Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
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Agradecemos a Diana Adjaoud pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por subvenções do Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia do Canadá (2015-2020), o genoma Quebec (2016-2019) e o genoma do Canadá (2016-2019) para E.B.A. E.B.A. é um estudioso sênior do Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQ-S). A L. M e a N.S.K. têm uma bolsa de doutoramento da FRQ-S. A H. B teve uma bolsa de doutoramento do Ministério do ensino superior e da investigação científica da Tunísia e da Fundação Cole.

1. GSH-agarose afinidade purificação do GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 ubiquitin ligase Complex
<ol><li>Use a construção de expressão de bactérias pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) para transformar bactérias BL21 (DE3) (ver tabela de materiais)23. Esta construção permite a expressão do domínio RING1B murino 1-159 fundido ao domínio BMI1 1-109 com tag de GST no backbone de pGEX-6P-2.</li>
	<li>Realize uma cultura de início noturno inoculando RIL-bac...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+structure+and+function+of+the+deubiquitinases.">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unravelling+of+the+ubiquitin+system.">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li><li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+cell-cycle+control+and+cancer.">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li><li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy.">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Ligases:+Structure,+Function,+and+Regulation.">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li><li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages.">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li><li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code.">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li><li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation.">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li><li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity.">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li><li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense:+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing.">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li><li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation.">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li><li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers.">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li><li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response.">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li><li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast.">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li><li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control.">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li><li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions.">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li><li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter.">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li><li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B.">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li><li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB.">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li><li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1:+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression.">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li><li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas.">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li><li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma,+lung+adenocarcinoma,+meningioma,+and+other+cancers.">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li><li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma.">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li><li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility.">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li><li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma.">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li><li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors.">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li><li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation.">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li><li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma.">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li><li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2++flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation.">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1.">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385 (2018).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAP1/ASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer.">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li><li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O.">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression.">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair.">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li><li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response.">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression.">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li><li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells.">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1.">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li><li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

Existem várias vantagens de estabelecer ensaios de ubiquitinação e deubiquitinação robustos in vitro para proteínas de interesse. Esses ensaios podem ser usados para: (i) estabelecer condições ideais e definir o requisito mínimo para essas reações, (II) determinar as constantes enzimáticas e bioquímicas, (III) definir os papéis de cofatores ou inibidores que podem impactar essas reações, (IV) identificar interfaces de interação, (v) testar o impacto de mutações artificiais ou associadas à doença e (...

