6.6K Views
•
11:12 min
•
April 11th, 2019
DOI :
April 11th, 2019
•0:04
Title
1:16
Bone Harvest
2:26
Bone Marrow Cell Extraction
3:16
Bone Marrow Recipient Reconstitution
4:48
Popliteal Lymph Node Labelling and Harvest
6:54
Single Splenic Germinal Center Identification
8:43
Results: Representative Germinal Center Photoactivation
10:19
Conclusion
Transcript
Denne fysiologisk relevante kimære model af spontane autoreaktive germinal centre giver mulighed for sammenkædning af cellulære lokalisering in vivo med downstream molekylære analyser. Den største fordel ved den blandede kimære model af autoreaktive germinal centre er dens alsidige og marginale karakter, så forhør af stort set alle ønskede cellulære delmængde eller molekylære vej. Den fysiologiske relevans af denne model for autoimmun sygdom udvikling muliggør nye indsigter, der kan støtte udviklingen af nye behandlingsformer.
Denne knoglemarvs kimær model kan bruges i immunologi, immun-onkologi, og stamcelleforskning. Fotoaktivationskomponenten har bred brug, da den forbinder vævs lokalisering med downstream-celleanalyse. Knoglemarv forberedelse og rekonstitution og in vivo mærkning og væv explantation skridt er alle teknisk komplekse procedurer, der egner sig godt til visuelle demonstrationer.
For at udtrække donor 564Igi mus lårben og skinneben, fjerne huden fra den ene baglem, og pop ud knæ og ankel leddene ved at trække på foden kraftigt. Fortsæt med at bryde ankelleddet. Derefter trække foden mod kroppen, mens du holder på skinnebenet, og dermed stripning sener og muskler fra skinnebenet.
Bryd knæleddet for at frigøre skinnebenet, og træk knoglen mod kroppen, mens du holder på lårbenet for at fratage sener og muskler fra lårbenet. Derefter lave et snit på hofteleddet, og skær sener, før du trækker lårbenet ud af hoftestikket. Efter fjernelse af kontralaterale bagben knogler på en lignende måde, forsigtigt gnide knoglerne med en grov køkkenrulle til at fjerne eventuelle resterende muskel og bindevæv, og skyl de strippede knogler i iskold knoglemarvsbuffer.
Brug derefter Dumont nummer syv-kraftæcesiner til at overføre knoglerne til en beholder med frisk knoglemarvsbuffer på is. For at udtrække knoglemarvscellerne skylles en mørtel i iskold knoglemarvsbuffer, og der anvendes en 10-milliliter serologisk pipette til at erstatte vaskebufferen med 10 milliliter frisk, iskold knoglemarvsbuffer. Brug scet til at overføre knoglerne til mørtel, og bruge en støder til at knuse og male knoglerne til at frigive knoglemarven.
Brug 10-milliliterpipetten til at opsamle knoglemarvsekstraktet, før knoglemarvsopløsningen overføres gennem en 70-mikrometercellestiren i et 50 milliliter konisk rør på is. Skyl derefter mørtelen med yderligere 10 milliliter frisk, iskold knoglemarvsbuffer for at sikre en fuldstændig genopretning af cellerne. For at forberede donorsuspensionerne blandes de relevante mængder fotoaktivgørbar GFP og 564Igi donormarv i et 50-milliliter konisk rør, og cellerne pelleteres ved centrifugering.
Ophæld den blandede cellepille i en koncentration på en gang 10 til de otte celler pr. milliliter iskold knoglemarvsbuffer, og overfør cellerne til et forcooleret mikrocentratørrør på 1,5 milliliter på is. Dernæst bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids i bedøvet CD45.1 modtager mus, og svirp røret af donor knoglemarvsceller for at sikre en passende resuspension. Læg 200 mikroliter knoglemarvsblanding i en 0,3-milliliter, 30-gauge insulinsprøjt, og med modtageren på sin side, forsigtigt strække huden over og under øjet til lidt pop øjet ud.
Sæt forsigtigt spidsen af sprøjten i en omtrentlig 30 graders vinkel ind i den forreste del af øjenhulen, idet du skal passe på at undgå øjet og det omgivende væv. Når spidsen af nålen rører knoglen understreger øjenhulen, trække nålen omkring 0,5 millimeter, før du bruger konstant tryk til langsomt injicere donor knoglemarven. Derefter returnere musen til sit bur med ad libitum antibiotika vand, med overvågning, indtil fuld helbredelse.
For at mærke popliteal lymfeknuden, fortyndes to mikroliter af phycoerythrin-mærket rotte anti-mus CD169 antistof i 18 mikroliter PBS, og tilsæt to 10-mikroliter dråber af antistoffet på et stykke plast paraffin film. Ilæg hver dråbe i en enkelt 0,3-milliliter insulinsprøjte med en 30-gauge nål, og indsprøjt 10 mikroliter antistof i fodpladen på det bedøvede recipientdyr. Før høst lymfeknuden, placere en firkantet coverslip på en flad overflade, og bruge en vakuum fedt-loaded, fem-milliliter sprøjte til at spore kanterne af dækslæbet med fedt omkring en til to millimeter fra hver kant.
