Name: nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00
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この研究は、米国癌学会機関研究助成金IRG-14-195-01(M.シャロンスタックは主任研究者です。X.L.は、サブ受信者調査員です。この出版物は、国立衛生研究所、国立翻訳科学、臨床および翻訳科学賞のグラント番号KL2 TR002530とUL1 TR002529(A.シェカール、PI)からの部分的な支援によって可能になりました。X. L. はインディアナ CTSI KL2 若手研究者賞を受賞しています。S.F.は、基本がん助成金を推進するワルサー癌財団によって支援されています。X.W.は、中国国立自然科学財団(助成第817773047号)の支援を受けています。

1. アンジオテンシンIIの硝化
<ol><li>硝化ペプチドを生成するには、50 μMの最終濃度で390 μL PBS溶液(10mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 7.4)でアンジオテンシンII(DRVYIHPF)親溶液(水中2mM)を希釈します。</li>
	<li>アンジオテンシンII溶液に10 μLのペルオキシニットライト(4.7%NaOHで200mM)を加え、ペルオキシニットライト5mMの最終濃度を作ります。 注:ペルオキシニットライトは、それが酸性の?...

<ol>
	<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+oxidants,+and+protein+tyrosine+nitration.">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+nitration:+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects.">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin,+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin,+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin.">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li><li>Batthy&#225;ny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Nitrated+Proteins:+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects.">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li><li>Feeney, M. B., Sch&#246;neich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration.">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry.">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li><li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins.">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li><li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides.">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li><li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites.">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li><li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins.">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples.">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers.">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li></ol>

ここでのプロトコルは、ニトロペプチド濃縮およびプロファイリングについて説明する。モデルペプチドとしてアンジオテンシンIIを用いて、図1に示す手順を示した。ニトロアンジオテンシンIIを得た後、ペプチド上の一次アミンは、プロトコル内で最も重要なステップの1つであるさらなるアミン結合を避けるためにブロックされるべきである。現在のプロトコルでは?...

3-ニトロチロシンを形成するタンパク質中のチロシン残化の硝化は、多くの生物学的プロセスを調節する。チロシンと3-ニトロチロシンの間の異なる化学的特性のために、硝化されたタンパク質はシグナル伝達活性1、2を乱暴にしてもよい。そのため、タンパク質上の硝化部位を効率的に濃縮・同定できる方法を開発することが重要です。3-ニトロチロシンは、リン酸化やアセチル化などの他の形態のPTMと比較してタンパク質に対する豊富な修飾が低いため、細胞株や組織サンプルから直接内因性の硝化部位を同定することは困難です。それにもかかわらず、ニトロペプチドの断片化パターンを特徴付けるために質量分析(MS)を用いた方法論(例えば、Zhan & Desiderio 3)が開発され、これはニトロプロテオミクスの新しい方法の基礎を築く。
現在、MSに続く濃縮ステップは、ニトロペプチドプロファイリング4、5のための最も強力な戦略です。エンリッチメント メソッドは、2 つのクラスに分類できます。1つのクラスは、3-ニトロチロシンを特異的に認識できる抗体に基づいており、他のクラスは、アミン基4、5にニトロ基を減少させる化学誘導法に基づいている。抗体ベースの方法では、ニトロチロシン親和性カラムが濃縮に使用され、そこから、解離された材料がさらに高分解能MS6、7によって分解および分析される。化学誘導ベースの方法では、ペプチドまたはリジンのN終位におけるアミン基は、アセチル化、相対および絶対定量のための同位体タグ(iTRAQ)、またはタンデム質量タグ(TMT)試薬のいずれかによって最初のステップでブロックされるべきである。次に、ミトロチロシンをアミノチロシンに還元し、続いて新たに形成されたアミン群を改変するためにリデューサを使用し、ビオチンライゲーション、スルフィドリルペプチド変換、または他のタイプのタグ付けシステム8、9、および 10、11.これまでに確立されたプロトコルのほとんどは、内因性硝化タンパク質の代わりに、インビトロの過剰硝化タンパク質に基づいています。
本研究では、ニトロチロシンの化学誘導法の改変手順を、MS検出時の感度向上を示し、定量化目的に適したニトロペプチド濃縮および同定のために開発される。この手法を生物系に用いた最近の研究では、骨髄系抑制細胞(MDSC)から産生されるRNSによるTyr394におけるリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)の硝化が重要な役割を果たしていることを明記した。腫瘍微小環境の免疫抑制12.したがって、我々のニトロペプチド同定の方法は、複雑な生物学的試料にも適用することができる。ここで、フラグメンテーションパターンが知られており、ニトロプロテオミクス研究8、9、10、11で広く使用されているモデルペプチドアンジオテンシンIIを例として我々のプロトコルを説明する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="756">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acclaim pepmap 100 C18 column</td>
			<td style="width:197px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">164534</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">1 M TEAB solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">50% hydroxylamine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formaldehyde-D2</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>F691353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">isoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">NHS-S-S-bition</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Oasis HLB column (10 mg)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">peroxynitrite</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>516620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium cyanoborohydrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42077</td>
			<td>PhamaGrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium dithionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Streptavidin Sepharose</td>
			<td>GE Healcare</td>
			<td>GE17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Ultimate 3000 nanoLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii

タンパク質硝化は、チロシン残基に対する最も重要な翻訳後修飾(PTM)の1つであり、真核細胞における活性酸素種(ROS)および反応性窒素種(RNS)の化学作用によって誘導されうる。タンパク質上の硝化部位の正確な同定は、炎症、老化、癌などのタンパク質硝化に関連する生理学的および病理学的プロセスを理解するために重要です。硝化タンパク質は、誘導条件下でも細胞内の存在量が少ないため、タンパク質硝化部位のプロファイリングと同定のための普遍的かつ効率的な方法は開発されていません。ここでは、化学還元反応とビオチン標識を用いてニトロペプチド濃縮のためのプロトコルを説明し、続いて高分解能質量分析を行う。我々の方法では、ニトロペプチド誘導体を高精度で同定することができる。我々の方法は、以前に報告された方法と比較して2つの利点を示す。まず、ジメチル標識は、ニトロペプチド上の一次アミンをブロックするために使用され、定量的な結果を生成するために使用することができます。第二に、NHS-ビオチン試薬を含むジスルフィド結合が濃縮に使用され、質量分析計上の検出信号を増強するためにさらに低減およびアルキル化することができる。このプロトコルは、現在の論文においてモデルペプチドアンジオテンシンIIに正常に適用されている。

この原稿におけるニトロペプチドプロファイリングのフローチャートを図1に示す。図2、3、4および5は、アンジオテンシンII、ニトロ−アンジオテンシンII、ジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIおよびジメチル標識アミノアンジオテンシンIIの質量スペクトルを示す。 化合物の分子量は、各図におけるモノ...

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Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

アンジオテンシンIIによるニトロペプチドプロファイリングと同定

チロシン硝化タンパク質のプロテオミックプロファイリングは、3-ニトロチロシン修飾の低い存在性のために挑戦的な技術であった。ここでは、アンジオテンシンIIをモデルにしたニトロペプチド濃縮とプロファイリングに対する新しいアプローチについて述べた。この方法は、他のインビトロまたはインビボシステムに拡張することができます。