A ubiquitinação é uma das modificações pós-translacionais mais conservadas e é fundamental para uma grande variedade de organismos, incluindo leveduras, plantas e vertebrados. A ubiquitinação consiste na fixação covalente da ubiquitina, um polipeptídeo de aminoácido 76 altamente conservado, para direcionar proteínas e ocorre em três etapas sequenciais envolvendo três enzimas, ou seja, E1-ativando, E2-conjugating e E3 ligase1, 2,3. Esta modificação pós-translacional desempenha papéis centrais em um amplo espectro de processos biológicos. De fato, as ligases da E3, que proporcionam a especificidade da reação, constituem uma grande superfamília de enzimas e são as enzimas mais abundantes do sistema de ubiquitina4,5,6. Os efeitos a jusante do ubiquitinação da proteína dependem da natureza da modificação: monoubiquitination, multimonoubiquitination, e polyubiquitination linear ou ramificado. O monoubiquitination é associado raramente com a degradação degradação, mas preferivelmente esta modificação é envolvida em mediar vários eventos de sinalização. A poliubiquitinação envolve o N-terminal ou os resíduos de lisina na própria molécula de ubiquitina, e o destino de uma proteína policuquitinada depende de qual resíduo está envolvido na extensão da cadeia de ubiquitina. Há muito se sabe que a poliubiquitinação mediada pela lisina 48 de ubiquitina induz a degradação degradação. Pelo contrário, a poliubiquitinação via lisina 63 da ubiquitina é frequentemente associada à ativação proteica7,8,9. Semelhante a outras importantes modificações pós-translacionais, a ubiquitinação é reversível e a remoção de ubiquitina de proteínas é assegurada por proteases específicas denominadas deubiquitinases (DUBs), que surgiram como importantes reguladores dos processos celulares 2. º , 10. importante, muitos dubs são altamente especializados, e regulam, através deubiquitinação, substratos específicos, indicando que um equilíbrio fino entre ubiquitinação e deubiquitinação é crítico para a função protéica. E3s e dubs, junto com a maquinaria da degradação do Proteassoma e os fatores acessórios, formam o sistema do Proteassoma de ubiquitin (UPS, com > 1200 genes) que regula as vias de sinalização principais, diversas de que são associadas com o crescimento e a proliferação da pilha, determinação de destino celular, diferenciação, migração celular e morte celular. É importante ressaltar que a desregulação de várias cascatas de sinalização envolvendo a ubiquitinação promove atumorigênese e as doenças neurodegeneradas5,11,12,13, a 14.
A ubiquitinação desempenha papéis penetrantes na biologia da cromatinae nos processos dependentes de DNA15,16,17. Por exemplo, a monoubiquitinação da histona H2A em lisina 119 (doravante H2A K119ub) é uma modificação crítica pós-translacional envolvida na repressão transcricional e no reparo do DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub é catalisada pelo complexo repressivo Polycomb 1 (PRC1), que desempenha um papel fundamental na manutenção da informação epigenética e é altamente conservado da Drosophila para o ser humano. O PRC1 canônico é constituído, notavelmente, pelos RING1B e BMI1, que são o núcleo do complexo de ligase da ubiquitina E3, responsável pelo evento de ubiquitinação22,23. Na Drosophila, a monoubiquitinação H2A (H2A K118ub que corresponde a H2A K119ub em mammalianos) é revertida pelo Dub Calypso, que interage com o adicional sexo Comb (ASX) formando o polycomb-REPRESSIVE Dub (PR-Dub) complexo24. O ortólogo de mamíferos de Calypso, BAP1, é um supressor de tumor suprimido ou inativado em várias