Overfør kammeret til en kold, flad overflade, og fyld vakuumfedtkammeret med iskold knoglemarvsbuffer. For at få adgang til popliteal lymfeknuder, bruge lige, fine saks til at foretage et snit i huden lige under knæet pit af aflivede modtager dyr, og udvide snittet opad langs forstrækning-linje næsten til hofteleddet. Brug Dumont nummer fem eller nummer syv kraftforladelser, trække hver af de udsatte flapper af huden udad for at udsætte vævet i popliteal fossa, og bruge de vicesser til omhyggeligt at indtaste fossa bare mediale til popliteal vene.
Åbn og luk aksen langs benets akse for at eksponere den underliggende popliteal lymfeknude, før du bruger tommel- og pegefingeren til at klemme quadricepsmusklen fra forsiden proksimale til knæet for at poppe lymfeknuden ud af fossa. Skub skrænt under lymfeknuden for at frigøre noden fra det omgivende væv, og læg den i vakuumfedtkammeret. Efter den anden lymfeknude er blevet indsamlet, skal du placere en anden dækslæb på vakuumfedtfælgen, og tryk forsigtigt ned for at lukke kammeret, idet du skal passe på at ekstrudere alle luftboblerne.
For at identificere de spirende centre i høstede milt vævsprøver, placere billeddannelse kammer på scenen af en to-foton fluorescerende mikroskop, og bruge en 3,5-milliliter plast overførsel pipette til at placere en dråbe destilleret vand på toppen af den øverste coverslip. Sænk målet indtil kontaktpunktet, og brug det transmitterede lys til at fokusere på toppen af vævet. Skift til mørk tilstand og to-foton excitation, og tune laseren til 940 nanometer.
Lokalisere de enkelte hvid-pulp områder omkranset af CD169 farvning nær overfladen af vævet, og identificere periarteriolar lymfoide kappe af den anden harmoniske generation forbundet med den centrale arteriole. I zonen mellem periarteriolar lymfoide kappe og den marginale zone, identificere tilstedeværelsen af meget autofluorescerende, aktiveret tingible-krop makrofager og ved hjælp af disse vartegn, tegne en region af interesse omkring en enkelt germinal center område. Derefter oprette en Z-stack på omkring 100 til 150 mikrometer i dybden, startende fra overfladen af vævet og ved hjælp af et trin størrelse på omkring tre mikrometer, før du skifter til en 830-nanometer excitation bølgelængde.
Sluk eller dim alle kanaler for at forhindre fotoskader til detektorer, og billede stakken. Skift derefter tilbage til 940-nanometer-excitation bølgelængden, og genåbning af kanalerne, scanning gennem stakken for at bekræfte en effektiv fotoaktivering og en mangel på fotoskader i hele billedstakken. Serotypebestemmelse af de blandede knoglemarvsklokker afslører normaliserede B-celletal efter seks uger efter rekonstitution, med en lav frekvens på 9D11-positive cirkulerende B-celler afledt af 564Igi-rummet.
Inden for den samlede lymfocytport var der en lav frekvens af resterende recipient-afledte celler, hvoraf ca. 6 % er CD45.1-afledte, hvilket indikerer en samlet grad af kimær på ca. 94 %Der var en næsten komplet kimær i B-cellerummet og en dominans af fotoaktive GFP-knoglemarvsbaserede B-celler, en konsekvens af den tunge negative markering af 564Igi-afledte B-celler. Som observeret, in vivo mærkning med CD169 letter en robust visualisering af den marginale zone. Den anden harmoniske signal er synlig i kollagen-holdige strukturelle elementer og store fartøjer, herunder den centrale arteriole af periarteriolar lymfoide kappe og meget autofluorescerende, aktiveret tingible-krop makrofager forbundet med germinale center aktivitet.
Samlet set gør disse data det muligt at identificere et område af interesse, der sandsynligvis indeholder et enkelt, fotoaktivt germinale center. Downstream flow cytometrisk evaluering yderligere bekræfter tilstedeværelsen af normaliserede B celle rum numre, en spontan germinal center population, og en delmængde af fotoaktiverede germinale center B-celler. Det er vigtigt at begrænse den samlede ekspeditionstid for explanting, fotoaktivering, og væv forarbejdning trin til fire til seks timer for at sikre en tilstrækkelig celle levedygtighed.
De fotoaktiverede celler kan flowsorteres og underkastes enkeltcellesekventering for f.eks. Den blandede kimærmodel har gjort det muligt at udforske autoreaktiv germinal center biologi på en ny dybde, for eksempel giver indsigt i, hvordan processen med epitope spredning udfolder sig. Bemærk, at lyskilden til to-foton mikroskopi er meget kraftige pulserende klasse 4 lasere, der kan alvorligt skade øjnene.
Denne protokol beskriver generation af blandet murine knoglemarv kimærer med spontane autoimmune Kimcentre, i hvilke autoreactive lymfocytter bære en photoactivatable grøn fluorescerende proteiner (PA-NGL) reporter. Dette giver mulighed for at samkøre cellular placering i væv med downstream molekylære og funktionelle analyser.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved