Autoimmunity के एक मिश्रित चिमेरिक मॉडल में Photoactivation द्वारा व्यक्तिगत Autoreactive अंकुरण केंद्रों पूछताछ

सहज ऑटोरिएक्टिव अंकुरण केंद्रों का यह शारीरिक रूप से प्रासंगिक चिमरिक मॉडल डाउनस्ट्रीम आणविक विश्लेषणों के साथ वीवो में सेलुलर स्थानीयकरण को जोड़ने की अनुमति देता है। ऑटोरिएक्टिव अंकुरित केंद्रों के मिश्रित चिमरिक मॉडल का मुख्य लाभ इसकी बहुमुखी और सीमांत प्रकृति है, जो लगभग किसी भी वांछित सेलुलर सबसेट या आणविक मार्ग से पूछताछ की अनुमति देती है। ऑटोइम्यून रोग विकास के इस मॉडल की शारीरिक प्रासंगिकता उपन्यास अंतर्दृष्टि को सक्षम बनाती है जो नए उपचारों की उन्नति में सहायता कर सकती है।

इस बोन मैरो कल्पना मॉडल इम्यूनोलॉजी, इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी, और स्टेम सेल अनुसंधान में इस्तेमाल किया जा सकता है। फोटोएक्टिवेशन घटक में व्यापक उपयोग होता है, क्योंकि यह ऊतक स्थानीयकरण को डाउनस्ट्रीम सेल विश्लेषण से जोड़ता है। बोन मैरो की तैयारी और पुनर्गठन और वीवो लेबलिंग और ऊतक प्रत्यारोपण चरणों में सभी तकनीकी रूप से जटिल प्रक्रियाएं हैं जो खुद को दृश्य प्रदर्शनों के लिए अच्छी तरह से उधार देती हैं।

दाता 564Igi माउस फीमर और टिबिया निकालने के लिए, त्वचा को एक हिंद अंग से हटा दें, और पैर पर जबरदस्ती खींचकर घुटने और टखने के जोड़ों को बाहर निकालें। टखने के जोड़ को तोड़ने के लिए आगे बढ़ें। फिर, टिबिया पर पकड़ते समय पैर को शरीर की ओर खींचें, जिससे टिबिया से टेंडन और मांसपेशियों को अलग किया जा सके।

टिबिया को छोड़ने के लिए घुटने के जोड़ को तोड़ें, और फीमर पर पकड़ते हुए हड्डी को शरीर की ओर खींचें ताकि टेंडन और मांसपेशियों को फीमर से पट्टी किया जा सके। फिर, कूल्हे के जोड़ पर एक चीरा करें, और फीमर को हिप सॉकेट से बाहर खींचने से पहले टेंडन काट लें। इसी तरह से कॉन्ट्रालेट्रल हिंद अंग हड्डियों को हटाने के बाद, किसी भी शेष मांसपेशी और संयोजी ऊतक को हटाने के लिए हड्डियों को मोटे कागज के तौलिया से सावधानी से रगड़ें, और बर्फ-ठंडे बोन मैरो बफर में छीनी गई हड्डियों को कुल्ला करें।

फिर, बर्फ पर ताजा अस्थि मज्जा बफर के एक कंटेनर में हड्डियों को स्थानांतरित करने के लिए ड्यूमोंट नंबर सात संदंश का उपयोग करें। बोन मैरो कोशिकाओं को निकालने के लिए, बर्फ-ठंडे बोन मैरो बफर में एक मोर्टार कुल्ला, और ताजा, बर्फ ठंडी अस्थि मज्जा बफर के 10 मिलीलीटर के साथ धोने बफर की जगह के लिए एक 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें । हड्डियों को मोर्टार में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें, और अस्थि मज्जा को छोड़ने के लिए हड्डियों को कुचलने और पीसने के लिए मूसल का उपयोग करें।

बर्फ पर 50 मिलीलीटर शंकु नली में 70-माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से बोन मैरो समाधान पारित करने से पहले बोन मैरो समाधान पारित करने से पहले बोन मैरो निकालने को इकट्ठा करने के लिए 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें। फिर, कोशिकाओं की पूरी वसूली सुनिश्चित करने के लिए ताजा, बर्फ-ठंडे बोन मैरो बफर के अतिरिक्त 10 मिलीलीटर के साथ मोर्टार कुल्लाएं। दाता निलंबन तैयार करने के लिए, एक 50 मिलीलीटर शंकु नली में फोटोएक्टिवेट जीएफपी और 564Igi दाता मज्जा की उचित मात्रा मिश्रण, और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली।