malignidadeshumanas 25,26,27,28, 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33. BAP1 regula os processos dependentes de DNA no núcleo e apoptose mediada por sinalização de cálcio no retículo endoplasmático33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 monta complexos proteicos multisubunitários contendo reguladores de transcrição notavelmente ASXL1, ASXL2 e ASXL3 (asxls), três ortologues de ASX38,43. Asxls use o domínio do adaptador deubiquitinase (deubad), também denominado domínio asxm, para estimular BAP1 atividade Dub35,36,44. Assim, ASXLs desempenham papéis importantes na coordenação da atividade BAP1 DUB na cromatina e, mais amplamente, sua função supressor tumoral.
Existem vários métodos para estudar os processos de ubiquitinação e deubiquitinação. Notavelmente, os ensaios bioquímicos usando proteínas purificadas de bactérias permanecem muito poderosos na demonstração de ubiquitinação direta ou remoção de ubiquitina de substratos específicos. Esses experimentos podem ser conduzidos para investigar uma série de parâmetros como determinar a exigência de complexos mínimos, determinar a cinética de reações, definir relações estrutura/função e compreender o impacto da patologia patológica mutações genéticas. Aqui, nós fornecemos protocolos para realizar reações de ubiquitinação e deubiquitinação em substratos de cromatina com componentes purificados. Como um sistema modelo, o ubiquitinação in vitro e o deubiquitination da proteína H2A o são apresentados. As proteínas bactérias-purificadas montadas em complexos mínimos de RING1B/BMI1 e BAP1/DEUBAD são usadas para ubiquitinação ou deubiquitinação de H2A nucleossomal, respectivamente.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em várias vias de sinalização e é notavelmente envolvida na coordenação da função de cromatina e processos associados ao DNA. Esta modificação envolve uma ação seqüencial de diversas enzimas que incluem E1 ubiquitin-ativando, E2 ubiquitina-conjugating e E3 ubiquitina-ligase e é revertida por deubiquitinases (DUBs). A ubiquitinação induz a degradação de proteínas ou alteração da função protéica, incluindo modulação da atividade enzimática, interação proteína-proteína e localização subcelular. Uma etapa crítica em demonstrar a ubiquitinação da proteína ou o deubiquitination é executar in vitro reações com componentes purified. As reações eficazes do ubiquitinação e do deubiquitination podiam extremamente ser impactadas pelos componentes diferentes usados, pelos cofactores da enzima, pelas condições do amortecedor, e pela natureza do substrato.  Aqui, nós fornecemos protocolos passo a passo para a realização de reações de ubiquitinação e deubiquitinação. Nós ilustramos estas reações usando componentes mínimos do rato polycomb repressive complexo 1 (PRC1), BMI1, e RING1B, uma ligase de ubiquitina E3 que monoubiquitinates histona H2A em lisina 119. A deubiquitinação da H2A nucleossomal é realizada por meio de um complexo mínimo de Policomb repressivo Deubiquitinase (PR-DUB) formado pelo deubiquitinase humano BAP1 e pelo domínio do adaptador DEUBiquitinase (DEUBAD) de seu fator ASXL2. Esses ensaios de ubiquitinação/deubiquitinação podem ser conduzidos no contexto de nucleossomas recombinantes reconstituídos com proteínas purificadas por bactérias ou nucleossomas nativos purificados de células de mamíferos. Destacamos as complexidades que podem ter um impacto significativo sobre essas reações e propomos que os princípios gerais desses protocolos possam ser rapidamente adaptados a outras ligases e deubiquitinases de ubiquitina da E3.

