Name: nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack ist Principal Investigator; X.L. ist ein Subrecipient-Ermittler). Diese Publikation wurde mit teilweiser Unterstützung durch die Grant Numbers KL2 TR002530 und UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) vom National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award ermöglicht. X. L. ist Einträger des Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. wird von der Walther Cancer Foundation Unterstützt. X. W. wird vom National Natural Science Foundation of China General Program (Grant No. 817773047) unterstützt.

1. Nitration von Angiotensin II
<ol><li>Zur Erzeugung von nitratiertem Peptid 10 l Angiotensin II (DRVYIHPF) Mutterlösung (2 mM in Wasser) in 390 L PBS-Lösung (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4) bei der Endkonzentration von 50 m zu verdünnen.</li>
	<li>Fügen Sie der Angiotensin-II-Lösung 10 l Peroxynitritrit (200 mM in 4,7 % NaOH) hinzu, um die Endkonzentration von Peroxynitrit 5 mM herzustellen. HINWEIS: Peroxynitrit ist instabil und leicht zu lösen, wenn es in saurer Form ist, so dass ...

<ol>
	<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+oxidants,+and+protein+tyrosine+nitration.">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+nitration:+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects.">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin,+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin,+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin.">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li><li>Batthy&#225;ny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Nitrated+Proteins:+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects.">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li><li>Feeney, M. B., Sch&#246;neich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration.">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry.">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li><li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins.">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li><li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides.">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li><li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites.">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li><li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins.">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples.">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers.">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li></ol>

Das Protokoll beschreibt hier die Nitropeptid-Anreicherung und Profilierung. Anhand von Angiotensin II als Modellpeptid haben wir das in Abbildung 1dargestellte Verfahren veranschaulicht. Nach Erhalt des Nitro-Angiotensin II sollte das primäre Amin auf dem Peptid blockiert werden, um die weitere Aminkonjugation zu vermeiden, die einer der kritischsten Schritte innerhalb des Protokolls ist. Im aktuellen Protokoll wird die Dimethylkennzeichnung verwendet, um die primären Aumine aus zwei Grü...

Die Nitration von Tyrosinrückständen in Proteinen zu 3-Nitrotyrosin reguliert viele biologische Prozesse. Aufgrund der unterschiedlichen chemischen Eigenschaften zwischen Tyrosin und 3-Nitrotyrosin kann ein nitratiertes Protein die Signalwirkung1,2gestört haben. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, die Nitrationsstellen auf Proteinen effizient anreichern und identifizieren können. Da 3-Nitrotyrosin eine geringe Häufigkeitsmodifikation auf Proteine im Vergleich zu anderen Formen von PTM, wie Phosphorylierung und Acetylierung, ist es schwierig, endogene Nitrationsstellen direkt aus Zelllinien oder Gewebeproben zu identifizieren. Dennoch wurde die Methode der Verwendung von Massenspektrometrie (MS) entwickelt, um das Fragmentierungsmuster von Nitrotpeptid zu charakterisieren (z. B. Zhan & Desiderio3), die den Grundstein für neue Methoden der Nitroproteomik legt.
Derzeit ist ein Anreicherungsschritt gefolgt von MS die stärkste Strategie für Nitropeptid Profilierung4,5. Die Anreicherungsmethoden können in zwei Klassen eingeteilt werden. Eine Klasse basiert auf Antikörpern, die 3-Nitrotyrosin spezifisch erkennen können, während die andere Klasse auf der chemischen Ableitung basiert, die eine Nitrogruppe auf eine Amingruppereduziert 4,5. Für die Antikörper-basierte Methode wird nitrotyrosin-Affinitätssäule für die Anreicherung verwendet, aus der das eluierte Material weiter gelöst und mit hochauflösendem MS6,7analysiert wird. Für die chemische Ableitungsmethode sollten die Amingruppen am N-Terminus des Peptids oder Lysins im ersten Schritt entweder durch Acetylierung, isobarere te-Tags für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) oder Tandemmassen-Tags (TMT)-Reagenzien blockiert werden. Als nächstes wird ein Reduzierer verwendet, um Nitrotyrosin zu Aminotyrosin zu reduzieren, gefolgt von einer Änderung der neu gebildeten Amingruppe, die Biotinligation, Sulphydrylpeptid-Konvertierung oder andere Arten von Tagging-Systemen8,9, 10,11. Die meisten der bisher etablierten Protokolle basieren auf in vitro übernitrateten Proteinen statt auf endogen nitratierten Proteinen.
In der vorliegenden Studie wurde ein modifiziertes Verfahren zur chemischen Ableitung von Nitrotyrosin zur Nitropeptidanreicherung und -identifikation entwickelt, das eine erhöhte Empfindlichkeit beim MS-Nachweis zeigt und für Quantifizierungszwecke geeignet ist. Unsere jüngste Studie, die diese Methode in biologischen Systemen verwendet, hat gezeigt, dass die Nitration der lymphozytenspezifischen Proteintyrosinkinase (LCK) bei Tyr394 von RNS, die aus myeloiden abgeleiteten Suppressorzellen (MDSCs) hergestellt wird, eine wichtige Rolle bei der Immunsuppression der Tumormikroumgebung12. Daher kann unsere Methode der Nitropeptid-Identifikation auch auf komplexe biologische Proben angewendet werden. Hier beschreiben wir unser Protokoll anhand des Modells Peptid Sgiotensin II, von dem das Fragmentierungsmuster bekannt ist und in nitroproteomischen Studien 8,9,10,11als Beispiel weit verbreitet ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="756">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acclaim pepmap 100 C18 column</td>
			<td style="width:197px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">164534</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">1 M TEAB solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">50% hydroxylamine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formaldehyde-D2</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>F691353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">isoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">NHS-S-S-bition</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Oasis HLB column (10 mg)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">peroxynitrite</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>516620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium cyanoborohydrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42077</td>
			<td>PhamaGrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium dithionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Streptavidin Sepharose</td>
			<td>GE Healcare</td>
			<td>GE17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Ultimate 3000 nanoLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii

