Name: in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

Vi tackar Diana Adjaoud för teknisk assistans. Detta arbete stöddes av bidrag från naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) och genom Canada (2016-2019) till E.B.A. E.B.A. är en senior lärd i fonds de la Recherche du Québec-santé (FRQ-S). L. M och N.S.K. har ett doktorandstipendium från FRQ-S. H. B hade ett doktorandstipendium från ministeriet för högre utbildning och från vetenskaplig forskning i Tunisien och stiftelsen Cole.

1. GSH-aguppstod affinitet rening av GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 ubiquitin Ligase Complex
<ol><li>Använd pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) bakterier uttryck konstruera för att omvandla BL21 (DE3) bakterier (se tabell över material)23. Denna konstruktion tillåter uttrycket av murina RING1B domän 1-159 smält till BMI1 domän 1-109 med gst tagg i pgex-6p-2 Backbone.</li>
	<li>Utför en övernattning starter kultur genom att vaccinera RIL-bakterier uttryck...

<ol>
	<li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+ubiquitin+chains:+E2+enzymes+at+work.">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li><li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+structure+and+function+of+the+deubiquitinases.">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unravelling+of+the+ubiquitin+system.">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li><li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+cell-cycle+control+and+cancer.">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li><li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy.">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Ligases:+Structure,+Function,+and+Regulation.">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li><li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages.">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li><li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code.">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li><li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation.">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li><li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity.">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li><li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense:+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing.">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li><li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation.">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li><li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers.">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li><li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response.">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li><li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast.">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li><li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control.">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li><li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions.">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li><li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter.">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li><li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B.">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li><li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB.">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li><li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1:+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression.">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li><li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas.">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li><li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma,+lung+adenocarcinoma,+meningioma,+and+other+cancers.">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li><li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma.">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li><li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility.">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li><li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma.">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li><li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors.">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li><li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation.">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li><li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma.">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li><li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2++flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation.">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1.">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385 (2018).</li><li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAP1/ASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer.">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li><li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O.">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression.">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair.">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li><li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response.">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression.">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li><li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells.">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1.">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li><li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAP1/ASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination.">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292 (2016).</li></ol>

Det finns flera fördelar med att etablera robusta in vitro ubiquitination och deubiquitination analyser för proteiner av intresse. Dessa analyser kan användas för att: (i) fastställa optimala förhållanden och definiera minimala krav för dessa reaktioner, (II) bestämma enzymatiska kinetiska och biokemiska konstanter, (III) definiera rollerna för kofaktorer eller hämmare som kan påverka dessa reaktioner, (IV) identifiera interaktions gränssnitt, (v) testa effekterna av artificiella eller sjukdomsassocierade mu...

