Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

Мы благодарим Диану Аджауд за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (2015-2020), Genome Квебек (2016-2019) и Genome Canada (2016-2019) Э.Б.Б.А. является старшим научным сотрудником Фонда Речерче дю Квебек-Санте (ФРЗ-С). Л.М. и Н.С.К. имеют докторскую стипендию от ФРЗ-С. Г.Б. получил докторскую стипендию от Министерства высшего образования и научных исследований Туниса и Фонда Коула.

1. GSH-агарозс сродство Очистка GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin Ligase комплекс
<ol><li>Используйте pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 аа) - ИМТ1 (1 -109aa) выражение бактерий построить для преобразования BL21 (DE3) бактерий (см. Таблица материалов)23. Эта конструкция позволяет выражение мины RING1B домена 1-159 сл...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+structure+and+function+of+the+deubiquitinases.">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unravelling+of+the+ubiquitin+system.">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li><li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+cell-cycle+control+and+cancer.">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li><li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy.">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Ligases:+Structure,+Function,+and+Regulation.">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li><li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages.">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li><li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code.">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li><li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation.">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li><li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity.">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li><li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense:+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing.">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li><li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation.">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li><li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers.">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li><li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response.">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li><li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast.">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li><li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control.">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li><li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions.">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li><li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter.">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li><li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B.">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li><li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB.">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li><li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1:+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression.">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li><li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas.">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li><li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma,+lung+adenocarcinoma,+meningioma,+and+other+cancers.">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li><li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma.">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li><li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility.">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li><li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma.">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li><li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors.">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li><li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation.">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li><li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma.">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li><li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2++flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation.">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1.">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385 (2018).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAP1/ASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer.">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li><li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O.">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression.">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair.">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li><li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response.">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression.">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li><li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells.">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1.">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li><li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

Есть несколько преимуществ создания надежных in vitro убиквитинации и дезиквитинации анализы для белков, представляющих интерес. Эти анализы могут быть использованы для: (i) установить оптимальные условия и определить минимальную потребность в этих реакциях, (ii) определить ферментативные...

Увселивание является одним из наиболее сохранимых пост-трансляционных модификаций и имеет решающее значение для широкого круга организмов, включая дрожжи, растения и позвоночных. Убиквитинация состоит из ковалентной привязанности убиквитина, высоко консервированных 76 аминокислот ный полипептид, для целевой белков и происходит в трех последовательных шагов с участием трех ферментов, т.е., E1-активизирующих, E2-конъюгии и E3 лигазы1, 2,3. Эта посттрансляционная модификация играет центральную роль в широком спектре биологических процессов. Действительно, Лигазы E3, которые обеспечивают специфику реакции, представляют собой большое суперсемейство ферментов и являются наиболее распространенными ферментами системы убиквитин4,5,6. Эффекты убиквитина белка в нистечении зависят от характера модификации: монобиквицинация, мультимонобиквитивание, линейная или разветвленная поликубиквициаляция. Монобиквитинация редко ассоциируется с протеасомальной деградацией, но вместо этого эта модификация участвует в посредничестве различных сигнальных событий. Полиубиквитинация включает в себя N-терминал или остатки лизин в самой молекуле убиквитин, и судьба полиубиквитинаированного белка зависит от того, какие остатки участвуют в расширении цепи убиквитин. Давно известно, что полиубиквитинация при посредничестве лизин 48 убиквитин вызывает протеасомальную деградацию. Напротив, полиубиквитинация через лизин 63 убиквитин часто ассоциируется с активацией белка7,8,9. Как и другие важные пост-трансляционные модификации, убиквитинация обратима, а удаление убиквитина из белков обеспечивается специфическими протеазами, называемыми deubiquitinases (DUBs), которые стали важными регуляторами клеточных процессов 2 , 10. Важно, что многие ДУБ являются узкоспециализированными, и регулировать, через deubiquitination, конкретные субстраты, указывая, что тонкий баланс между убиквитинации и деубиквитинации имеет решающее значение для функции белка. E3s и DUBs, наряду с протеаомой деградации машин и вспомогательных факторов, образуют Убиквитин Proteasome системы (UPS, с генами, с йgt;1200 генов), который регулирует основные пути сигнализации, некоторые из которых связаны с ростом клеток и пролиферации, Определение судьбы клетки, дифференциация, миграция клетки, и смерть клетки. Важно отметить, что дерегулирование нескольких сигнальных каскадов, связанных с убиквитинированием способствует опухолевому и нейродегенерационезу5,11,12,13, 14.
Убиквитинация играет всепроникающую роль в биологии хроматина и ДНК-зависимых процессах15,16,17. Например, монобиквицинирование гистона H2A на лизин 119 (далее H2A K119ub) является критической посттрансляционной модификацией, участвующей в транскрипционных репрессиях и репарации ДНК18,19,20, 21,22. H2A K119ub является катализатором Поликомб Репрессивный комплекс 1 (КНР1), который играет ключевую роль в поддержании эпигенетической информации и высоко сохраняется от drosophila к человеку. Канонические КНР1 состоит в частности, ПО RING1B и BMI1, которые являются ядром E3 убиквитин лигаза комплекса, ответственного за вышеупомянутое событие вездесущности22,23. В Drosophila, H2A монобиквицинация (H2A K118ub, который соответствует H2A K119ub у млекопитающих) меняется DUB Calypso, который взаимодействует с дополнительной секс гребень (ASX) формирования Поликомб-репрессивных DUB (PR-DUB) комплекс24. Орфога цимбаты калипсо, BAP1, является супрессор опухоли удалены или инактивированы в различных злокачественных новообразований человека25,26,27,28, 29 , 30 год , 31 год , 32 год , 33. BAP1 регулирует ДНК-зависимые процессы в ядре и кальций-сигналоцитов опосредованного апоптоза в эндоплазмической ретикулум33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 г. , 41 год , 42. BAP1 собирает многодефицитные белковые комплексы, содержащие регуляторы транскрипции, в частности ASXL1, ASXL2 и ASXL3 (ASXLs), три ортологи ASX38,43. ASXLs использовать DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) домен, также называется ДОмен ASXM, чтобы стимулировать BAP1 DUB деятельности35,36,44. Таким образом, ASXLs играют важную роль в координации активности BAP1 DUB при хроматине и в более широком смысле его функции супрессора опухоли.
Существует несколько методов изучения процессов повсеместного и деубиктивизации. Примечательно, что биохимические анализы с использованием белков, очищенных от бактерий, остаются очень мощными в демонстрации прямого убиквитина или удаления убиквитина из конкретных субстратов. Эти эксперименты могут быть проведены для изучения ряда параметров, таких как определение требования минимальных комплексов, определение кинетических реакций, определение структуры / функциональных отношений, а также понимание влияния патологических генных мутаций. Здесь мы предоставляем протоколы для проведения убиквитинации и дезюквитинационных реакций на хроматина субстратах с очищенными компонентами. В качестве модели системы представлена увселивания в пробирке и деубиктивирование нуклеосомального белка H2A. Бактерии очищенные белки, собранные в минимальных комплексах RING1B/BMI1 и BAP1/DEUBAD, используются для убликвитина или деубиктинации нуклеозомального H2A, соответственно.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