मिश्रित कोशिका गोली को बर्फ-ठंडे बोन मैरो बफर के मिलीलीटर के प्रति आठ कोशिकाओं के लिए एक बार 10 की एकाग्रता पर फिर से खर्च करें, और कोशिकाओं को एक प्रीकूल्ड, 1.5-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को बर्फ पर स्थानांतरित करें। इसके बाद, एनेस्थेटाइज्ड सीडी 45.1 प्राप्तकर्ता माउस में अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करें, और पर्याप्त पुन: निलंबन सुनिश्चित करने के लिए दाता अस्थि मज्जा कोशिकाओं की ट्यूब को झटका दें। एक ०.३-मिलीलीटर, 30 गेज इंसुलिन सिरिंज में अस्थि मज्जा मिश्रण के २०० माइक्रोलीटर लोड, और, अपनी तरफ प्राप्तकर्ता के साथ, धीरे से ऊपर और आंख के नीचे त्वचा खिंचाव के लिए थोड़ा आंख बाहर पॉप ।

ध्यान से आंख सॉकेट के सामने में एक लगभग 30 डिग्री कोण पर सिरिंज की नोक डालें, आंख और आसपास के ऊतकों से बचने के लिए ध्यान रखते हुए । जब सुई की नोक आंख सॉकेट को रेखांकित करने वाली हड्डी को छूती है, तो दाता बोन मैरो को धीरे-धीरे इंजेक्ट करने के लिए स्थिर दबाव का उपयोग करने से पहले सुई को लगभग 0.5 मिलीमीटर वापस ले लें। फिर, पूर्ण वसूली तक निगरानी के साथ, विज्ञापन लिबिटम एंटीबायोटिक पानी के साथ अपने पिंजरे में माउस वापस करें।

पॉपलाइटल लिम्फ नोड को लेबल करने के लिए, पीबीएस के 18 माइक्रोलीटर में फाइकोरीथ्रिंरिन-लेबल वाले चूहे विरोधी माउस सीडी169 एंटीबॉडी के दो माइक्रोलीटर को पतला करें, और प्लास्टिक पैराफिन फिल्म के एक टुकड़े पर एंटीबॉडी की दो 10-माइक्रोलीटर बूंदों को जोड़ें। प्रत्येक बूंद को 30 गेज सुई के साथ एक 0.3-मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज में लोड करें, और एनेस्थेटाइज्ड प्राप्तकर्ता जानवर के फुटपैड में एंटीबॉडी के 10 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें। लिम्फ नोड की कटाई से पहले, एक सपाट सतह पर एक वर्ग कवरलिप रखें, और प्रत्येक किनारे से एक से दो मिलीमीटर के बारे में तेल के साथ कवरस्लिप के किनारों का पता लगाने के लिए एक वैक्यूम तेल-भरी हुई, पांच मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें।

एक ठंडी, सपाट सतह पर कक्ष स्थानांतरित करें, और वैक्यूम तेल कक्ष को बर्फ-ठंडे बोन मैरो बफर के साथ भरें। पॉपलाइटल लिम्फ नोड्स तक पहुंचने के लिए, इच्छामृत्यु प्राप्तकर्ता जानवर के घुटने के गड्ढे के ठीक नीचे त्वचा में चीरा लगाने के लिए सीधे, ठीक कैंची का उपयोग करें, और लगभग कूल्हे के जोड़ के लिए हैमस्ट्रिंग-लाइन के साथ कट का विस्तार करें। ड्यूमोंट नंबर पांच या नंबर सात संदंश का उपयोग करके, पॉपलाइटल फोसा में ऊतक को बेनकाब करने के लिए त्वचा के प्रत्येक उजागर फ्लैप्स को बाहर खींचें, और पॉपलाइटल नस में सावधानी से फोसा में प्रवेश करने के लिए संदंश का उपयोग करें।

पैर की धुरी के साथ संदंश को खोलें और बंद करें अंगूठे और इंडेक्स फिंगर का उपयोग करने से पहले अंतर्निहित पॉपलाइटल लिम्फ नोड का पर्दाफाश करने के लिए सामने की ओर से क्वाड्रिसेप्स मांसपेशी को घुटने तक चुटकी लेने के लिए, लिम्फ नोड को फोसा से बाहर पॉप करने के लिए। आसपास के ऊतकों से नोड को मुक्त करने के लिए लिम्फ नोड के नीचे संदंश स्लाइड करें, और इसे वैक्यूम तेल कक्ष में रखें। दूसरा लिम्फ नोड एकत्र करने के बाद, वैक्यूम तेल रिम पर एक दूसरा कवरस्लिप रखें, और सभी हवा के बुलबुले को बाहर निकालने के लिए देखभाल करते हुए, चैंबर को बंद करने के लिए धीरे-धीरे दबाएं।

काटा तिल्ली ऊतक नमूनों में अंकुरित केंद्रों की पहचान करने के लिए, इमेजिंग चैंबर को दो फोटॉन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें, और ऊपरी कवर्लिपी के शीर्ष पर आसुत पानी की एक बूंद रखने के लिए 3.5 मिलीलीटर प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें। संपर्क के बिंदु तक उद्देश्य को कम करें, और ऊतक के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित करने के लिए संचारित प्रकाश का उपयोग करें। डार्क मोड और दो फोटॉन उत्तेजन पर स्विच करें, और लेजर को 940 नैनोमीटर में ट्यून करें।

