Name: nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack es Investigador Principal; X.L. es un investigador subreceptor). Esta publicación fue posible gracias al apoyo parcial de Grant Numbers KL2 TR002530 y UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) de los Institutos Nacionales de Salud, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. es galardonado con el Premio Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. cuenta con el apoyo de las subvenciones Walther Cancer Foundation Advancing Basic Cancer. X. W. cuenta con el apoyo del Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 817773047).

1. Nitration of Angiotensin II
<ol><li>Para generar solución primaria de péptido nitrado, diluir 10 ml de solución padre de angiotensina II (DRVYIHPF) (2 mM en agua) en una solución de PBS de 390 ml (10 mM NaH2PO4,150 mM naCl, pH 7.4) a la concentración final de 50 oM.</li>
	<li>Añadir 10 l de peroxinitrita (200 mM en 4,7% NaOH) a la solución de Angiotensina II para realizar la concentración final de peroxinitrita de 5 mM. NOTA: La peroxinitrita es inestable y fácil de resolver cuando ...

<ol>
	<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+oxidants,+and+protein+tyrosine+nitration.">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+nitration:+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects.">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin,+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin,+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin.">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li><li>Batthy&#225;ny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Nitrated+Proteins:+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects.">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li><li>Feeney, M. B., Sch&#246;neich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration.">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry.">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li><li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins.">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li><li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides.">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li><li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites.">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li><li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins.">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples.">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers.">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li></ol>

El protocolo aquí describe el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos. Utilizando Angiotensin II como péptido modelo, ilustramos el procedimiento que se muestra en la Figura1. Después de obtener la nitro-angiotensina II, la amina primaria en el péptido debe bloquearse para evitar la conjugación de amina adicional, que es uno de los pasos más críticos dentro del protocolo. En el protocolo actual, el etiquetado de dimetil según se utiliza para bloquear las aminas primarias por do...

La nitración de residuos de tirosina en proteínas para formar 3-nitrotirosina regula muchos procesos biológicos. Debido a las diferentes propiedades químicas entre tirosina y 3-nitrotirosina, una proteína nitrada puede haber perturbado la actividad de señalización1,2. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos que puedan enriquecer e identificar los sitios de nitración en las proteínas de manera eficiente. Como la 3-nitrotirosina es una modificación de baja abundancia en las proteínas en comparación con otras formas de PTM, como la fosforilación y la acetilación, es difícil identificar los sitios de nitración endógenas directamente a partir de líneas celulares o muestras de tejido. Sin embargo, se ha desarrollado la metodología de uso de espectrometría de masas (Em) para caracterizar el patrón de fragmentación del nitrotpéptido (por ejemplo, Zhan & Desiderio3), que sienta las bases para nuevos métodos de nitroproteómica.
Actualmente, un paso de enriquecimiento seguido por la EMes la estrategia más poderosa para el perfilado de nitropéptidos 4,5. Los métodos de enriquecimiento se pueden clasificar en dos clases. Una clase se basa en anticuerpos que pueden reconocer 3-nitrotirosina específicamente, mientras que la otra clase se basa en la derivación química que reduce un grupo de nitro a un grupo de aminas4,5. Para el método basado en anticuerpos, la columna de afinidad de nitrotyrosina se utiliza para el enriquecimiento, a partir del cual el material eludado se resuelve y analiza más adelante por la alta resolución MS6,7. Para el método basado en derivación química, los grupos de amina en el N-terminus del péptido o lisina deben ser bloqueados en el primer paso ya sea por acetilación, etiquetas isobáricas para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ), o reactivos de etiquetas de masa en tándem (TMT). A continuación, se utiliza un reductor para reducir la nitrotirosina a la aminotyrosina seguido de la modificación del grupo de aminas recién formado, que incluye ligadura de biotina, conversión de péptido sulfícula u otros tipos de sistemas de etiquetado8,9, 10,11. La mayoría de los protocolos establecidos hasta ahora se basan en proteínas con sobrenitrato in vitro, en lugar de proteínas nitratos endógenas.
En el presente estudio, se desarrolla un procedimiento modificado de derivación química de nitrotirosina para el enriquecimiento e identificación de nitropéptidos, que muestra una mayor sensibilidad durante la detección de LA MS y es adecuado para fines de cuantificación. Nuestro estudio reciente que emplea este método en sistemas biológicos identificó que la nitración de la tetirosina quinasa de proteína específica de linfocitos (LCK) en Tyr394 por RNS producido a partir de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) juega un papel importante en el inmunosupresión del microambiente tumoral12. Por lo tanto, nuestro método de identificación de nitropéptidos también se puede aplicar a muestras biológicas complejas. Aquí, describimos nuestro protocolo utilizando el péptido modelo Angiotensin II, del cual el patrón de fragmentación es conocido y ampliamente utilizado en estudios nitroproteómicos8,9,10,11, como ejemplo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="756">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acclaim pepmap 100 C18 column</td>
			<td style="width:197px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">164534</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">1 M TEAB solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">50% hydroxylamine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formaldehyde-D2</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>F691353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">isoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">NHS-S-S-bition</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Oasis HLB column (10 mg)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">peroxynitrite</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>516620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium cyanoborohydrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42077</td>
			<td>PhamaGrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium dithionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Streptavidin Sepharose</td>
			<td>GE Healcare</td>
			<td>GE17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Ultimate 3000 nanoLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii

La nitración proteica es una de las modificaciones post-traduccionales más importantes (PTM) en residuos de tirosina y puede ser inducida por acciones químicas de especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS) en células eucariotas. La identificación precisa de los sitios de nitración en las proteínas es crucial para comprender los procesos fisiológicos y patológicos relacionados con la nitración de proteínas, como la inflamación, el envejecimiento y el cáncer. Dado que las proteínas nitradas son de baja abundancia en células incluso en condiciones inducidas, no se han desarrollado métodos universales y eficientes para la elaboración de perfiles e identificación de sitios de nitración proteica. Aquí describimos un protocolo para el enriquecimiento de nitropéptidos mediante el uso de una reacción de reducción química y etiquetado de biotina, seguido de espectrometría de masas de alta resolución. En nuestro método, los derivados de nitropéptidos se pueden identificar con alta precisión. Nuestro método exhibe dos ventajas en comparación con los métodos reportados anteriormente. En primer lugar, el etiquetado de dimetil se utiliza para bloquear la amina primaria en nitropéptidos, que se puede utilizar para generar resultados cuantitativos. En segundo lugar, se utiliza un enlace de disulfuro que contiene reactivo de biotina NHS para el enriquecimiento, que se puede reducir y alquilar aún más para mejorar la señal de detección en un espectrómetro de masas. Este protocolo se ha aplicado con éxito al péptido modelo Angiotensin II en el documento actual.

El diagrama de flujo para la elaboración de perfiles de nitropéptidos en este manuscrito se muestra en la Figura1. Las figuras 2, 3, 4 y 5 muestran los espectros de masa de Angiotensina II, nitro-angiotensina II, dimetil etiquetado nitro-angiotensina II y dimetil etiquetado como amino angiotensina II, respectivamente. El peso molecular del compuesto puede reflejarse en los valores m/z del pico mono-isótopo en...

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Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfilado e identificación de nitropéptidos ilustrados por Angiotensin A II

El perfilado proteómico de las proteínas nitratodeadas por tirosina ha sido una técnica desafiante debido a la baja abundancia de la modificación de 3-nitrotirosina. Aquí describimos un enfoque novedoso para el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos mediante el uso de Angiotensin II como modelo. Este método se puede extender para otros sistemas in vitro o in vivo.

