Name: nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00
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Ce travail a été appuyé par l'American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack est chercheur principal; X.L. est un enquêteur sub-récipiendaire). Cette publication a été rendue possible grâce au soutien partiel de Grant Numbers KL2 TR002530 et UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) des National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. est récipiendaire du prix Du jeune enquêteur CTSI de l'Indiana. S. F. est soutenu par les subventions de la Walther Cancer Foundation Advancing Basic Cancer. X. W. est soutenu par le National Natural Science Foundation of China General Program (Grant No. 817773047).

1. Nitration de l'angiotensine II
<ol><li>Pour générer un peptide nitrate, diluer 10 L de solution parente Angiotensin II (DRVYIHPF) (2 mM dans l'eau) dans une solution PBS de 390 L (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4) à la concentration finale de 50 M.</li>
	<li>Ajouter 10 L de peroxynitrite (200 mM en 4,7% NaOH) à la solution Angiotensin II pour rendre la concentration finale de peroxynitrite 5 mM. REMARQUE: La peroxynitrite est instable et facile à résoudre lorsqu'elle est sous forme a...

<ol>
	<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+oxidants,+and+protein+tyrosine+nitration.">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+nitration:+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects.">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin,+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin,+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin.">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li><li>Batthy&#225;ny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Nitrated+Proteins:+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects.">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li><li>Feeney, M. B., Sch&#246;neich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration.">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry.">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li><li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins.">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li><li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides.">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li><li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites.">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li><li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins.">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples.">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers.">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li></ol>

Le protocole décrit ici l'enrichissement et le profilage des nitropéptides. En utilisant Angiotensin II comme peptide modèle, nous avons illustré la procédure montrée dans la figure 1. Après l'obtention de la nitro-Angiotensine II, l'amine primaire sur le peptide doit être bloquée pour éviter l'autre conjugaison de mine, qui est l'une des étapes les plus critiques dans le protocole. Dans le protocole actuel, l'étiquetage du diméthyle est utilisé pour bloquer les amines primaire...

La nitration des résidus de tyrosine dans les protéines pour former 3-nitrotyrosine régule de nombreux processus biologiques. En raison des différentes propriétés chimiques entre la tyrosine et la 3-nitrotyrosine, une protéine nitrated peut avoir perturbé l'activité de signalisation1,2. Par conséquent, il est important de développer des méthodes qui peuvent enrichir et identifier efficacement les sites de nitration sur les protéines. Comme la 3-nitrotyrosine est une modification de faible abondance sur les protéines par rapport à d'autres formes de PTM, comme la phosphorylation et l'acétylation, il est difficile d'identifier les sites de nitration endogènes directement à partir de lignées cellulaires ou d'échantillons de tissus. Néanmoins, la méthodologie d'utilisation de la spectrométrie de masse (MS) pour caractériser le modèle de fragmentation du nitrotpeptide a été développée (par exemple, Zhan et Desiderio3), qui jette les bases de nouvelles méthodes de nitroprotéomique.
Actuellement, une étape d'enrichissement suivie par la SP est la stratégie la plus puissante pour le profilage nitropeptide4,5. Les méthodes d'enrichissement peuvent être classées en deux classes. Une classe est basée sur des anticorps qui peuvent reconnaître 3-nitrotyrosine spécifiquement, tandis que l'autre classe est basée sur la dérivation chimique qui réduit un groupe nitro à un groupe d'amine4,5. Pour la méthode basée sur les anticorps, colonne d'affinité nitrotyrosine est utilisé pour l'enrichissement, à partir de laquelle le matériau éluesté est encore résolu et analysé par haute résolution MS6,7. Pour la méthode à base de dérivation chimique, les groupes d'amine au N-terminus du peptide ou de la lysine devraient être bloqués dans un premier temps soit par acétylation, balises isobares pour quantitation relative et absolue (iTRAQ), ou réagents de masse tandem (TMT). Ensuite, un réducteur est utilisé pour réduire la nitrotyrosine à l'aminotyrosine suivie par la modification du groupe amine nouvellement formé, qui comprend la ligature de la biotine, la conversion de peptide sulphydryl, ou d'autres types de systèmes de marquage8,9, 10,11. La plupart des protocoles établis jusqu'à présent sont basés sur des protéines in vitro sur-nitrated, au lieu de protéines endogènes nitrates.
Dans la présente étude, une procédure modifiée de la dérivation chimique de la nitrotyrosine est développée pour l'enrichissement et l'identification du nitropéptide, qui montre une sensibilité accrue pendant la détection de la SP et convient à la quantification. Notre étude récente utilisant cette méthode dans les systèmes biologiques a identifié que la nitration de la tyrosine kinase de protéine lymphocyte-spécifique (LCK) à Tyr394 par RNS produit à partir des cellules suppressrices myéloïdes dérivées (MDSCs) joue un rôle important dans le immunosuppression du microenvironnement de tumeur12. Par conséquent, notre méthode d'identification de nitropeptide peut être appliquée aux échantillons biologiques complexes aussi bien. Ici, nous décrivons notre protocole en utilisant le modèle peptide Angiotensin II, dont le modèle de fragmentation est connu et largement utilisé dans les études nitroprotéomiques8,9,10,11, à titre d'exemple.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="756">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acclaim pepmap 100 C18 column</td>
			<td style="width:197px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">164534</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">1 M TEAB solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">50% hydroxylamine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formaldehyde-D2</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>F691353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">isoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">NHS-S-S-bition</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Oasis HLB column (10 mg)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">peroxynitrite</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>516620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium cyanoborohydrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42077</td>
			<td>PhamaGrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium dithionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Streptavidin Sepharose</td>
			<td>GE Healcare</td>
			<td>GE17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Ultimate 3000 nanoLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii

La nitration protéique est l'une des modifications post-traductionnelles les plus importantes (PTM) sur les résidus de tyrosine et elle peut être induite par des actions chimiques d'espèces réactives d'oxygène (ROS) et d'espèces d'azote réactif (RNS) dans les cellules eucaryotes. L'identification précise des sites de nitration sur des protéines est cruciale pour comprendre les processus physiologiques et pathologiques liés à la nitration de protéine, tels que l'inflammation, le vieillissement, et le cancer. Étant donné que les protéines nitrates sont de faible abondance dans les cellules, même dans des conditions induites, aucune méthode universelle et efficace n'a été mise au point pour le profilage et l'identification des sites de nitration des protéines. Ici nous décrivons un protocole pour l'enrichissement de nitropeptide en utilisant une réaction chimique de réduction et l'étiquetage de biotine, suivi de la spectrométrie de masse de haute résolution. Dans notre méthode, les dérivés du nitropéeptide peuvent être identifiés avec une grande précision. Notre méthode présente deux avantages par rapport aux méthodes précédemment rapportées. Tout d'abord, l'étiquetage du diméthyle est utilisé pour bloquer l'amine primaire sur les nitropéeptides, qui peut être utilisé pour générer des résultats quantitatifs. Deuxièmement, une liaison de disulfure contenant nhs-biotine réactif est utilisé pour l'enrichissement, qui peut être encore réduit et alkylé pour améliorer le signal de détection sur un spectromètre de masse. Ce protocole a été appliqué avec succès au modèle peptide Angiotensin II dans le document actuel.

Le diagramme de flux pour le profilage des nitropéptides dans ce manuscrit est montré dans la figure 1. Les chiffres 2, 3, 4 et 5 montrent les spectres de masse d'Angiotensin II, nitro-Angiotensin II, de diméthyle étiqueté nitro-Angiotensin II et de diméthyle étiqueté amino Angiotensin II, respectivement. Le poids moléculaire du composé peut être reflété par les valeurs m/z du pic mono-isotope dans ...

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Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Profilage et identification de Nitropeptide illustrépar Angiotensin II

Le profilage protéomique des protéines tyrosine-nitrated a été une technique provocante due à la basse abondance de la modification de 3-nitrotyrosine. Ici nous décrivons une approche nouvelle pour l'enrichissement et le profilage de nitropeptide en utilisant Angiotensin II comme modèle. Cette méthode peut être étendue à d'autres systèmes in vitro ou in vivo.

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Ce message qui peut aider à répondre à des questions clés sur la façon d’enrichir et d’identifier les nitropeptides par une approche chimique et la spectrométrie de masse. Cette technique a une sensibilité accrue pour détecter les nitropéptides par spectrométrie de masse et qui peut être appliquée à la fois aux systèmes biochimiques in vitro et aux tissus biologiques endogènes. Pour le desalting nitro-angiotensine II, utilisez un tuyau d’un millilitre pour conditionner une extraction en phase solide en phase inverse ou une colonne SPE avec l’ajout de 500 microlitres de méthanol et de 500 microlitres d’eau dans le haut de la colonne.Lorsque toute l’eau a traversé la colonne, chargez 410 microlitres de solution nitro-angiotensine II sur la colonne. Lavez la colonne avec 500 microlitres de 5% de méthanol et d’eau et 300 microlitres de 80% de méthanol et d’eau pour élucider le nitropeptide. Ensuite, séchez l’allongement par vide de vitesse dans le réglage par défaut à température ambiante.Pour l’alkylation primaire d’amine, reconstituer la solution en poudre de bicarbonate de nitro-angiotensin II dans 100 microlitres de la solution bicarbonate de triéthylammonium de 100 millimolar et ajouter 400 microlitres de formaldéhyde de 4% à la solution dans une hotte de fumée avec le mélange bref. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de cyanoborohydride de sodium molaire de 0,6 molaire à la solution en secouant à 400 rotations par minute pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, étanchez la réaction d’étiquetage avec 16 microlitres de solution d’ammoniac de 1% pendant cinq minutes à température ambiante suivie de l’acidification avec huit microlitres d’acide formique.Ensuite, désaltrez la solution dans une nouvelle colonne SPE en phase inverse comme nous venons de le démontrer. Pour que la nitrotyrosine soit réduite à l’aminotyrosine, reconstituez la nitro-angiotensine II étiquetée diméthyle dans 500 microlitres de PBS et ajoutez 10 microlitres d’un dithionate de sodium molaire pendant une heure d’incubation à température ambiante. Après la réaction de réduction, la solution jaune deviendra claire.Desalt l’échantillon réduit dans une nouvelle colonne SPE en phase inverse comme démontré. Pour la biotinylation et l’enrichissement, reconstituer l’aminoangiotensine II étiquetée diméthyle dans 500 microlitres de PBS suivie de l’ajout de cinq microlitres de 40 nanomolaires NHS-S-S biotine dissous dans du sulfoxyde de diméthyle pendant une incubation de deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, étancher la réaction avec un microlitre de 5% d’hydroxylamine et ajouter 500 microlitres de PBS frais à 100 microlitres de perles Streptavidin Agarose pour l’équilibrage par trois centrifugations distinctes.Après la dernière centrifugation, ajouter 100 microlitres de perles au système de réaction pendant une incubation d’une heure sur un Shaker Rotary à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver le système quatre fois avec 500 microlitres de PBS frais par lavage suivi de l’ajout de 400 microlitres de 10 millimolar dithiothreitol pour une incubation de 45 minutes à 50 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, faites tourner la colonne et transférez le supernatant dans un nouveau tube contenant 20 microlitres d’iodoacetamide molaire de 0,5 molaire pour une incubation de 20 minutes dans l’obscurité.Puis désaltrer la solution dans une nouvelle colonne SPE en phase inverse comme démontré et résoudre le peptide sec dans 20 microlitres de 0,1% d’acide formique. Pour la détection, chargez le produit sur un chromatographe liquide avec un spectromètre de masse tandem. Séparez les peptides angiotensine II modifiés par une elusion de gradient de 60 minutes à un débit de 0,3 microlitres par minute avec le système de chromatographie liquide à haute pression nano-haute pression qui est directement interface avec le spectromètre de masse haute résolution.Dans le mode d’acquisition dépendant des données, définissez un spectre de masse de balayage complet unique dans le spectromètre de masse, suivi de 20 balayages de spectromètre de masse tandem dépendant des données à 28 % d’énergie de collision normalisée. Ouvrez ensuite les données des spectres de masse et identifiez les pics du produit à chaque étape pour confirmer que la réaction chimique a été effectuée avec succès. Ici, des spectres de masse représentatifs de l’angiotensine II avant et après chaque modification chimique comme démontré peuvent être observés.Le poids moléculaire du composé est indiqué par les valeurs de rapport masse-charge du pic mono-isotope, ce qui indique que la modification chimique sur l’angiotensine II a été obtenue avec succès pour cette étape. Ici, le produit final tel que détecté et caractérisé par la chromatographie liquide avec spectrométrie de masse tandem est montré. L’analyse quantitative des nitropeptides par l’étiquetage du diméthyle permet de calcul des quantités relatives de lumière et de lourd par comparaison de l’intensité du pic mono-isotopique dans chaque groupe, permettant la quantification des nitropeptides enrichis de différents groupes.Après la procédure, vous pouvez utiliser un moteur de recherche de programme tel que le compte maximum SEQUEST de pFIND pour identifier les nitropeptides potentiels. Après son développement, cette technique a ouvert la voie au démarrage des fonctions biologiques de sites de nitration spécifiques.

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