Ubiquitination är en av de mest bevarade post-translationella modifieringar och är kritisk för en mängd olika organismer, inklusive jäst, växter och ryggradsdjur. Ubiquitination består av den kovalent fastsättning av ubiquitin, en mycket bevarad 76 Amino Acid polypeptid, att rikta proteiner och förekommer i tre sekventiella steg med tre enzymer, dvs E1-aktiverande, E2-konjugating och E3 Ligase1, 2,3. Denna post-translationella modifiering spelar centrala roller i ett brett spektrum av biologiska processer. Faktum är att E3 ligases, som ger specificiteten av reaktionen, utgör en stor superfamilj av enzymer och är de vanligast förekommande enzymerna i ubiquitin systemet4,5,6. De efterföljande effekterna av protein ubiquitination beror på arten av förändringen: monoubiquitination, multi-monoubiquitination, och linjär eller förgrenade polyubiquitination. Monoubiquitination är sällan förknippad med proteasomen nedbrytning, men i stället denna modifiering är involverad i medla olika signalering händelser. Polyubiquitination innebär N-terminalen eller lysin rester i ubiquitin molekyl själv, och ödet för ett polyubiquitinated protein beror på vilka rester är inblandade i ubiquitin kedje förlängning. Det har länge varit känt att polvubiquitinering medierad av lysin 48 av ubiquitin inducerar proteasomen nedbrytning. Tvärtom, polvubiquitinering via lysin 63 av ubiquitin är ofta förknippad med protein aktiveringen7,8,9. Liknar andra viktiga post-translationella modifieringar, ubiquitination är reversibel och ubiquitin avlägsnande från proteiner säkerställs genom specifika proteaser kallas deubiquitinases (DUBs), som har vuxit fram som viktiga regulatorer av cellulära processer 2 , 10. viktigt, många dubs är mycket specialiserade, och reglera, genom deubiquitination, specifika substrat, vilket indikerar att en fin balans mellan ubiquitination och deubiquitination är avgörande för proteinfunktion. E3s och dubs, tillsammans med proteasom nedbrytning maskiner och tillbehör faktorer, bildar ubiquitin proteasom systemet (UPS, med > 1200 gener) som reglerar större signalering vägar, av vilka flera är förknippade med celltillväxt och proliferation, cell öde bestämning, differentiering, cell migration, och celldöd. Viktigare, avreglering av flera signalering kaskader som involverar ubiquitination främjar tumorigenes och neurodegeneration sjukdomar5,11,12,13, 14.
Ubiquitination spelar genomgripande roller i kromatin biologi och DNA-beroende processer15,16,17. Till exempel, monoubiquitination av Histon H2A på lysin 119 (hädanefter H2A K119ub) är en kritisk post-translationella modifiering inblandade i transkriptionella förtryck och DNA Repair18,19,20, 21,22. H2A K119ub katalyseras av Polycomb repressiva Complex 1 (PRC1), som spelar en nyckelroll i upprätthållandet av epigenetisk information och är starkt bevarad från Drosophila till människa. Canonical PRC1 utgörs särskilt av RING1B och BMI1, som är det centrala E3 ubiquitin Ligase-komplexet som ansvarar för den ovan nämnda ubiquitination-händelsen22,23. I Drosophila, H2A monoubiquitination (H2A K118ub som motsvarar H2A K119ub i mammalians) är omvänd av Dub Calypso, som interagerar med ytterligare sex kam (ASX) bildar polycomb-REPRESSIVA Dub (PR-Dub) komplex24. Den däggdjur ortoolog Calypso, BAP1, är en tumör suppressor bort eller inaktiveras i olika mänskliga maligniteter25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 reglerar DNA-beroende processer i kärnan och kalciumsignalerad apoptos vid endoplasmatiska Retikulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 monterar flera subunit proteinkomplex som innehåller transkription regulatorer särskilt ASXL1, ASXL2 och ASXL3 (asxls), tre ortologer av ASX38,43. Asxls använda den deubiquitinase adaptern (deubad) domän, också benämnd asxm domän, till stimulera BAP1 Dub aktivitet35,36,44. Därför asxls spela viktiga roller i samordningen BAP1 Dub aktivitet på kromatin och mer allmänt dess tumör suppressor funktion.
Det finns flera metoder för att studera ubiquitination och deubiquitination processer. I synnerhet är biokemiska analyser med proteiner som renas från bakterier mycket kraftfulla för att demonstrera direkt ubiquitination av, eller avlägsnande av ubiquitin från, specifika substrat. Dessa experiment kan utföras för att undersöka en rad parametrar såsom bestämning av kravet på minimala komplex, bestämning av reaktionskinetik, definition av struktur/funktionsförhållanden och förståelse av effekterna av patologiska genmutationer. Här, vi tillhandahåller protokoll för att genomföra ubiquitination och deubiquitination reaktioner på kromatin substrat med renade komponenter. Som modellsystem, in vitro -ubiquitination och deubiquitination av nukleosomalt H2A protein presenteras. Bakterier-renade proteiner monterade i minimala komplex av RING1B/BMI1 och BAP1/DEUBAD används för ubiquitination eller deubiquitination av nukleosomal H2A, respektive.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylose agarose beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-protease cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>#230240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty chromatography column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-agarose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>#CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylmaleimide (NEM)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#ETM222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pore syringe filter 0.45 &#956;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>#23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#63139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ub Activating Enzyme (UBE1)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBCH5C (UBE2D3)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>#E2-627</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ubiquitination and deubiquitination assays of nucleosomal histones