As proteínas GST-BMI1 e RING1B são bem produzidas em bactérias e podem ser prontamente extraídas na fração solúvel. A Figura 1a mostra uma coloração azul Coomassie para uma purificação típica do complexo GST-BMI1-RING1B. As bandas GST-BMI1 e RING1B migram para o peso molecular esperado, ~ 45 kDa e ~ 13 kDa, respectivamente. Notavelmente o complexo de ligase E3 é altamente homogêneo, com níveis muito baixos de proteínas de bactérias contaminan...

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em processos celulares e é fortemente coordenada pela deubiquitinação. Os defeitos em ambas as reações fundamentam patologias humanas. Nós fornecemos protocolos para a realização de ubiquitinação e reação de deubiquitinação in vitro usando componentes purificados.

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Dada a complexidade das reações de ubiquização e deubiquitina dentro das células é importante estabelecer ensaios in vitro com componentes purificados definidos. Isso ajuda a entender os mecanismos de ubiquização e desubiquização e também determinar como mutações associadas a genes que codificam as enzimas responsáveis por essa reação podem causar doenças humanas. Podemos identificar os domínios e motivos nesses componentes que impulsionam essas reações.Também podemos desenvolver ensaios de tela de alto rendimento que podem ser usados para testar inibidores de pequenas moléculas que podem ser desenvolvidos como potenciais terapêuticos. Para iniciar a lise bacteriana, adicione o TPM e o coquetel antiprotease no tampão de lise gelada A.Adicione 25 mililitros do tampão de lise A na garrafa contendo pelotas de bactérias e resuspenque a pelota. Transfira o lysato contendo bactérias em um tubo para sônicação.Use um sonicador de sonda para sonicar a amplitude de saída de 70% durante 30 segundos, quatro a cinco vezes. Em seguida, centrífuga a 21.000 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Depois de incubar o lise de bactérias com contas GSH por cinco horas de acordo com o manuscrito, transfira as contas junto com 10 mililhadores de tampão em uma coluna de cromatografia vazia.Em seguida, adicione 1,5 milileiros de tampão A contendo glutationa de 25 mililitros na coluna e colete a elução por gravidade em microtubos de 1,5 mililitro. Repita o procedimento de elução quatro vezes com tampão fresco A um tratamento contínuo das frações elucidadas de acordo com o manuscrito. Para começar, resuspenco as pelotas de bactérias His-BAP1 e MBP-DEUBAD em 25 mililteiros de tampão de lise gelada B.Misture 25 mililteiros de cada lise e incubar no gelo por 15 minutos.Sonicize e depois centrifufique o lise a 21.000 vezes g por 20 minutos. Após a centrifugação de lise, transfiltre o lysato através de um filtro de seringa porosa de 0,45 micrômetro em uma garrafa e misture-o com as contas nickel NTA. Incubar a quatro graus Celsius com agitação por cinco horas.Depois disso, gire as contas a 25.000 vezes g por três minutos. Use uma pipeta para salvar o supernatante em um tubo de 50 mililitros enquanto o fluxo passa. Lave as contas com cinco milileiros de tampão B, contendo 20 milimidazol, seis vezes com centrífuga de três minutos.Após a última lavagem, transfira as contas com 10 mililitros de tampão B em uma coluna de cromatografia vazia e adicione um mililitro de tampão B contendo 200 milimidazol. Colete a elução por gravidade em microtubos de 1,5 mililitro contendo DTT e EDTA. Repita o procedimento de eluição quatro vezes e acumule as frações elucidadas desejadas em um tubo de 15 mililitros.Adicione o tampão C para diluir o complexo elucido três vezes. Em seguida, transfira a elução diluída para as contas de amilolose preparadas em tubos e incubar durante a noite a quatro graus Celsius com agitação. Pela manhã, centrifufique os tubos a 2.500 vezes g por três minutos e mantenha o supernasal em um tubo de 15 mililitros como fluxo através.Lave as contas ligadas à proteína com cinco milileiros de tampão C por cinco a seis vezes. Em seguida, adicione 500 microliters de buffer D ao complexo purificado His-BAP1/MBP-DEUBAD nas contas agarose amilose para fazer uma solução de contas de 50%. Transfira 20 microliters da solução de 50% de contas para um tubo de microcentrifuuga e adicione 20 microliters de duas vezes o Tampão de Amostra de Laemmli para análise azul SDS-PAGE e Coomassie.Armazene a solução de contas restante a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Após a cultura das células HEK293T, placa 12 milhões de células em 20 milímetros de mídia completa em um prato de cultura de 15 centímetros, um dia antes da transfecção. Depois de um dia, sob o capô da cultura celular, aspirar mídia e fornecer com 12 mililitros de mídia livre de soro.Transfeito as células com 21 microgramas de pCDNA flat-H2A usando 63 microliters de PEI a um miligrama por mililitro. Após 12 horas, mude para meio completo. Após a colheita das células de acordo com o manuscrito, resuspenha a pelota celular em cerca de 10 volumes de tampão E contendo NEM para inibir deubiquitinases e incubar no gelo por 20 