Name: nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela American Cancer Society institucional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack é investigador principal; X.L. é um investigador subdestinatário). Esta publicação foi possível com apoio parcial de Grant Numbers KL2 TR002530 e UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) dos institutos nacionais de saúde, centro nacional para o avanço das Ciências translacionais, prêmio de ciências clínicas e translacionais. X. L. é um receptor de Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. é apoiado pela Walther Cancer Foundation avançando subsídios de câncer básico. X. W. é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China programa geral (Grant no. 817773047).

1. nitorização da angiotensina II
<ol><li>Para gerar peptídeo nitrado, diluir 10 μL de solução-mãe de angiotensina II (DRVYIHPF) (2 mM em água) em 390 μL de solução de PBS (10 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,4) na concentração final de 50 μm.</li>
	<li>Adicionar 10 μL de peroxinitrito (200 mM em 4,7% NaOH) à solução de angiotensina II para fazer a concentração final de peroxinitrito 5 mM. Nota: o peroxinitrito é instável e fácil de resolver quando está na forma ácida, ass...

<ol>
	<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+oxidants,+and+protein+tyrosine+nitration.">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+nitration:+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects.">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin,+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin,+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin.">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li><li>Batthy&#225;ny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Nitrated+Proteins:+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects.">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li><li>Feeney, M. B., Sch&#246;neich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration.">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry.">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li><li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins.">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li><li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides.">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li><li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites.">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li><li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins.">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples.">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers.">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li></ol>

O protocolo aqui descreve o enriquecimento e o perfilamento do nitropeptídeo. Utilizando-se a angiotensina II como peptídeo modelo, ilustramos o procedimento mostrado na Figura 1. Após a obtenção da nitro-angiotensina II, a amina primária no peptídeo deve ser bloqueada para evitar a conjugação de amina, que é uma das etapas mais críticas dentro do protocolo. No protocolo atual, a rotulagem de dimetil é usada para bloquear as aminas primárias por dois motivos: primeiro, possibili...

A nitração de resíduos de tirosina em proteínas para formar 3-nitrotirosina regula muitos processos biológicos. Devido às diferentes propriedades químicas entre tirosina e 3-nitrotirosina, uma proteína nitrada pode ter perturbado a atividade de sinalização1,2. Conseqüentemente, é importante desenvolver os métodos que podem enriquecer e identificar locais da nitração em proteínas eficientemente. Como 3-nitrotirosina é uma modificação de baixa abundância em proteínas em comparação com outras formas de PTM, como fosforilação e acetilação, é desafiador para identificar locais de nitração endógena diretamente de linhas celulares ou amostras de tecido. No entanto, a metodologia de uso de espectrometria de massas (MS) para caracterizar o padrão de fragmentação do nitrotpeptídeo foi desenvolvida (por exemplo, Zhan & Desiderio3), que estabelece a base para novos métodos de nitroproteômica.
Atualmente, uma etapa de enriquecimento seguida por MS é a estratégia mais poderosa para o perfilamento de nitropeptídeos4,5. Os métodos de enriquecimento podem ser classificados em duas classes. Uma classe é baseada em anticorpos que podem reconhecer a 3-nitrotirosina especificamente, enquanto que a outra classe é baseada na derivação química que reduz um grupo nitro para um grupo de amina4,5. Para o método baseado em anticorpos, a coluna de afinidade com nitrotirosina é utilizada para o enriquecimento, a partir do qual o material eluído é ainda mais resolvido e analisado por MS6,7de alta resolução. Para o método baseado na derivação química, os grupos de amina no N-Terminus do peptídeo ou lisina devem ser bloqueados no primeiro passo, quer por acetilação, Tags isobáricas para a quantificação relativa e absoluta (iTRAQ), ou tag de massa em tandem (TMT) reagentes. Em seguida, um redutor é usado para reduzir a nitrotirosina à aminotirosina seguida modificando o grupo recentemente formado da amina, que inclui a ligadura da biotina, a conversão do peptide do sulfidrilo, ou outros tipos de sistemas de etiquetagem8,9, 10,11. A maioria dos protocolos estabelecidos até agora baseiam-se em proteínas em excesso nitradas in vitro , em vez de proteínas endogenamente nitradas.
No presente estudo, um procedimento modificado da derivação química da nitrotirosina é desenvolvido para o enriquecimento e identificação do nitropeptídeo, o que mostra maior sensibilidade durante a detecção de SM e é adequado para fins de quantificação. Nosso estudo recente que emprega este método nos sistemas biológicos identificou que o nitração da proteína tirosina-quinase lymphocyte-específica (lck) em Tyr394 por RNS produziu das pilhas Myeloid-derivadas do supressor (mdscs) joga um papel importante no imunossupressão do microambiente do tumor12. Conseqüentemente, nosso método da identificação do nitropeptide pode ser aplicado às amostras biológicas complexas também. Aqui, nós descrevemos nosso protocolo usando o peptide modelo angiotensina II, de que o teste padrão da fragmentação é sabido e amplamente utilizado em estudos nitroproteomic8,9,10,11, como um exemplo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="756">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acclaim pepmap 100 C18 column</td>
			<td style="width:197px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">164534</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">1 M TEAB solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">50% hydroxylamine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formaldehyde-D2</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>F691353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">isoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">NHS-S-S-bition</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Oasis HLB column (10 mg)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">peroxynitrite</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>516620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium cyanoborohydrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42077</td>
			<td>PhamaGrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium dithionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Streptavidin Sepharose</td>
			<td>GE Healcare</td>
			<td>GE17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Ultimate 3000 nanoLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii

A nitração proteica é uma das mais importantes modificações pós-translacionais (PTM) sobre os resíduos de tirosina e pode ser induzida por ações químicas de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS) em células eucarióticas. A identificação precisa dos sítios de nitorização nas proteínas é crucial para a compreensão dos processos fisiológicos e patológicos relacionados à nitração proteica, como inflamação, envelhecimento e câncer. Desde que as proteínas sulfonados são da baixa abundância nas pilhas mesmo circunstâncias induzidas, nenhuns métodos universais e eficientes foram desenvolvidos para o perfilamento e a identificação de locais da nitração da proteína. Aqui nós descrevemos um protocolo para o enriquecimento do nitropeptide usando uma reação da redução química e a rotulagem da biotina, seguidas pela espectrometria maciça de alta resolução. Em nosso método, os derivados de nitropeptídeos podem ser identificados com alta precisão. Nosso método exibe duas vantagens em comparação com os métodos relatados anteriormente. Primeiro, a rotulagem de dimetil é usada para bloquear a amina primária em nitropeptídeos, que podem ser usados para gerar resultados quantitativos. Em segundo, uma ligação do dissulfeto que contem o reagente de NHS-biotina é usada para o enriquecimento, que pode mais ser reduzido e alquilados para realçar o sinal da deteção em um espectrómetro maciço. Este protocolo foi aplicado com sucesso ao peptide modelo angiotensina II no papel atual.

O fluxograma para o perfilamento de nitropeptídeos neste manuscrito é mostrado na Figura 1. A Figura 2, 3, 4 e 5 mostram os espectros de massa da angiotensina II, Nitro-angiotensina II, dimetil rotulado Nitro-angiotensina II e dimetil rotulado amino angiotensina II, respectivamente. O peso molecular do composto pode ser refletido pelos valores de m/z do pico do mono-isótopo em cada figura, indicando que a mod...

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Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II

O perfilamento Proteomic de proteínas tyrosine-nitrated foi uma técnica desafiante devido à baixa abundância da modificação da 3-nitrotyrosine. Aqui nós descrevemos uma aproximação nova para o enriquecimento e o perfilamento do nitropeptide usando a angiotensina II como o modelo. Este método pode ser estendido para outros sistemas in vitro ou in vivo .