Proteinnitration ist eine der wichtigsten post-translationalen Modifikationen (PTM) an Tyrosinrückständen und kann durch chemische Aktionen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktiven Stickstoffarten (RNS) in eukaryotischen Zellen induziert werden. Die genaue Identifizierung von Nitrationsstellen auf Proteinen ist entscheidend für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse im Zusammenhang mit Proteinnitration, wie Entzündungen, Alterung und Krebs. Da die nitratierten Proteine auch unter induzierten Bedingungen in Zellen von geringer Fülle sind, wurden keine universellen und effizienten Methoden zur Profilierung und Identifizierung von Proteinnitrationsstellen entwickelt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Nitropeptidanreicherung mit einer chemischen Reduktionsreaktion und Biotin-Etikettierung, gefolgt von hochauflösender Massenspektrometrie. In unserer Methode können Nitropeptidderivate mit hoher Genauigkeit identifiziert werden. Unsere Methode weist zwei Vorteile gegenüber den zuvor gemeldeten Methoden auf. Erstens wird die Dimethylkennzeichnung verwendet, um das primäre Amin auf Nitropeptiden zu blockieren, die verwendet werden können, um quantitative Ergebnisse zu generieren. Zweitens wird zur Anreicherung eine Disulfidbindung verwendet, die NHS-Biotin-Reagenz enthält, die weiter reduziert und alkyliert werden kann, um das Detektionssignal auf einem Massenspektrometer zu verbessern. Dieses Protokoll wurde im aktuellen Papier erfolgreich auf das Modellpeptid Angiotensin II angewendet.

Das Flussdiagramm für Nitropeptidprofilierung in diesem Manuskript ist in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2, 3, 4 und 5 zeigen die Massenspektren von Angiotensin II, Nitro-Angiotensin II, Dimethyl beschriftetes Nitro-Angiotensin II und Dimethyl markiertes Amino Angiotensin II. Das Molekulargewicht der Verbindung kann durch die m/z-Werte des Monoisotopenspitzen in jeder Abbildung reflektiert werden, was darauf...

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Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Die proteomische Profilierung von Tyrosin-Nitrat-Proteinen war aufgrund der geringen Häufigkeit der 3-Nitrotytyrosin-Modifikation eine anspruchsvolle Technik. Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für die Nitropeptidanreicherung und Profilierung unter Verwendung von Angiotensin II als Modell. Diese Methode kann für andere In-vitro- oder In-vivo-Systeme erweitert werden.

