Name: nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack è Principal Investigator; X.L. è un investigatore subrecipient). Questa pubblicazione è stata resa possibile con il supporto parziale di Grant Numbers KL2 TR002530 e UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) del National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. ha ricevuto il CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. è sostenuto dalle sovvenzioni per il cancro di base della Walther Cancer Foundation. X. W. è supportato dal National Natural Science Foundation of China General Program (Grant N. 817773047).

1. Nirazione di Angiotensina II
<ol><li>Per generare un peptide nito, diluire 10 - L di AngiotensinI (DRVYIHPF) soluzione madre (2 mM in acqua) in 390 soluzione PBS l (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4) alla concentrazione finale di 50 M.</li>
	<li>Aggiungere 10 l di peroxynitrite (200 mM in 4,7% NaOH) alla soluzione Angiotensin II per rendere la concentrazione finale di perossintetazione 5 mM. NOTA: La peroxynitrite è instabile e facile da risolvere quando è in forma acida, quindi la soluzi...

<ol>
	<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+oxidants,+and+protein+tyrosine+nitration.">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+nitration:+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects.">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin,+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin,+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin.">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li><li>Batthy&#225;ny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Nitrated+Proteins:+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects.">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li><li>Feeney, M. B., Sch&#246;neich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration.">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry.">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li><li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins.">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li><li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides.">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li><li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites.">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li><li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins.">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples.">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers.">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li></ol>

Il protocollo qui descrive l'arricchimento e la profilazione del nitropeptide. Utilizzando Angiotensin II come peptide modello, abbiamo illustrato la procedura illustrata nella Figura 1. Dopo aver ottenuto il nitro-angiotensina II, l'ammina primaria sul peptide dovrebbe essere bloccata per evitare l'ulteriore coniugazione dell'ammina, che è uno dei passi più critici all'interno del protocollo. Nell'attuale protocollo, l'etichettatura dimetila viene utilizzata per bloccare le aree primarie ...

Nileggia dei residui di tirosina nelle proteine per formare 3-nitrotyrosine regola molti processi biologici. A causa delle diverse proprietà chimiche tra tirosina e 3-nitrotyrosine, una proteina nitrata può aver perturbato l'attività di segnalazione1,2. Pertanto, è importante sviluppare metodi in grado di arricchire e identificare i siti di nitrazione sulle proteine in modo efficiente. Poiché 3-nitrotyrosine è una modifica a bassa abbondanza sulle proteine rispetto ad altre forme di PTM, come la fosforolalazione e l'acetilazione, è difficile identificare siti di nitrazione endogeni direttamente da linee cellulari o campioni di tessuto. Tuttavia, è stata sviluppata la metodologia dell'utilizzo della spettrometria di massa (MS) per caratterizzare il modello di frammentazione del nitrotpeptide (ad esempio, ,han & Desiderio3), che getta le basi per nuovi metodi di nitroproteomica.
Attualmente, un passo di arricchimento seguito da MS è la strategia più potente per la profilazione nitropeptide4,5. I metodi di arricchimento possono essere classificati in due classi. Una classe si basa su anticorpi in grado di riconoscere 3-nitrotyrosine in modo specifico, mentre l'altra classe si basa sulla derivazione chimica che riduce un gruppo nitro a un gruppo di ammine4,5. Per il metodo basato sugli anticorpi, la colonna di affinità nitrotyrosine viene utilizzata per l'arricchimento, da cui il materiale eluito viene ulteriormente risolto e analizzato dall'alta risoluzione MS6,7. Per il metodo basato sulla derivazione chimica, i gruppi di ammine al n-terminus del peptide o della lisina devono essere bloccati nel primo passaggio da acetilazione, tag isobarici per quantitazione relativa e assoluta (iTRAQ), o tag di massa tandem (TMT) reagenti. Successivamente, viene utilizzato un riduttore per ridurre la nitrotilsina all'aminotirosofina seguita dalla modifica del gruppo di ammine appena formato, che include la legatura di biotina, la conversione di peptide sulfittra o altri tipi di sistemi di etichettatura8,9, 10,11. La maggior parte dei protocolli stabiliti finora si basano su proteine in vitro sovranitate, invece di proteine endogenamente nitonate.
Nel presente studio, una procedura modificata della derivazione chimica della nitrotyrosine è sviluppata per l'arricchimento e l'identificazione del nitropeptide, che mostra una maggiore sensibilità durante il rilevamento della SM ed è adatto allo scopo di quantificazione. Il nostro recente studio sull'utilizzo di questo metodo nei sistemi biologici ha identificato che la nizione della crosina di tirosina (LCK) specifica del linfocito (LCK) al Tyr394 da RNS prodotta da cellule soppressori derivate da mieloidi (MDSC) svolge un ruolo importante immunosoppressione del microambiente tumorale12. Pertanto, il nostro metodo di identificazione nitropeptide può essere applicato anche a campioni biologici complessi. Qui, descriviamo il nostro protocollo utilizzando il modello peptide Angiotensin II, di cui il modello di frammentazione è noto e ampiamente utilizzato negli studi nitroproteomici8,9,10,11, come esempio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="756">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acclaim pepmap 100 C18 column</td>
			<td style="width:197px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">164534</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">1 M TEAB solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">50% hydroxylamine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formaldehyde-D2</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>F691353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">isoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">NHS-S-S-bition</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Oasis HLB column (10 mg)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">peroxynitrite</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>516620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium cyanoborohydrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42077</td>
			<td>PhamaGrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium dithionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Streptavidin Sepharose</td>
			<td>GE Healcare</td>
			<td>GE17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Ultimate 3000 nanoLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii