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Esta mensagem que pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como enriquecer e identificar nitropeptídeos por uma abordagem química e a espectrometria de massa. Esta técnica tem uma sensibilidade aprimorada para detectar nitropeptídeos por espectrometria de massa e que pode ser aplicada tanto a sistemas bioquímicos in vitro quanto a tecidos biológicos endógenos. Para desalar nitro-angiotensin II, use um pipet de um mililitro para pré-condição de extração em fase sólida de fase inversa ou coluna SPE com a adição de 500 microliters de metanol e 500 microliters de água no topo da coluna.Quando toda a água passar pela coluna, carregue 410 microliters de solução nitro-angiotensina II na coluna. Lave a coluna com 500 microlitadores de 5%de metanol e água e 300 microliters de 80% de metanol e água para elutar o nitropeptídeo. Em seguida, seque o elunato por vácuo de velocidade na configuração padrão à temperatura ambiente.Para a amitomina primária, reconstitua o nitro-angiotensin II em pó em 100 microliters de 100 milimosinas solução de bicarbonato de trietilamônio e adicione 400 microliters de 4% de formaldeído à solução em um capô de fumaça com breve mistura. Em seguida, adicione quatro microliters de 0,6 cianoboroidride de sódio molar à solução com agitação a 400 rotações por minuto durante uma hora em temperatura ambiente. Ao final da incubação, sacie a reação de rotulagem com 16 microliters de solução de 1%amônia por cinco minutos à temperatura ambiente, seguida pela acidificação com oito microliters de ácido fórmico.Em seguida, desaltar a solução em uma nova coluna DE FASE INVERSA SPE como apenas demonstrado. Para a nitrotilrose para a redução da aminotyrosina, reconstitua a nitro-angiotensina i em 500 microlitros de PBS e adicione 10 microlitros de um dithionato de sódio molar para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. Após a reação de redução, a solução amarela ficará clara.Desaltar a amostra reduzida em uma nova coluna DE SPE de fase inversa, como demonstrado. Para biotinylação e enriquecimento, reconstitua a aminoangiotensina i em 500 microlitrais de PBS seguida pela adição de cinco microlitadores de 40 biotinas nanomolar NHS-S-S dissolvidas em sulfóxido de dimetil para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente. No final da incubação, sacie a reação com um microliter de 5% de hidroxilamina e adicione 500 microliters de PBS fresco a 100 microliters de Contas Streptavidin Agarose para o equilíbrio por três centrífugas separadas.Após a última centrifugação, adicione 100 microliters de contas ao sistema de reação para uma incubação de uma hora em um Shaker Rotativo à temperatura ambiente. No final da incubação, lave o sistema quatro vezes com 500 microliters de PBS fresco por lavagem seguido pela adição de 400 microliters de 10 milimolar dithiothreitol para uma incubação de 45 minutos a 50 graus Celsius. No final da incubação, gire a coluna e transfira o supernante para um novo tubo contendo 20 microliters de 0,5 iodoacetamida molar para uma incubação de 20 minutos no escuro.Em seguida, deságua a solução em uma nova coluna SPE de fase inversa como demonstrado e resolver o peptídeo seco em 20 microliters de ácido fórmico de 0,1%. Para detecção, carregue o produto em um cromatógrafo líquido com um espectrômetro de massa tandem. Separe os peptídeos de angiotensina II modificados por uma elusão gradiente de 60 minutos a uma taxa de fluxo de 0,3 microliters por minuto com o sistema de cromatografia líquida de nano-alta pressão que é diretamente interfaceado com o espectrômetro de massa de alta resolução.No modo de aquisição dependente de dados, defina um único espectro de massa de varredura total no espectrômetro de massa, seguido por 20 varreduras de espectrômetro de massa tandem dependentes de dados a 28% de energia de colisão normalizada. Em seguida, abra os dados de espectro de massa e identifique os picos do produto em cada etapa para confirmar que a reação química foi realizada com sucesso. Aqui, podem ser observados espectros de massa representativos de angiotensina II antes e depois de cada modificação química como demonstrado.O peso molecular do composto é indicado pelos valores da razão massa-carga do pico do mono isótopo, indicando que a modificação química na angiotensina II foi alcançada com sucesso para essa etapa. Aqui, mostra-se o produto final detectado e caracterizado pela cromatografia líquida com espectrometria de massa tandem. A análise quantitativa dos nitropeptídeos por rotulagem de dimetila permite o cálculo das quantidades relativas de leve e pesado através da comparação da intensidade do pico de monoistoposo em cada grupo, permitindo a quantificação dos nitropeptídeos enriquecidos de diferentes grupos.Após o procedimento, você pode usar um mecanismo de busca de programa, como a contagem máxima de pFIND de SEQUEST para identificar os potenciais nitropeptídeos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o início das funções biológicas de sítios específicos de nitração.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

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Bioquímica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

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Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

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