Name: nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00
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这项工作得到了美国癌症协会机构研究赠款IRG-14-195-01的支持(M.SharonStack是首席研究员;X.L. 是子接收者调查员)。该出版物是在国家卫生研究院、国家促进转化科学中心、临床和转化科学奖授予编号 KL2 TR002530 和 UL1 TR002529(A. Shekhar, PI) 的部分支持下制作的。X. L. 是印第安纳州 CTSI KL2 青年调查员奖的获得者。S.F.由沃尔瑟癌症基金会支持,该基金会推进基本癌症基金。X.W.由中国国家自然科学基金总体计划(授权号817773047)支持。

1. 血管紧张辛II的硝化
<ol><li>要产生硝酸盐肽,在390 μL PBS溶液(10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4) 中稀释10 μL的血管紧张素II(DRVYIHPF)的母溶液(水中2 mM),最终浓度为50μM。</li>
	<li>在血管紧张素II溶液中加入10μL的过氧硝酸盐(4.7%NaOH中的200 mM),使过氧硝酸盐的最终浓度达到5 mM。 注:过氧硝酸盐在酸形式下不稳定且易于分解,因此过氧硝酸盐的父溶液保存在基本溶液中,并储存在-80°C中。</li>
	<l...

<ol>
	<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+oxidants,+and+protein+tyrosine+nitration.">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+nitration:+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects.">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin,+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin,+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin.">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li><li>Batthy&#225;ny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Nitrated+Proteins:+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects.">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li><li>Feeney, M. B., Sch&#246;neich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration.">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry.">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li><li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins.">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li><li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides.">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li><li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites.">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li><li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins.">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples.">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers.">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li></ol>

此处的协议描述了硝肽富集和分析。使用血管紧张蛋白II作为模型肽,我们说明了如图1所示的过程。获得硝基血管紧张蛋白II后,肽上的主要胺应被阻断,以避免进一步的胺结合,这是协议中最关键的步骤之一。在目前的协议中,二甲基标记用于阻断原胺有两个原因:第一,它允许获得定量结果;第二,它允许获得定量结果;其次,这种反应的成本低于NHS为基础的反应,阻塞效率<sup class="xref"...

蛋白质中酪氨酸残留物的硝化形成3-硝基酪氨酸调节许多生物过程。由于酪氨酸和3-硝基酪氨酸之间的化学性质不同,硝酸盐蛋白可能具有扰动信号活性1,2。因此,开发能够有效地丰富和识别蛋白质上的硝化位点的方法非常重要。与其他形式的PTM(如磷酸化和乙酰化)相比,3-硝基酪氨酸对蛋白质的丰度修饰是一种低丰度修饰,因此直接从细胞系或组织样本中识别内源性硝化位点是具有挑战性的。然而,使用质谱法(MS)来描述硝基肽的破碎模式的方法已经开发出来(例如,Zhan & Desiderio 3),为硝基蛋白质组学的新方法奠定了基础。
目前,MS之后的扩充步骤是硝基肽分析4,5的最强大策略。浓缩方法可以分为两类。一类基于抗体,可以具体识别3-硝基酪氨酸,而另一类是基于化学衍生,减少硝基组胺组4,5。对于基于抗体的方法,硝基酪氨酸亲基柱用于浓缩,从中,洗脱物质通过高分辨率MS6,7进一步解毒和分析。对于基于化学衍生的方法,肽或赖氨酸的N-终点处的胺组应通过乙酰化、相对和绝对定量(iTRAQ)的异物标记或串联质量标记(TMT)试剂在第一步中阻断。接下来,一个减少剂用于减少亚硝基酪氨酸到氨基酪氨酸,然后修改新形成的胺组,其中包括生物素结扎,磺二醇肽转化,或其他类型的标记系统8,9, 10,11.迄今建立的大多数协议都基于体外过度硝酸盐蛋白,而不是内生硝酸盐蛋白。
本研究针对硝基肽的富集和鉴定,开发了硝基酪氨酸化学衍生的改良程序,表明在MS检测过程中灵敏度增强,适合定量。我们最近在生物系统中采用这种方法的研究表明,由骨髓衍生抑制细胞(MDSc)产生的RNS在Tyr394的Tyr394中,淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)的硝化在肿瘤微环境的免疫抑制12。因此,我们的硝基肽鉴定方法也可以应用于复杂的生物样品。在这里,我们使用肽血管紧张症II模型来描述我们的协议,其中分裂模式在硝基蛋白酶研究8、9、10、11中为已知和广泛使用。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="756">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acclaim pepmap 100 C18 column</td>
			<td style="width:197px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">164534</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">1 M TEAB solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">50% hydroxylamine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formaldehyde-D2</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>F691353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">isoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">NHS-S-S-bition</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Oasis HLB column (10 mg)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">peroxynitrite</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>516620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium cyanoborohydrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42077</td>
			<td>PhamaGrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium dithionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Streptavidin Sepharose</td>
			<td>GE Healcare</td>
			<td>GE17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Ultimate 3000 nanoLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii

蛋白质硝化是酪氨酸残留物最重要的转化后修饰(PTM)之一,可由真核细胞中活性氧种(ROS)和活性氮(RNS)的化学作用诱导。精确识别蛋白质上的硝化位点对于了解与蛋白质硝化(如炎症、老化和癌症)相关的生理和病理过程至关重要。由于硝酸盐蛋白即使在诱导条件下细胞中的丰度较低,因此没有开发用于分析和识别蛋白质硝化位点的普遍有效方法。在这里,我们描述了使用化学还原反应和生物锡标记,然后是高分辨率质谱法的硝基肽富集方案。在我们的方法中,硝基肽衍生物可以高精度地识别。与之前报告的方法相比,我们的方法具有两个优点。首先,二甲基标记用于阻断硝基肽上的主要胺,可用于生成定量结果。其次,使用含有NHS生物锡试剂的二硫化物键进行浓缩,进一步减少和烷基化,以增强质谱仪上的检测信号。该协议已成功应用于本论文中的肽血管紧张剂II模型。

本手稿中硝基肽分析的流程图如图1所示。图2、3、4和5分别显示了血管紧张素II、硝基血管紧张素II、二甲基标记硝基血管紧张素II和二甲基标记氨基血管紧张素II的质量光谱。 该化合物的分子量可以通过每个图中单同位素峰的m/z值来反映,表明每一步都成功地实现了对血管紧张辛II的化学修饰。图6</...

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Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

血管紧张蛋白II图解的硝酸分析与鉴定

由于三硝基酪氨酸修饰的丰度较低,酪氨酸硝酸蛋白的蛋白组谱分析一直是一项具有挑战性的技术。在这里,我们描述了一种利用血管紧张蛋白II作为模型来增强和分析硝基肽扩脂的新方法。此方法可以扩展到其他体外或体内系统。

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

这一信息可以帮助回答有关如何通过化学方法和质谱法丰富和识别硝基肽的关键问题。该技术具有增强的灵敏度，通过质谱法检测硝基肽，可应用于体外生化系统和内源生物组织。对于硝基血管紧张素 II 脱盐，使用一毫升移液器预置反相固相萃取或 SPE 柱，在柱顶部添加 500 微升甲醇和 500 微升水。当所有水都流过柱时，将410微升的硝基血管紧张素II溶液加载到柱子上。用500微升5%甲醇和水和300微升80%甲醇和水清洗该柱，以洗涤硝基肽。然后在室温下默认设置下通过速度真空干燥洗水器。对于原发胺烷基化，在100微升100毫摩尔三聚氨酯碳酸氢盐溶液中重组粉状硝基-血管紧张素II，并在烟罩中加入400微升4%甲醛，并短暂混合。接下来，在溶液中加入四升0.6摩尔氰酸氢钠，在室温下以每分钟400次旋转摇动一小时。在孵育结束时，用16微升1%氨溶液在室温下淬火5分钟，然后用8微升的甲酸化。然后像刚才演示的，在新的反向阶段 SPE 列中脱盐解决方案。为了减少硝基酪氨酸，在PBS的500微升中重组二甲基标记的硝基-血管紧张素II，并加入10微升的一种摩尔二硫化钠，在室温下孵育一小时。还原反应后，黄色溶液将变得清晰。如所示，在新的反向相 SPE 列中对减少的样品进行脱盐。在生物素化和富集方面，在PBS的500微升中重组二甲基标记的氨基氨基苯二，然后加入5微升40纳米摩尔NHS-S-S生物素溶解在二甲基硫化物中，在室温下孵育两小时。在孵育结束时，用一个微升5%羟基胺的解毒反应，在100微升的Streptavidin Agarose珠中加入500微升，通过三个独立的离心平衡。最后一次离心后，在反应系统中加入100微升珠，在室温下在旋转摇床上孵育一小时。在孵化结束时，每次洗涤用500微升新鲜PBS清洗系统四次，然后添加400微升10毫摩尔二十醚，在50摄氏度下孵育45分钟。在孵化结束时，向下旋转柱，将上经器转移到一个含有20微升0.5摩尔碘多乙酰胺的新管中，在黑暗中孵育20分钟。然后，如演示的新的逆相SPE柱中脱盐溶液，并在20微升0.1%甲酸中解除干肽。为了检测，请将产品装载到带串联质谱仪的液色谱仪上。使用与高分辨率质谱仪直接连接的纳米高压液相色谱系统，以每分钟 0.3 微升的流速将经过改进的血管紧张素 II 肽分离 60 分钟梯度 elusion。在数据依赖采集模式下，在质谱仪中设置单个全扫描质量谱，然后以 28% 的规范化碰撞能量进行 20 次数据依赖串联质谱扫描。然后打开质谱数据，确定每个步骤中产品的峰值，以确认化学反应已成功执行。在这里，可以观察到血管紧张素II在每次化学修饰之前和之后具有代表性的质谱。该化合物的分子量由单同位素峰的电量比值表示，表明该步骤成功实现了血管紧张素II的化学修饰。在这里，通过串联质谱法检测和描述的液相色谱的最终产品。通过二甲基标记对硝基肽进行定量分析，通过比较每组单同位素峰值的强度，可以计算轻和重的相对量，从而可以量化不同组富集的硝基肽。按照该过程，您可以使用程序搜索引擎，如SEQUEST最大计数的pFIND，以确定潜在的硝基肽。该技术开发后，为开始特定硝化场的生物功能铺平了道路。

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