A ved hjelp av 63 mikroliter PEI på ett mg per milliliter. Etter 12 timer, bytt til komplett medium. Etter høsting av cellene i henhold til manuskriptet, resuspend cellepellet i ca 10 volumer av buffer E inneholder NEM for å hemme deubiquitinases og du inkubere på is i 20 minutter.Etter sentrifugering ved 3, 000 ganger g i fem minutter, kast supernatanten. Vask kromatinpellet to ganger med 10 buffervolum E først og vask deretter to ganger med buffer F.Resuspend kromatin i fem millilters buffer F og behandle pellet med mikrokokkkjerner ved konsentrasjon av tre enheter per milliliter i 10 minutter ved romtemperatur. Etter inkubasjon, overføre en 40 mikroliter aliquot av blandingen til en 1,5 milliliter rør for analyse av nukleosomale DNA fragmenter.Tilsett 40 mikroliter fenolklorform og 20 mikroliter seks ganger DNA-lastbuffer. Vortex og spinn på 18, 000 ganger g i to minutter. Overfør deretter 15 mikroliter av vandig fase i en 2% agarose gel for å laste DNA.Etter å ha stoppet reaksjonen og sentrifugeringen i henhold til manuskriptet, inkubere den oppløselige kromatinfraksjonen med antiflaggharpiksperler i et 15 milliliter rør over natten ved fire grader Celsius med risting. Vask perlene seks ganger med buffer G.Overfør perlene med fem millilters buffer G inn i en tom kromatografikolonne. Fortynn perlens bundne nukleosomer med 260 mikroliter buffer G som inneholder 200 mikrogram per milliliter flaggutionpeptid og en til fem en molar Tris ved pH åtte.Elute nukleosomer tre ganger, en time i det kalde rommet. For å utføre ubiquitination analyse, først legge til ett mikrogram av rensede nukleosomer i 40 mikroliter buffer H.Etter det, legg til en enzym løsning blanding som inneholder 250 nanogram ube1, 672 nanogram UB og E2 UB konjugating enzymer og ett mikrogram BMI1-RING1B E3 ubiquitin ligase kompleks inn i røret. Inkuber reaksjonen i tre timer ved 37 grader Celsius med sporadisk risting.Stopp reaksjonen ved å legge til 40 mikroliter av to ganger Laemmli Sample Buffer og analysere histone H2AK119 ubiquitination ved vestlig blotting. For å utføre in vitro deubiquitination analysen resuspend renset nukleosomer i 40 mikroliter buffer I og ett mikrogram bakterier renset Hans-BAP1/MBP-DEUBAD perler. Plasser røret i en inkubator ved 37 grader Celsius i tre timer for å utføre deubiquitination reaksjonen med sporadisk risting.Stopp deretter reaksjonen ved å legge til 40 mikroliter av to ganger Laemmli buffer og analysere ved immunoblotting. I dette eksperimentet viser Coomassie blå farging for en typisk rensing av GST-BM1-RING1B-komplekset ved hjelp av GST affinitetperler, at båndene migrerer med forventet molarvekt rundt 45 kilodaltonn og 13 kilodaltonn. På samme måte resulterte rensingen av His-BAP1 MBP-DEUBAD-komplekset også i relativt høye homogene preparater med bånd rundt 90 kilodaltonn og 55 kilodaltonn.På den annen side er den rensede nukleosomale fraksjonen i hovedsak sammensatt av et 147 basisparbånd som indikerer tilstedeværelsen av svært beriket mononukleosomal fraksjon. Coomassie blå farging av rensede nukleosomer viser et typisk bånd mønster av de fire histone subenheter med stoichiometriske mengder. Ubiquitination av histone H2A med BMI1-RING1B-komplekset viser en tidsavhengig økning av proteinets ubiquitinerte form, mens nivåene i den ikke-modifiserte formen samtidig reduseres.Ubiquitination reaksjonen er total som nesten alle H2A proteiner er forvandlet til H2A K119ub. På den annen side ble deubiquitination analyse utført innfødte nukleosomer. Etter inkubasjon av disse nukleosomer med BAP1-DEUBAD ble det observert en tidsavhengig reduksjon av H2A K119ub-signalet.Suksessen til ubiquitination og deubiquitination reaksjoner avhenger av måten proteinet renses. Vi trenger et godt utbytte, og bufferbruken for proteinrefusjon og rensing bør være kompatibel med biokjemiske reaksjoner. Når denne ubiquitination og deubiquitination analyser er godt etablert vi kan teste påvirke aktivatorer og hemmere samt virkningen av sykdomsrelaterte genmutasjoner.Denne metoden er etablert ved bidrag fra flere laboratorier og er svært nyttige for å forstå mekanismene for ubiquitination og deubiquitination. Flere kjemikalier er farlige og må manipuleres i panseret. Dette inkluderer fenol-kloroform, syrer, baser, og redusere midler.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatisert Acoustic Doserings for serie Fortynning av Peptide agonister i Potens Fastsettelse Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Tilberedning av nukleosomer med Forskjellig Isotop-merket Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysere superkomplekser av den mitokondriale elektrontransportkjede med innfødte elektroforese, in-gel-analyser og elektrolysering

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifisering av Hypopigmentation aktivitet i Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologisk aktiv Thylakoids og deres bruk i energi avhengig av Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funksjonell karakterisering av RING-type E3 Ubiquitin Ligases in vitro og i planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Trinnvis Doseringsprotokoll for økt gjennomstrømming i etikettfrie impedansbaserte GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...