La nizione proteica è una delle più importanti modifiche post-traduzionali (PTM) sui residui di tirosina e può essere indotta da azioni chimiche di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e specie reattive di azoto (RNS) nelle cellule eucariotiche. L'identificazione precisa dei siti di nitrazione sulle proteine è fondamentale per comprendere i processi fisiologici e patologici correlati alla nitrazione delle proteine, come infiammazione, invecchiamento e cancro. Poiché le proteine netorate sono di scarsa abbondanza nelle cellule anche in condizioni indotte, non sono stati sviluppati metodi universali ed efficienti per la profilazione e l'identificazione di siti di nitrazione proteica. Qui descriviamo un protocollo per l'arricchimento dei nitropeptidi utilizzando una reazione di riduzione chimica e l'etichettatura della biotina, seguita da spettrometria di massa ad alta risoluzione. Nel nostro metodo, i derivati nitropeptici possono essere identificati con alta precisione. Il nostro metodo presenta due vantaggi rispetto ai metodi precedentemente riportati. In primo luogo, l'etichettatura dimetila viene utilizzata per bloccare l'ammina primaria sui nitropeptidi, che può essere utilizzata per generare risultati quantitativi. In secondo luogo, per l'arricchimento viene utilizzato un'obbligazione disulfida contenente reagente NHS-biotina, che può essere ulteriormente ridotta e alchilata per migliorare il segnale di rilevamento su uno spettrometro di massa. Questo protocollo è stato applicato con successo al modello peptide Angiotensin II nel documento attuale.

Il diagramma di flusso per la profilazione nitropeptide in questo manoscritto è illustrato nella Figura 1. Le figure 2, 3, 4 e 5 mostrano gli spettri di massa di Angiotensin II, nitro-Angiotensin II, rispettivamente di dimetilo con etichetta nitro-angiotensin II e amino angiotensin II con l'etichetta digiosina dimetila II. Il peso molecolare del composto può essere riflesso dai valori m/z del picco mono-isotop...

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Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II

La profilazione proteomica delle proteine tirosine-nitrirate è stata una tecnica impegnativa a causa della bassa abbondanza della modifica 3-nitrotyrosine. Qui descriviamo un nuovo approccio per l'arricchimento e la profilazione dei nitropeptidi usando Angiotensin II come modello. Questo metodo può essere esteso per altri sistemi in vitro o in vivo.