Увселицинация является пост-трансляционной модификацией, которая играет важную роль в различных сигнальных путях и особенно участвует в координации функции хроматина и днк-связанных процессов. Эта модификация включает в себя последовательное действие нескольких ферментов, включая E1 убиквитин-активизирующих, E2 убиквитин-конъюгирующие и E3 убиквитин-лигаза и вспять deubiquitinases (DUBs). Убиквитинация индуцирует деградацию белков или изменение белковой функции, включая модуляцию ферментативной активности, белково-белковое взаимодействие и субклеточную локализацию. Важным шагом в демонстрации убиквитина белка или деубиквитинации является выполнение реакций in vitro с очищенными компонентами. Эффективное убиквитивание и дезиквитинационирование реакций может быть в значительной степени влияет на различные компоненты, используемые, фермент ко-факторы, буферные условия, и характер субстрата.  Здесь мы предоставляем пошаговые протоколы для проведения убиквитинации и реакции на деубиквитивание. Мы иллюстрируем эти реакции с помощью минимальных компонентов мыши Polycomb Репрессивный комплекс 1 (КНР1), BMI1, и RING1B, E3 убиквитин лигаза, что моноубиквитинат гистон H2A на лизин 119. Деубицинация нуклеосомного H2A осуществляется с использованием минимального поликомб репрессивного deubiquitinase (PR-DUB) комплекс, образованный человека deubiquitinase BAP1 и DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) домена своего кофактора ASXL2. Эти убиквитинации / deubiquitination анализы могут быть проведены в контексте либо рекомбинантных нуклеосом воссозданы с бактериями очищенных белков или родной нуклеосомы очищены от клеток млекопитающих. Мы выделяем тонкости, которые могут оказать значительное влияние на эти реакции, и предлагаем, чтобы общие принципы этих протоколов могли быть быстро адаптированы к другим убиквитинским лигазам И Дюбиквитиназа.

Белки GST-BMI1 и RING1B хорошо вырабатываются в бактериях и могут быть легко извлечены в растворимых фракциях. На рисунке 1A показано синее окрашивание Coomassie для типичной очистки комплекса GST-BMI1-RING1B. Полосы GST-BMI1 и RING1B мигрируют при ожидаемом молекулярном весе, 4...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Увселивание является посттрансляционной модификацией, которая играет важную роль в сотовых процессах и жестко координируется дезубикиции. Дефекты в обеих реакциях лежат в основе патологий человека. Мы предоставляем протоколы для проведения убликвитинации и реакции деубиктинации в пробирке с использованием очищенных компонентов.