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

化学アプローチと質量分析によってニトロペプチドを濃縮し同定する方法についての重要な質問に答えることができるこのメッセージ。この技術は、質量分析法によってニトロペプチドを検出するための高められた感受性を有し、それはインビトロ生化学系および内因性生物学的組織の両方に適用することができる。ニトロアンジオテンシンII脱塩の場合、1ミリリットルのピレットを使用して、メタノール500マイクロリットルと500マイクロリットルの水をカラムの上部に添加して、逆相固相抽出またはSPEカラムを予調します。すべての水がカラムを通り抜けたら、410マイクロリットルのニトロアンジオテンシンII溶液をカラムに積み込みます。5%メタノールと水の500マイクロリットルと80%メタノールと水の300マイクロリットルでカラムを洗浄し、ニトロペプチドを溶出させます。その後、室温でデフォルト設定で真空速度で溶出物を乾燥させます。一次アミンアルキル化の場合、粉末ニトロアンジオテンシンIIを100ミリモルトリエチランモニウム重炭酸塩溶液100マイクロリットルで再構成し、4%ホルムアルデヒドの400マイクロリットルをヒュームフードに加えて、短い混合を行う。次に、0.6モルのシアノ水素化ナトリウムを4マイクロリットル加え、室温で1時間毎分400回転で振る。インキュベーションの終了時に、16マイクロリットルの1%アンモニア溶液を室温で5分間焼き付け、続いて8マイクロリットルのギ酸で酸性化します。次に、ちょうど示したように、新しい逆相SPE列で溶液を脱塩します。ニトロチロシンからアミノチロシンへの還元のために、ジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIをPBSの500マイクロリットルで再構成し、10マイクロリットルのモルルナトリウムジチオン酸を室温で1時間インキュベートする。還元反応後、黄色の溶液が明らかになります。デモに示すように、新しい逆相SPEカラムで還元サンプルを脱塩します。ビオチン化および濃縮のために、ジメチル標識アミノアンジオテンシンIIを500マイクロリットルのPBSで再構成し、続いて40ナノモルNHS-Sビオチンをジメチルスルホキシドに溶解した5マイクロリットルを室温で2時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、5%ヒドロキシラミンの1マイクロリットルで反応をクエンチし、3つの別々の遠心分離によって平衡化するためにストレプトアビジンアガロースビーズの100マイクロリットルに新鮮なPBSの500マイクロリットルを追加します。最後の遠心分離の後、室温でロータリーシェーカーに1時間インキュベーションを行い、反応系に100マイクロリットルのビーズを加えます。インキュベーションの最後に、1回の洗浄ごとに500マイクロリットルの新鮮なPBSでシステムを4回洗浄し、続いて摂氏50度で45分間のインキュベーションに10ミリモルジチオトレイトールを400マイクロリットル添加します。インキュベーションの終わりに、カラムをスピンダウンし、20マイクロリットルの0.5モルヨウアセトアセトアミドを含む新しいチューブに上清を移し、暗闇の中で20分間インキュベーションします。次に、新しい逆相SPEカラムで溶液を脱塩し、乾燥ペプチドを0.1%のギク酸の20マイクロリットルで分解します。検出のために、タンデム質量分析計を用いて液体クロマトグラファーに製品をロードします。高分解能質量分析計と直接インターフェースするナノ高圧液体クロマトグラフィーシステムにより、変性アンジオテンシンIIペプチドを毎分0.3マイクロリットルの流量で60分の勾配輝度で分離します。データ依存型取得モードでは、質量分析計に単一のフルスキャン質量スペクトルを設定し、続いて28%正規化された衝突エネルギーで20のデータ依存タンデム質量分析計スキャンを行います。次に質量スペクトルデータを開き、各工程で生成物のピークを特定し、化学反応が正常に行われたことを確認します。ここで、アンジオテンシンIIの代表的な質量スペクトルは、実証された各化学修飾の前後に観察できる。化合物の分子量はモノ同位体ピークの質量電荷比値で示され、アンジオテンシンIIに対する化学修飾がそのステップに対して正常に達成されたことを示す。ここで、タンデム質量分析を用いた液体クロマトグラフィーによって検出され特徴付けられる最終生成物が示されている。ジメチル標識によるニトロペプチドの定量的分析は、各群におけるモノ同位体ピークの強度の比較を通じて、軽くて重い量の相対的量を計算することを可能にし、異なる群からの濃縮されたニトロペプチドの定量を可能にする。手順に従って、潜在的なニトロペプチドを識別するために、pFINDのSEQUESTの最大カウントなどのプログラム検索エンジンを使用することができます。開発後、この技術は、特定のニトレーション部位の生物学的機能の開始への道を開いた。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

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Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

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リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

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サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

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(CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定

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免疫ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光法を用いて成体ゼブラフィッシュにおけるオレキシンおよびエンドカンナビノイド受容体の同定

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ハイスループットプリマゼプロファイリングを用いたDNAプリマゼによるDNA配列認識

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クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

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