Ubiquitination är en post-translationella modifiering som spelar viktiga roller i olika signalering vägar och är särskilt involverad i samordningen av kromatin funktion och DNA-associerade processer. Denna modifiering innebär en sekventiell åtgärd av flera enzymer, inklusive E1 ubiquitin-aktivering, E2 ubiquitin-konjugering och E3 ubiquitin-Ligase och reverseras av deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination inducerar nedbrytning av proteiner eller förändring av proteinfunktion inklusive modulering av enzymatisk aktivitet, protein-protein interaktion och subcellulär lokalisering. Ett kritiskt steg för att demonstrera protein ubiquitination eller deubiquitination är att utföra in vitro-reaktioner med renade komponenter. Effektiva ubiquitination och deubiquitination reaktioner kan påverkas kraftigt av de olika komponenter som används, enzym co-faktorer, buffertförhållanden, och arten av substratet.  Här, vi tillhandahåller steg-för-steg-protokoll för att utföra ubiquitination och deubiquitination reaktioner. Vi illustrerar dessa reaktioner med minimala komponenter i mus polycomb repressiva Complex 1 (PRC1), BMI1, och RING1B, en E3 ubiquitin Ligase som monoubiquitinates Histon H2A på lysin 119. Deubiquitination av nucleosomal H2A utförs med hjälp av en minimal Polycomb repressiv Deubiquitinase (PR-DUB) komplex som bildas av den mänskliga deubiquitinase BAP1 och DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domän av dess Co-Factor ASXL2. Dessa analyser av ubiquitination och deubiquitination kan utföras i samband med antingen rekombinanta nukleosomer som bereds med bakterierenade proteiner eller inhemska nukleosomer som renas från däggdjursceller. Vi belyser de krångligheter som kan ha en betydande inverkan på dessa reaktioner och vi föreslår att de allmänna principerna i dessa protokoll snabbt kan anpassas till andra E3 ubiquitin Ligaser och deubiquitinases.

GST-BMI1 och RING1B proteiner är väl producerade i bakterier och kan lätt extraheras i den lösliga fraktionen. Figur 1a visar en Coomassie Blåfärgning för en typisk rening av den gst-BMI1-RING1B komplex. GST-BMI1 och RING1B band migrerar vid förväntad molekylvikt, ~ 45 kDa och ~ 13 kDa respektive. Särskilt E3 Ligase Complex är mycket homogen med mycket låga nivåer av bakterier proteiner föroreningar och/eller nedbrytningsprodukter. Dessutom är ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones at JoVE.com

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination är en post-translationella modifiering som spelar viktiga roller i cellulära processer och är tätt koordinerad av deubiquitination. Defekter i båda reaktionerna ligger bakom mänskliga patologier. Vi tillhandahåller protokoll för att utföra ubiquitination och deubiquitination reaktion in vitro med hjälp av renade komponenter.