В Vitro Увселицивание и Deubiquitination Анализы Нуклеосомальных Хистонов

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Учитывая сложность реакций убиквитина и деубикитинации внутри клеток, важно установить анализы in vitro с определенными очищенными компонентами. Это помогает понять механизмы убиквитинации и деубикитинации, а также определить, как мутации, связанные с генами, кодируют ферменты, ответственные за эту реакцию, могут вызывать болезни человека. Мы можем определить домены и мотивы в этих компонентах, которые управляют этими реакциями.Мы также можем разработать высокую пропускную способность экрана анализы, которые могут быть использованы для проверки для малых ингибиторов молекулы, которые могут быть разработаны в качестве потенциальных терапевтических средств. Чтобы начатьлиз бактерий, добавить PMSF и антипротеазы коктейль в ледяной лиз буфер A.Add 25 миллилитров лиза буфера в бутылку, содержащую бактерии гранулы и повторно гранулы. Передача ликата, содержащего бактерии в трубку для sonication.Используйте зонд звуковой для sonicate лисировать на 70% выход амплитуды в течение 30 секунд, четыре-пять раз. Затем центрифуга при 21 000 раз г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. После инкубации бактерий лизируют бисером GSH в течение пяти часов в соответствии с рукописью, передать бисер вместе с 10 миллилитров буфера в пустой колонке хроматографии.Затем добавьте в колонку 1,5 миллилтера буфера А, содержащего 25 миллимолярный глутатион, и соберите элюцию под действием силы тяжести в 1,5 миллилитровые микротрубки. Повторите процедуру элюции четыре раза со свежим буфером А продолжить обработку элевации фракций в соответствии с рукописью. Для начала, resuspend Его-BAP1 и MBP-DEUBAD бактерий гранулы в 25 миллилтеров ледяной лиза буфер B.Mix 25 миллилитров каждого лизата и инкубировать на льду в течение 15 минут.Sonicate, а затем центрифуга лисировать на 21000 раз г в течение 20 минут. После центрифугации лизата процфицировать лизат через фильтр шприца 0,45 микрометрового поры в бутылку и смешать его с бисером Nickel NTA. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию с встряхивания в течение пяти часов.После этого, спина вниз бисера на 25000 раз г в течение трех минут. Используйте пипетку, чтобы сохранить супернатант в 50 миллилитров трубки, как поток до конца. Вымойте бисер пятью миллилтерами буфера B, содержащими 20 миллимолярдов имидазола, шесть раз с трехминутной центрифугой.После последней стирки перенесите бисер с 10 миллилтерами буфера B в пустую колонку хроматографии и добавьте один миллилитр буфера B, содержащий 200 миллимолярный имидазол. Соберите элюцию под действием силы тяжести в 1,5 миллилитровые микротрубки, содержащие DTT и EDTA. Повторите процедуру элюции четыре раза и объединить желаемые эластимные фракции в 15 миллилитровую трубку.Добавьте буфер C, чтобы разбавить элайтный комплекс три раза. Затем перенесите разбавленную элюцию в подготовленные бусы амилой в трубках и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию с тряской. Утром центрифуга трубки на 2500 раз г в течение трех минут и держать супернатант в 15 миллилитров трубки, как поток до конца.Вымойте белок связанных бусин с пятью миллилтерами буфера C в течение пяти-шести раз. Затем добавьте 500 микролитров буфера D в очищенный комплекс His-BAP1/MBP-DEUBAD на амилозных агарозных бусинках, чтобы сделать 50%-ный раствор шарика. Перенесите 20 микролитров 50%-бидового раствора в трубку микроцентрифуга и добавьте 20 микролитров в два раза Laemmli Sample Buffer для SDS-PAGE и синего анализа Кумасси.Храните оставшееся решение шарика при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейшего использования. После культуры HEK293T клетки, пластины 12 миллионов клеток в 20 миллилтеров полных средств массовой информации в 15 сантиметров культуры блюдо, за день до трансфекции. После одного дня, под капотом культуры клетки, аспирировать средства массовой информации и поставлять с 12 миллилитров сыворотки свободных средств массовой информации.Трансфект клеток с 21 микрограммов pCDNA плоский-H2A с помощью 63 микролитров PEI на один миллиграмм на миллилитр. Через 12 часов, изменить для завершения среды. После сбора клеток в соответствии с рукописью, повторно использовать клеточные гранулы примерно в 10 томах буфера E, содержащего NEM для ингибирования deubiquitinases и инкубировать на льду в течение 20 минут.