minutos.Após centrifugação a 3.000 vezes g por cinco minutos, descarte o supernasce. Lave a pelota de cromatina duas vezes com 10 volumes de tampão E primeiro e depois lave duas vezes com tampão F.Resuspende a cromatina em cinco mililteiros de tampão F e trate a pelota com nuclease microcócica na concentração de três unidades por mililitro por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, transfira uma alíquota de 40 microliter da mistura para um tubo de 1,5 mililitro para análise de fragmentos de DNA nucleosômicos.Adicione 40 microliters de fenol-clorofórmio e 20 microliters de seis vezes tampão de carregamento de DNA. Vórtice e gire a 18.000 vezes g por dois minutos. Em seguida, transfira 15 microliters da fase aquosa em um gel de 2% de agarose para carregar o DNA.Depois de parar a reação e a centrifugação de acordo com o manuscrito, incubar a fração de cromatina solúvel com contas de resina anti-bandeira em um tubo de 15 mililitros durante a noite a quatro graus Celsius com agitação. Lave as contas seis vezes com o buffer G.Transfira as contas com cinco mililitros de tampão G em uma coluna de cromatografia vazia. Diluir os nucleossomos ligados da conta com 260 microliters de buffer G contendo 200 microgramas por mililitro de peptídeo de eluição de bandeira e um a cinco tris molares em pH oito.Elute o nucleossomo três vezes, uma hora na sala fria. Para realizar o ensaio de ubiquização, adicione primeiro um micrograma dos nucleosómos purificados em 40 microliters de tampão H.Depois disso, adicione uma mistura de solução enzimática contendo 250 nanogramas de UBE1, 672 nanogramas de enzimas conjugais UB e E2 UBting e um micrograma de BMI1-RING1B E3 ubiquitin ligase no tubo. Incubar a reação por três horas a 37 graus Celsius com agitação ocasional.Pare a reação adicionando 40 microlitadores de duas vezes o Tampão de Amostra de Laemmli e analise a ubiquitina histone H2AK119 por mancha ocidental. Para realizar o ensaio de deubiquitina in vitro, resuspenja os nucleossomos purificados em 40 microliters de tampão I e um micrograma de bactérias purificadas Contas His-BAP1/MBP-DEUBAD. Coloque o tubo em uma incubadora a 37 graus Celsius durante três horas para realizar a reação de deubiquitinação com agitação ocasional.Em seguida, pare a reação adicionando 40 microliters de duas vezes tampão Laemmli e analise por imunoblotação. Neste experimento, a coloração azul coomassie para uma purificação típica do complexo GST-BM1-RING1B usando contas de afinidade GST, mostra que as bandas migram em peso molar esperado em torno de 45 kilodaltons e 13 kilodaltons, respectivamente. Da mesma forma, a purificação do complexo His-BAP1 MBP-DEUBAD também resultou em preparações homogêneas relativamente altas com bandas em torno de 90 kilodaltons e 55 kilodaltons, respectivamente.Por outro lado, a fração nucleossômica purificada é essencialmente composta por uma faixa de par de 147 bases indicando a presença de fração mononucleosômica altamente enriquecida. A coloração azul coomassie de nucleosósmos purificados mostra um padrão típico de banda das quatro subunidades histonas com quantidades estequiométricas. A ubiquiinação da histona H2A com o complexo BMI1-RING1B mostra um aumento temporal dependente da forma ubiquitinada da proteína, enquanto os níveis da forma não modificada são concomitantemente diminuídos.A reação de ubiquização é total, pois praticamente todas as proteínas H2A são transformadas em H2A K119ub. Por outro lado, foi realizado ensaio de deubiquitina. Após a incubação desses nucleosósmos com BAP1-DEUBAD foi observada uma redução temporal dependente do sinal H2A K119ub.O sucesso das reações de ubiquização e deubiquitina dependem da forma como a proteína é purificada. Precisamos de um bom rendimento e o uso de tampão para ressuspensão e purificação de proteínas deve ser compatível com reações bioquímicas. Quando este ensaio de ubiquitina e deubiquitina são bem estabelecidos podemos testar os ativadores e inibidores de afeto, bem como o impacto de mutações genéticas associadas à doença.Este método foi estabelecido pela contribuição de diversos laboratórios e são muito úteis para compreender os mecanismos de ubiquização e desubiquização. Vários produtos químicos são perigosos e precisam ser manipulados no capô. Isso inclui fenol-clorofórmio, ácidos, bases e agentes redutos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Bioquímica

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolamento de fisiologicamente ativo contém e a sua utilização em ensaios de transporte de energia-dependente da proteína

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressão, purificação, cristalização e ensaios enzimáticos de proteínas contendo domínio de Fumarilacetoacetato de hidrolase

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Caracterização funcional do RING-Tipo E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Protocolo de dosagem Stepwise para aumento do throughput em ensaios GPCR baseados em impedance sem rótulos

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...