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Questo messaggio che può aiutare a rispondere a domande chiave su come arricchire e identificare i nitropeptidi con un approccio chimico e la spettrometria di massa. Questa tecnica ha una maggiore sensibilità per il rilevamento dei nitropeptidi mediante spettrometria di massa e che può essere applicata sia ai sistemi biochimici in vitro che ai tessuti biologici endogeni. Per la desalizzazione nitro-angiotensina II, utilizzare una pipetta millilitro per precondizione di un'estrazione in fase solida in fase inversa o colonna SPE con l'aggiunta di 500 microlitri di metanolo e 500 microlitri di acqua nella parte superiore della colonna.Quando tutta l'acqua ha attraversato la colonna, caricare 410 microlitri di soluzione di nitro-angiotensina II sulla colonna. Lavare la colonna con 500 microlitri di 5%metanolo e acqua e 300 microlitri dell'80% di metanolo e acqua per elutare il nitropeptide. Quindi asciugare l'eluato per vuoto di velocità nell'impostazione predefinita a temperatura ambiente.Per l'alchilazione primaria dell'ammina, ricostituire la nitro-angiotensina II in polvere in 100 microlitri di soluzione di bicarbonato di Trietilammonio da 100 millimolare e aggiungere 400 microlitri di formaldeide al 4% alla soluzione in una cappa fumi con breve miscelazione. Successivamente, aggiungere quattro microlitri di cianoboroidro di sodio molare 0,6 alla soluzione con scuotimento a 400 rotazioni al minuto per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, dissetare la reazione di etichettatura con 16 microlitri di soluzione di ammoniaca all'1% per cinque minuti a temperatura ambiente seguita da acidificazione con otto microlitri di acido formico.Quindi desalt la soluzione in una nuova colonna SPE in fase inversa come appena dimostrato. Per la riduzione della nitrotirosina in amminotirosina, ricostituire la nitro-angiotensina II con etichetta dimetile in 500 microlitri di PBS e aggiungere 10 microlitri di un ditionato di sodio molare per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Dopo la reazione di riduzione, la soluzione gialla diventerà chiara.Desalt il campione ridotto in una nuova colonna SPE in fase inversa, come dimostrato. Per la biotinilazione e l'arricchimento, ricostituire l'amminoangiotensina II a marchio dimetile in 500 microlitri di PBS seguita dall'aggiunta di cinque microlitri di biotina NHS-S-S nanomolare sciolta in solfossido di dimetile per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, dissetare la reazione con un microlitro di idrossilammina al 5% e aggiungere 500 microlitri di PBS fresco a 100 microlitri di perline di agarosio Streptavidin per l'equilibrazione mediante tre centrifugazioni separate.Dopo l'ultima centrifugazione, aggiungere 100 microlitri di perline al sistema di reazione per un'incubazione di un'ora su uno shaker rotativo a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare il sistema quattro volte con 500 microlitri di PBS fresco per lavaggio seguito dall'aggiunta di 400 microlitri di 10 millimolare ditiothreitol per un'incubazione di 45 minuti a 50 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, girare lungo la colonna e trasferire il supernatante in un nuovo tubo contenente 20 microlitri di iodoacetamide molare 0,5 per un'incubazione di 20 minuti al buio.Quindi desalt la soluzione in una nuova colonna SPE in fase inversa come dimostrato e risolvere il peptide secco in 20 microlitri dello 0,1% di acido formico. Per il rilevamento, caricare il prodotto su un cromatografo liquido con uno spettrometro di massa tandem. Separare i peptidi di angiotensina II modificati con un'elusione gradiente di 60 minuti ad una portata di 0,3 microlitri al minuto con il sistema di cromatografia liquida ad altissima pressione che è direttamente interfacciato con lo spettrometro di massa ad alta risoluzione.Nella modalità di acquisizione dipendente dai dati, impostare un singolo spettro di massa di scansione completo nello spettrometro di massa, seguito da 20 scansioni di massa tandem dipendenti dai dati con energia di collisione normalizzata al 28%. Quindi aprire i dati degli spettri di massa e identificare i picchi del prodotto in ogni fase per confermare che la reazione chimica è stata eseguita con successo. Qui si possono osservare spettri di massa rappresentativi di angiotensina II prima e dopo ogni modifica chimica dimostrata.Il peso molecolare del composto è indicato dai valori del rapporto massa-carica del picco mono isotopico, indicando che la modifica chimica sull'angiotensina II è stata raggiunta con successo per quel passo. Qui viene mostrato il prodotto finale rilevato e caratterizzato da cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem. L'analisi quantitativa dei nitropeptidi mediante etichettatura dimetile consente di calcolo delle quantità relative di luce e pesante attraverso il confronto dell'intensità del picco mono isotopico in ciascun gruppo, consentendo la quantificazione dei nitropeptidi arricchiti provenienti da diversi gruppi.Seguendo la procedura, è possibile utilizzare un motore di ricerca del programma come il numero massimo SEQUEST di pFIND per identificare i potenziali nitropeptidi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada all'inizio delle funzioni biologiche di specifici siti di nitrazione.

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