После центрифугации при 3000 раз г в течение пяти минут, отбросить супернатант. Вымойте гранулы хроматина дважды с 10 томами буфера E, а затем мыть дважды с буфером F.Resuspend хроматина в пять миллилитров буфера F и лечить гранулы с микрококковой нуклеазы при концентрации трех единиц на миллилитр в течение 10 минут при комнатной температуре. После инкубации перенесите 40 микролитров алицита смеси в 1,5 миллилитровую трубку для анализа нуклеосомных фрагментов ДНК.Добавьте 40 микролитров фенол-хлороформа и 20 микролитров буфера загрузки ДНК в шесть раз. Вихрь и спина на 18000 раз г в течение двух минут. Затем перенесите 15 микролитров акальной фазы в гель 2%agarose для загрузки ДНК.После остановки реакции и центрифугации в соответствии с рукописью, инкубировать растворимые хроматин фракции с анти-флаг смолы бусы в 15 миллилитров трубки ночь на четыре градуса по Цельсию со тряской. Вымойте бисер шесть раз буфером G.Transfer шарики с пятью миллилтерами буфера G в пустую колонку хроматографии. Разбавить связанные нуклеосомы шарика 260 микролитров буфера G, содержащих 200 микрограмм на миллилитр пептида флага elution и от одного до пяти один моляр Tris на рН восемь.Elute нуклеосомы три раза, один час в холодной комнате. Для выполнения анализа убиквитина сначала добавьте один микрограмм очищенных нуклеосом в 40 микролитров буфера H.После этого добавьте в трубку смесь ферментного раствора, содержащую 250 нанограммов UBE1, 672 нанограмма конъюгирования ферментов UB и E2 UB и один микрограмм комплекса ubiquitin ligase BMI1-RING1B E3. Инкубации реакции в течение трех часов при 37 градусов по Цельсию с редкими встряхивания.Остановите реакцию, добавив 40 микролитров в два раза Laemmli Образец буфера и проанализировать гистон H2AK119 убиквитина западной blotting. Для выполнения анализа деубикитинации in vitro проводится повторное распространение очищенных нуклеосом в 40 микролитров буфера I и один микрограмм бактерий, очищенных его-BAP1/MBP-DEUBAD бисером. Поместите трубку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение трех часов, чтобы выполнить реакцию деубикитинации с редким встряхиванием.Затем остановить реакцию, добавив 40 микролитров в два раза Laemmli буфера и анализировать с помощью иммуноблоттинга. В этом эксперименте, Coomassie синий окрашивания для типичной очистки комплекса GST-BM1-RING1B с использованием GST сродство шарики, показывает, что полосы мигрируют при ожидаемом весе моляра около 45 килодалтонов и 13 килодальтонов соответственно. Аналогичным образом очистка комплекса Его-BAP1 MBP-DEUBAD также привела к относительно высоким однородным препаратам с полосами около 90 килодальтонов и 55 килодалтонов соответственно.С другой стороны, очищенная нуклеосомная фракция по существу состоит из 147 базовых парных полос, указывающих на наличие высокообогащенной мононуклеосомной фракции. Coomassie синий окрашивания очищенных нуклеосом показывает типичный шаблон полосы из четырех оттенков подразделений с стоихиометрическими количествами. Убиквитина гистона H2A с комплексом BMI1-RING1B показывает время зависимого увеличения убиквитинированной формы белка, в то время как уровни неизмененной формы сопутствуют снижению.Реакция убиквитина является общей, так как практически все белки H2A преобразуются в H2A K119ub. С другой стороны, анализ деубикитинации проводился родными нуклеосомами. После инкубации этих нуклеосом с BAP1-DEUBAD наблюдалось время зависимого снижения сигнала H2A K119ub.Успех реакций убиквитина и деубикитинации зависит от способа очистки белка. Нам нужен хороший урожай и использование буфера для повторного незаменимия и очистки белка должно быть совместимо с биохимическими реакциями. Когда это убиквитинация и deubiquitination анализы хорошо установлены, мы можем проверить аффект активаторов и ингибиторов, а также влияние заболеваний, связанных с генными мутациями.Этот метод был создан при участии нескольких лабораторий и очень полезен для понимания механизмов убиквитинации и деубикитинации. Несколько химических веществ являются опасными и должны быть манипулировать в капюшоне. К ним относятся фенол-хлороформ, кислоты, основания и уменьшая агенты.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Анализ суперкомплексов транспортной цепи митохондриальных электронов с собственным электрофорезом, в-гель-анализах и электроизлучения

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Изоляция физиологически активных тилакоидов и их использования в энергии зависимых белков транспорт анализов

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Функциональная характеристика РИНГ-типа E3 Ubiquitin Ligases in Vitro и В Планте

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Протокол поэтапного дозирования для увеличения пропускной записи в label-Free Impedance основе GPCR анализы

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...