In vitro Ubiquitination och Deubiquitination assays av Nukleosomala Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Med tanke på komplexiteten i ubiquitination och deubiquitination reaktioner inuti cellerna är det viktigt att fastställa in vitro-analyser med definierade renade komponenter. Detta bidrar till att förstå mekanismerna för ubiquitination och deubiquitination och även för att avgöra hur mutationer i samband med gener som kodar de enzymer som ansvarar för denna reaktion kan orsaka mänskliga sjukdomar. Vi kan identifiera de domäner och motiv i dessa komponenter som driver dessa reaktioner.Vi kan också utveckla hög genomströmning skärm analyser som kan användas för att skärmen för små molekylhämmare som kan utvecklas som potentiella therapeutics. För att börja bakterier lys, tillsätt PMSF och antiproteas cocktail i iskallt lys buffert A.Lägg 25 millilters av lysbuffert A i flaskan som innehåller bakterier pellet och resuspend pelleten. Överför lysate som innehåller bakterier i ett rör för ultraljudsbehandling.Använd en sondsnikerare för att sonikera lysate vid 70%-utgående amplitud i 30 sekunder, fyra till fem gånger. Sedan centrifug vid 21, 000 gånger g i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Efter inkubering av bakterierna lysate med GSH pärlor i fem timmar enligt manuskriptet, överföra pärlorna tillsammans med 10 millilters av buffert till en tom kromatografi kolumn.Tillsätt sedan 1,5 millilter buffert A som innehåller 25 millimolarfrostion i kolonnen och samla elueringen genom gravitationen till 1,5 milliliter mikrorör. Upprepa elueringsproceduren fyra gånger med färsk buffert A en fortsatt behandling av de eluterade fraktionerna enligt manuskriptet. Till att börja med, resuspend his-BAP1 och MBP-DEUBAD bakterier pellets i 25 millilters av iskall lysbuffert B.Mix 25 millilters av varje lysate och inkubera på is i 15 minuter.Sonikera och sedan centrifug den lysate på 21, 000 gånger g i 20 minuter. Efter lysatecentrifugeringen, filtrera lysate genom ett 0,45 mikrometer porsprutefilter i en flaska och blanda det med Nickel NTA-pärlorna. Inkubera vid fyra grader Celsius med skakningar i fem timmar.Efter det, snurra ner pärlorna på 25, 000 gånger g i tre minuter. Använd en pipett för att spara supernatanten i ett 50 milliliter rör när flödet genom. Tvätta pärlorna med fem millilter av buffert B, innehållande 20 millimolar imidazol, sex gånger med tre minuters centrifug.Efter den sista tvätten, överför pärlorna med 10 millilter buffert B till en tom kromatografikolonn och tillsätt en milliliter buffert B som innehåller 200 millimolar imidazole. Samla in elueringen genom gravitationen i 1,5 milliliter mikrorör som innehåller DTT och EDTA. Upprepa elueringsproceduren fyra gånger och poola önskade eluerade fraktioner i ett 15 milliliterrör.Tillsätt buffert C för att späda ut det eluterade komplexet tre gånger. Överför sedan den utspädda elueringen till de beredda amylospärlorna i rör och inkubera över natten vid fyra grader Celsius med skakningar. På morgonen centrifuger rören på 2, 500 gånger g i tre minuter och hålla supernatanten i en 15 milliliter rör som flöde genom.Tvätta proteinbundna pärlor med fem millilter buffert C i fem till sex gånger. Lägg sedan till 500 mikroliter av buffert D till den renade His-BAP1/MBP-DEUBAD komplex på amylos agarose pärlor att göra en 50%pärla lösning. Överför 20 mikroliter av 50%pärllösningen till ett mikrocentrifugrör och tillsätt 20 mikroliter av två gånger Laemmli Sample Buffer för SDS-PAGE och Coomassie blå analys.Lagra den återstående pärllösningen vid minus 80 grader Celsius för framtida användning. Efter odling hek293T celler, platta 12 miljoner celler i 20 millilters av kompletta medier i en 15 centimeter kultur skålen, en dag före transfektionen. Efter en dag, under cellkulturen huva, aspirera media och leverans med 12 millilter av serum fria medier.Transfekt cellerna med 21 mikrogram pCDNA platt-H2A med 63 mikroliter pei på ett milligram per milliliter. Efter 12 timmar, ändra till komplett medium. Efter skörd av cellerna enligt manuskriptet, resuspend cell pelleten i cirka 10 volymer buffert E som innehåller NEM att hämma deubiquitinases och du inkubera på is i 20 minuter.Efter centrifugeringen vid 3, 000 gånger g i fem minuter, kassera supernatanten. Tvätta kromatinpelletsen två gånger med 10 volymer buffert E först och tvätta sedan två gånger med buffert F.Resuspend kromatin i fem millilter buffert F och behandla pelleten med mikrokocknukleas vid koncentrationen