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Este mensaje puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo enriquecer e identificar los nitropéptidos mediante un enfoque químico y la espectrometría de masas. Esta técnica tiene una sensibilidad mejorada para detectar nitropéptidos por espectrometría de masas y que se puede aplicar tanto a los sistemas bioquímicos in vitro como a los tejidos biológicos endógenos. Para la desalado de nitro-angiotensina II, utilice una pipeta de un mililitro para precondicionar una extracción en fase inversa de fase sólida o columna SPE con la adición de 500 microlitros de metanol y 500 microlitros de agua en la parte superior de la columna.Cuando toda el agua haya pasado por la columna, cargue 410 microlitros de solución de nitro-angiotensina II en la columna. Lavar la columna con 500 microlitros de 5% metanol y agua y 300 microlitros de 80% metanol y agua para eluir el nitropéptido. A continuación, seque el eluido por vacío de velocidad en el ajuste predeterminado a temperatura ambiente.Para la alquilación de amina primaria, reconstituir la nitro-angiotensina II en polvo en 100 microlitros de 100 mililitros de solución de bicarbonato de trietilammonio y añadir 400 microlitros de 4% de formaldehído a la solución en una campana de humo con una breve mezcla. A continuación, agregue cuatro microlitros de 0,6 molar de cianoborohidruro sódico a la solución con agitación a 400 rotaciones por minuto durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, apagar la reacción de etiquetado con 16 microlitros de 1% solución de amoníaco durante cinco minutos a temperatura ambiente seguido de acidificación con ocho microlitros de ácido fórmico.A continuación, desalque la solución en una nueva columna SPE de fase inversa como se acaba de demostrar. Para la reducción de nitrotirosina a aminotirosina, reconstituir la nitro-angiotensina II con etiqueta dimetil en 500 microlitros de PBS y añadir 10 microlitros de un ditionato de sodio molar durante una incubación de una hora a temperatura ambiente. Después de la reacción de reducción, la solución amarilla se aclarará.Desalto la muestra reducida en una nueva columna SPE de fase inversa como se ha demostrado. Para la biotinilación y el enriquecimiento, reconstituya la aminoangiotensina II con dimetil-etiqueta en 500 microlitros de PBS seguida de la adición de cinco microlitros de 40 nanomolares NHS-S-S biotina disueltos en dimetil sulfóxido durante una incubación de dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, apagar la reacción con un microlitro de 5%hidroxiamina y añadir 500 microlitros de PBS fresco a 100 microlitros de Streptavidin Agarose perlas para el equilibrio por tres centrifugaciones separadas.Después de la última centrifugación, añadir 100 microlitros de cuentas al sistema de reacción durante una hora de incubación en un agitador rotativo a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave el sistema cuatro veces con 500 microlitros de PBS frescos por lavado seguido de la adición de 400 microlitros de 10 ditiothreitol militrolares para una incubación de 45 minutos a 50 grados centígrados. Al final de la incubación, gire hacia abajo la columna y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo que contenga 20 microlitros de 0,5 yodoacetamida molar para una incubación de 20 minutos en la oscuridad.A continuación, desalcar la solución en una nueva columna SPE de fase inversa como se ha demostrado y resolver el péptido seco en 20 microlitros de 0,1%ácido fórmico. Para la detección, cargue el producto en un cromatógrafo líquido con un espectrómetro de masas en tándem. Separe los péptidos modificados de angiotensina II por un elusión de gradiente de 60 minutos a un caudal de 0,3 microlitros por minuto con el sistema de cromatografía líquida de nano alta presión que está directamente interconectado con el espectrómetro de masas de alta resolución.En el modo de adquisición dependiente de datos, establezca un único espectro de masa de escaneo completo en el espectrómetro de masas, seguido de 20 escaneos de espectrómetro de masa en tándem dependientes de datos con un 28% de energía de colisión normalizada. A continuación, abra los datos de espectros de masa e identifique los picos del producto en cada paso para confirmar que la reacción química se ha realizado con éxito. Aquí, se pueden observar espectros de masa representativos de angiotensina II antes y después de cada modificación química como se ha demostrado.El peso molecular del compuesto está indicado por los valores de relación masa-carga del pico de isótopo mono, lo que indica que la modificación química de la angiotensina II se logró con éxito para ese paso. Aquí, se muestra el producto final tal como se detecta y se caracteriza por cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem. El análisis cuantitativo de los nitropéptidos mediante dimetil-etiquetado permite calcular las cantidades relativas de luz y pesadas a través de la comparación de la intensidad del pico de isótopos mono en cada grupo, permitiendo la cuantificación de los nitropéptidos enriquecidos de diferentes grupos.Siguiendo el procedimiento, puede utilizar un motor de búsqueda de programas como el recuento máximo SEQUEST de pFIND para identificar los nitropéptidos potenciales. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para el inicio de las funciones biológicas de sitios específicos de nitración.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Investigación

Bioquímica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

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Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

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Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

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High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Perfiles de Complexome de Alta Resolución por Cryoslicing BN-MS Analysis

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