ऊतक की सतह के पास सीडी 169 धुंधला द्वारा सीमा वाले व्यक्तिगत सफेद लुगदी क्षेत्रों का पता लगाएं, और केंद्रीय धमनियों से जुड़े दूसरे हार्मोनिक्स पीढ़ी द्वारा पेरिआर्टेरियोलर लिम्फॉइड म्यान की पहचान करें। पेरिआर्टेरियोलर लिम्फाइड म्यान और सीमांत क्षेत्र के बीच के क्षेत्र में, अत्यधिक ऑटोफ्लोरेटेंट, सक्रिय थिंगेबल-बॉडी मैक्रोफेज की उपस्थिति की पहचान करें और इन स्थलों का उपयोग करके, एक ही अंकुरित केंद्र क्षेत्र के आसपास रुचि का क्षेत्र आकर्षित करें। फिर, ऊतक की सतह से शुरू होने वाले लगभग 100 से 150 माइक्रोमीटर के जेड-स्टैक की स्थापना करें और 830-नैनोमीटर एक्सिटेशन वेवलेंथ पर स्विच करने से पहले लगभग तीन माइक्रोमीटर के चरण आकार का उपयोग करें।

डिटेक्टरों को फोटोडैमेज को रोकने के लिए सभी चैनलों को बंद करें या मंद करें, और स्टैक को इमेज करें। फिर, 940-नैनोमीटर उत्तेजन तरंगदैर्ध्य पर वापस स्विच करें, और चैनलों को फिर से खोलें, एक कुशल फोटोएक्टिवेशन की पुष्टि करने के लिए स्टैक के माध्यम से स्कैन करना और पूरे इमेज स्टैक में फोटोडैमेज की अनुपस्थिति। मिश्रित अस्थि मज्जा कल्पना के Serotyping छह सप्ताह के बाद पुनर्गठन पर सामान्यीकृत बी सेल संख्या से पता चलता है, 9D11 की एक कम आवृत्ति के साथ-सकारात्मक परिसंचारी बी कोशिकाओं 564Igi डिब्बे से व्युत्पन्न ।

कुल लिम्फोसाइट गेट के भीतर, अवशिष्ट प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न कोशिकाओं की कम आवृत्ति थी, जिनमें से लगभग 6% सीडी 45.1-व्युत्पन्न हैं, जो लगभग 94% की चिमर्वाद की समग्र डिग्री का संकेत देते हैं, बी सेल डिब्बे में लगभग पूर्ण चिमर्वाद और फोटोएक्टिवेट जीएफपी बोन मैरो-व्युत्पन्न बी कोशिकाओं का प्रभुत्व था, जो 564Igi-व्युत्पन्न बी कोशिकाओं के भारी नकारात्मक चयन का परिणाम है। जैसा कि देखा गया है, सीडी 169 के साथ वीवो लेबलिंग में सीमांत क्षेत्र के एक मजबूत दृश्य की सुविधा है। दूसरा हार्मोनिक्स सिग्नल कोलेजन युक्त संरचनात्मक तत्वों और प्रमुख जहाजों में स्पष्ट है, जिसमें पेरिआर्टेयरलिरोयर लिम्फोइड म्यान और अत्यधिक ऑटोफ्लोरेसेंट की केंद्रीय धमनियों, अंकुरण केंद्र गतिविधि से जुड़े सक्रिय टिंगेबल-बॉडी मैक्रोफेज शामिल हैं।

एक साथ लिया, इन डेटा ब्याज के एक क्षेत्र है कि संभावना एक एकल, फोटोएक्टिवेट अंकुरित केंद्र शामिल है की पहचान की अनुमति देते हैं । डाउनस्ट्रीम प्रवाह साइटोमेट्रिक मूल्यांकन आगे सामान्यीकृत बी सेल कंपार्टमेंट संख्या, एक सहज अंकुरित केंद्र आबादी, और फोटोएक्टिवेटेड अंकुरित केंद्र बी कोशिकाओं के सबसेट की उपस्थिति की पुष्टि करता है। पर्याप्त सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए एक्सप्लांटिंग, फोटोएक्टिवेशन और ऊतक प्रसंस्करण चरणों के कुल बदलाव के समय को चार से छह घंटे तक सीमित करना महत्वपूर्ण है।

फोटोएक्टिवेटेड कोशिकाओं को प्रवाह-क्रमबद्ध किया जा सकता है और एकल-कोशिका अनुक्रमण के अधीन किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक अंकुरित केंद्र के बी सेल रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची की विशेषता है। मिश्रित कल्पना मॉडल ने एक नई गहराई पर ऑटोरिएक्टिव जर्मिनल सेंटर बायोलॉजी की खोज की अनुमति दी है, उदाहरण के लिए, कैसे एपिटोप फैलने की प्रक्रिया करेंगी में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। ध्यान दें कि दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रकाश स्रोत बहुत शक्तिशाली स्पंदित कक्षा 4 लेजर हैं जो आंखों को गंभीर रूप से नुकसान पहुंचा सकते हैं।