av tre enheter per milliliter i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter inkubation, överför en 40 microliter alikvot av blandningen till ett 1,5 milliliter rör för analys av nukleosomala DNA-fragment.Tillsätt 40 mikroliter av fenol-kloroform och 20 mikroliter av sex gånger DNA-lastningsbuffert. Vortexa och snurra på 18, 000 gånger g i två minuter. Överför sedan 15 mikroliter av vattenfasen i en 2%agarosgel för att ladda DNA: t.Efter att ha stoppat reaktionen och centrifugeringen enligt manuskriptet, inkubera den lösliga kromatinfraktionen med antiflagga hartspärlor i ett 15 milliliter rör över natten vid fyra grader Celsius med skakningar. Tvätta pärlorna sex gånger med buffert G.Transfer pärlorna med fem millilter av buffert G i en tom kromatografikolumn. Späd pärlans bundna nukleosomer med 260 mikroliter av buffert G innehållande 200 mikrogram per milliliter flaggnebinerad peptid och en till fem en molar Tris vid pH åtta.Elute nukleosomerna tre gånger, en timme i kylrummet. För att utföra ubiquitination assay, först lägga till ett mikrogram av de renade nukleosomer i 40 mikroliter av buffert H.After that, tillsätt en enzymlösning mix som innehåller 250 nanogram UBE1, 672 nanogram av UB och E2 UB konjugera enzymer och ett mikrogram BMI1-RING1B E3 ubiquitin ligase komplex i röret. Inkubera reaktionen i tre timmar vid 37 grader Celsius med enstaka skakningar.Stoppa reaktionen genom att lägga till 40 mikroliter av två gånger Laemmli Sample Buffer och analysera histon H2AK119 ubiquitination genom västra blotting. Att utföra in vitro deubiquitination assay resuspend den renade nukleosomer i 40 mikroliter av buffert I och ett mikrogram bakterier renas His-BAP1/MBP-DEUBAD pärlor. Placera röret i en inkubator vid 37 grader Celsius i tre timmar för att utföra deubiquitination reaktion med enstaka skakningar.Stoppa sedan reaktionen genom att lägga till 40 mikroliter av två gånger Laemmli buffert och analysera genom immunoblotting. I detta experiment, Coomassie blå färgning för en typisk rening av GST-BM1-RING1B komplexa med GST affinitet pärlor, visar att banden migrerar på förväntade molar vikt runt 45 kilodalton och 13 kilodalton respektive. Likaledes rening av His-BAP1 MBP-DEUBAD komplexa resulterade också i relativt höga homogena preparat med band runt 90 kilodalton och 55 kilodaltons respektive.Å andra sidan den renade nukleosomala fraktionen är i huvudsak består av en 147 baspar band som anger förekomsten av högberikad mononukleosal fraktion. Coomassie blå färgning av renat nukleosomer visar en typisk band mönster av de fyra histon underenheter med stökiometriska mängder. Ubiquitination av histon H2A med BMI1-RING1B komplexa visar en tid beroende ökning av ubiquitinated form av proteinet medan nivåerna av nonmodified form är samtidigt minskade.Ubiquitination-reaktionen är total då i princip alla H2A-proteiner omvandlas till H2A K119ub. Å andra sidan, deubiquitination analysen genomfördes infödda nukleosomer. Efter inkubation av dessa nukleosomer med BAP1-DEUBAD en tid beroende minskning av H2A K119ub signal observerades.Framgången för ubiquitination och deubiquitination reaktioner beror på hur proteinet renas. Vi behöver en god avkastning och buffertanvändningen för återfpension av proteiner och rening bör vara kompatibel med biokemiska reaktioner. När denna ubiquitination och deubiquitination analyser är väl etablerade vi kan testa de påverkar aktivatorer och hämmare samt effekterna av sjukdom associerade genmutationer.Denna metod har fastställts genom bidrag från flera laboratorier och är mycket användbara för att förstå mekanismerna för ubiquitination och deubiquitination. Flera kemikalier är farliga och behöver manipuleras i huven. Detta inkluderar fenol-kloroform, syror, baser, och reduktionsmedel.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Beredning av Nukleosomer med differentiellt isotopmärkt Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysera superkomplex av den mitokondriella elektrontransportkedjan med naturliga elektrofores, in-gel-analyser och elektrolys

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologiskt aktiva Thylakoids och deras användning i energi-beroende Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funktionell karaktärisering av RINGTYP E3 ubiquitin Ligaser in vitro och i planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Stegvis doseringsprotokoll för ökat dataflöde i etikettfria Impedansbaserade GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...