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Diese Nachricht, die helfen kann, wichtige Fragen zu beantworten, wie Nitropeptide durch einen chemischen Ansatz und die Massenspektrometrie zu bereichern und zu identifizieren. Diese Technik hat eine erhöhte Empfindlichkeit für den Nachweis von Nitropeptiden durch Massenspektrometrie und kann sowohl auf biochemische In-vitro-Systeme als auch auf endogene biologische Gewebe angewendet werden. Für die Nitro-Angiotensin-II-Entsalzung verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um eine Reverse-Phase-Festphasenextraktion oder SPE-Säule mit zugabe von 500 Mikrolitermethanol und 500 Mikroliter Wasser in die Oberseite der Säule vorzukonditionieren.Wenn das gesamte Wasser durch die Säule gelaufen ist, laden Sie 410 Mikroliter Nitro-Angiotensin II-Lösung auf die Säule. Waschen Sie die Säule mit 500 Mikroliter5%Methanol und Wasser und 300 Mikroliter 80% Methanol und Wasser, um das Nitropeptid zu löschen. Dann trocknen Sie das Eluat durch Geschwindigkeitsvakuum in der Standardeinstellung bei Raumtemperatur.Zur primären Aminalkylierung das pulverisierte Nitro-Angiotensin II in 100 Mikrolitern 100 Millimolar Triethylammonium bicarbonat-Lösung rekonstituieren und 400 Mikroliter 4%Formaldehyd in einer Dunstabzugshaube mit kurzer Mischung in die Lösung geben. Als nächstes fügen Sie vier Mikroliter 0,6 Mol-Natriumcyanoborohydrid in die Lösung mit Schütteln bei 400 Umdrehungen pro Minute für eine Stunde bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Etikettierreaktion mit 16 Mikrolitern 1%Ammoniaklösung für fünf Minuten bei Raumtemperatur und anschließender Versauerung mit acht Mikroliter Ameisensäure ablöschen.Dann entsalzen Sie die Lösung in einer neuen Reverse-Phase-SPE-Säule, wie gerade gezeigt. Für Nitrotyrosin zur Aminotyrosinreduktion das Dimethyl-markierte Nitro-Angiotensin II in 500 Mikroliter PBS rekonstituieren und 10 Mikroliter eines molaren Natriumdithionats für eine eine Stunde Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Nach der Reduktionsreaktion wird die gelbe Lösung klar.Die reduzierte Probe in einer neuen Reverse-Phase-SPE-Säule zu entalten, wie gezeigt. Zur Biotinylierung und Anreicherung wird das dimethylmarkierte Aminoangiotensin II in 500 Mikroliter PBS rekonstituiert, gefolgt von der Zugabe von fünf Mikrolitern 40 nanomolarem NHS-S-S-Biotin, das in Dimethylsulfoxid für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur gelöst ist. Am Ende der Inkubation die Reaktion mit einem Mikroliter 5%Hydroxylamin abschrecken und 500 Mikroliter frisches PBS zu 100 Mikroliter Streptavidin Agarose Perlen für die Äquilibation durch drei separate Zentrifugationen hinzufügen.Nach der letzten Zentrifugation 100 Mikroliter Perlen für eine einstündige Inkubation auf einem Rotary Shaker bei Raumtemperatur in das Reaktionssystem geben. Am Ende der Inkubation waschen Sie das System viermal mit 500 Mikrolitern frischer PBS pro Wäsche, gefolgt von der Zugabe von 400 Mikrolitern 10 Millimolar Dithiothreitol für eine 45-minütige Inkubation bei 50 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Säule nach unten drehen und den Überstand in ein neues Rohr mit 20 Mikrolitern 0,5 Moliodoacetamid für eine 20-minütige Inkubation im Dunkeln übertragen.Dann die Lösung in einer neuen Reverse-Phase-SPE-Säule entsalzen, wie gezeigt, und lösen Sie das trockene Peptid in 20 Mikroliter 0,1% Ameisensäure. Zur Detektion laden Sie das Produkt auf einen Flüssigchromatographen mit einem Tandem-Massenspektrometer. Trennen Sie die modifizierten Angiotensin-II-Peptide durch eine 60-minütige Gradientenelusion bei einer Durchflussrate von 0,3 Mikroliter pro Minute mit dem Nanohochdruck-Flüssigkeitschromatographiesystem, das direkt mit dem hochauflösenden Massenspektrometer in Verbindung steht.Legen Sie im datenabhängigen Erfassungsmodus ein einzelnes vollständiges Scanmassenspektrum im Massenspektrometer fest, gefolgt von 20 datenabhängigen Tandem-Massenspektrometern-Scans mit 28 % normalisierter Kollisionsenergie. Öffnen Sie dann die Massenspektrendaten und identifizieren Sie die Spitzen des Produkts in jedem Schritt, um zu bestätigen, dass die chemische Reaktion erfolgreich durchgeführt wurde. Hierkönnen repräsentative Massenspektren von Angiotensin II vor und nach jeder chemischen Veränderung beobachtet werden.Das Molekulargewicht der Verbindung wird durch die Massen-Zu-Ladungs-Verhältniswerte des Monoisotopen-Peaks angezeigt, was darauf hindeutet, dass die chemische Modifikation an Angiotensin II für diesen Schritt erfolgreich erreicht wurde. Hierwird wird das Endprodukt gezeigt, das durch eine flüssige Chromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie nachgewiesen und gekennzeichnet ist. Die quantitative Analyse der Nitropeptide durch Dimethyl-Etikettierung ermöglicht die Berechnung der relativen Mengen an Licht und schweren durch Vergleich der Intensität des Monoisotopenspitzen in jeder Gruppe, was die Quantifizierung der angereicherten Nitropeptide aus verschiedenen Gruppen ermöglicht.Im Verlauf des Verfahrens können Sie eine Programmsuchmaschine wie die maximale Anzahl von pFIND sEQUEST verwenden, um die potenziellen Nitropeptide zu identifizieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für den Beginn der biologischen Funktionen bestimmter Nitrationsstellen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

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Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

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A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...