자발적인 자가 활성 발아 센터의 이 생리학적으로 관련된 키메라 모델은 다운스트림 분자 분석과 생체 내에서 세포 국소화의 연결을 허용합니다. 자동 반응성 발아 센터의 혼합 키메라 모델의 주요 장점은 다재다능하고 한계성격이며, 사실상 원하는 세포 서브세트 또는 분자 경로의 심문을 허용합니다. 자가 면역 질병 발달의 이 모형의 생리적인 관련성은 새로운 치료의 발전을 도울 수 있는 새로운 통찰력을 가능하게 합니다.
이 골수 키메라 모델은 면역학, 면역 종양학 및 줄기 세포 연구에서 사용될 수 있습니다. 광활성화 성분은 조직 국소화를 다운스트림 세포 분석에 연결하므로 광범위한 용도를 가지고 있습니다. 골수 제제와 재구성 및 생체 라벨링 및 조직 절제 단계는 모두 시각적 데모에 잘 빌려주는 기술적으로 복잡한 절차입니다.
기증자 564Igi 마우스 대퇴골과 경골을 추출하려면 뒷두개 에서 피부를 제거하고 발을 강제로 당겨 무릎과 발목 관절을 튀어 나섭습니다. 발목 관절을 부러 뜨리기 위해 진행합니다. 그런 다음 경골을 들고 몸을 향해 발을 당겨 경골에서 힘줄과 근육을 제거합니다.
경골을 풀어 놓기 위하여 무릎 관절을 끊고, 대퇴골에서 힘줄과 근육을 제거하기 위하여 대퇴골에 붙들고 있는 동안 뼈를 바디쪽으로 당깁니다. 그런 다음, 엉덩이 관절에 절개를하고, 엉덩이 소켓에서 대퇴골을 당기기 전에 힘줄을 잘라. 비슷한 방식으로 상반되는 뒷다리 뼈를 제거한 후 거친 종이 타월로 뼈를 조심스럽게 문지르면 남은 근육과 결합 조직을 제거하고 얼음처럼 차가운 골수 버퍼에서 벗겨진 뼈를 헹구는 다.
그런 다음 Dumont 넘버 7 집게를 사용하여 뼈를 얼음에 새겨진 골수 버퍼 용기로 옮겨 보입니다. 골수 세포를 추출하려면, 얼음 차가운 골수 버퍼에 박격포를 헹구고, 신선한, 얼음 차가운 골수 버퍼의 10 밀리리터로 세척 버퍼를 대체하기 위해 10 밀리리터 세로지 피펫을 사용합니다. 집게를 사용하여 뼈를 박격포로 옮기고 유봉을 사용하여 뼈를 분쇄하고 갈아서 골수를 방출합니다.
10 밀리리터 파이펫을 사용하여 골수 추출물을 수집한 후 70마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 얼음 위에 50밀리리터 원추형 튜브로 골수 용액을 전달합니다. 그런 다음, 신선한, 얼음 차가운 골수 버퍼의 추가 10 밀리리터와 박격포를 헹구어 세포의 완전한 회복을 보장합니다. 기증자 현탁액을 준비하기 위하여는, 50 밀리리터 원원형 관에 있는 광액성 GFP 및 564Igi 기증자 골수의 적당한 양을 혼합하고, 원심분리에 의하여 세포를 펠렛합니다.
혼합 세포 펠릿을 10회 농도에서 얼음-차가운 골수 버퍼의 밀리리터 당 8개의 세포로 재보중단하고, 얼음 위에 미리 냉각된 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 세포를 옮춥니다. 다음으로, 마취CD45.1 수신자 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고, 적절한 재현탁을 보장하기 위해 기증자 골수 세포의 튜브를 쓸어. 골수 믹스 200마이크로리터를 0.3밀리리터, 30게이지 인슐린 주사기로 적재하고, 수령인과 함께 눈 위와 아래에 피부를 부드럽게 펴서 눈을 살짝 튀겨냅니다.
주사기의 끝을 약 30도 각도로 눈 과 주변 조직을 피하기 위해 주의하십시오. 바늘의 끝이 눈 소켓 밑줄을 점안뼈에 닿으면, 기증자 골수를 천천히 주입하기 위해 꾸준한 압력을 사용하기 전에 약 0.5 밀리미터 의 바늘을 철회하십시오. 그런 다음 마우스를 전체 회복까지 모니터링하여 광고 리비툼 항생제 물로 케이지에 반환합니다.
포플라이트 림프절에 라벨을 부착하려면, PBS의 18 마이크로리터에 물리에리스린 라벨쥐 CD169 항체의 2마이크로리터를 희석하고, 플라스틱 파라핀 필름의 조각에 항체의 2개의 10 마이크로리터 방울을 추가한다. 각 액적을 30 게이지 바늘로 단일 0.3 밀리리터 인슐린 주사기에 적재하고 마취된 수령인 동물의 풋패드에 항체 10 마이크로리터를 주입합니다. 림프절을 수확하기 전에 평평한 표면에 사각형 커버 슬립을 배치하고 진공 그리스로드 5 밀리리터 주사기를 사용하여 각 가장자리에서 약 1 ~ 2 밀리미터 의 그리스로 커버 슬립의 가장자리를 추적합니다.
챔버를 차갑고 평평한 표면으로 옮기고 진공 그리스 챔버를 얼음처럼 차가운 골수 버퍼로 채웁니다. 포라이트 림프절에 액세스하려면 직진하고 미세한 가위를 사용하여 안락사 된 받는 동물의 무릎 구덩이 바로 아래에 피부에 절개를하고 햄스트링 라인을 따라 거의 엉덩이 관절까지 절단을 확장하십시오. Dumont 넘버 5 또는 넘버 7 포셉을 사용하여, 포라이트 포사에 있는 조직을 드러내기 위하여 피부의 노출된 플랩을 각각 바깥쪽으로 당기고, 포세이프를 사용하여 포사만 포사에 정중하게 입력합니다.
엄지와 검지 손가락을 사용하기 전에 다리의 축을 따라 집게를 열고 닫고 앞면 근면에서 무릎까지 사두근 근육을 꼬집어 포사에서 림프절을 튀어 나오게합니다. 림프절 아래에 집게를 밀어 주변 조직에서 노드를 해방하고 진공 그리스 챔버에 놓습니다. 두 번째 림프절이 수집된 후 진공 그리스 림에 두 번째 커버슬립을 놓고 부드럽게 눌러 챔버를 닫고 모든 기포를 돌출합니다.
수확된 비장 조직 샘플에서 발아 센터를 식별하려면 이미징 챔버를 2광광형 현미경의 단계에 배치하고 3.5 밀리리터 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 상부 커버슬립 위에 증류수 한 방울을 놓습니다. 접촉 지점까지 목표를 낮추고 전달된 빛을 사용하여 조직의 상단에 집중합니다. 어두운 모드와 두 광자 여기로 전환하고, 940 나노미터로 레이저를 조정합니다.
조직의 표면 근처에 염색CD169에 의해 경계 개별 백색 펄프 영역을 찾아, 중앙 동맥과 관련된 두 번째 고조파 생성에 의해 periarteriolar 림프구 칼집을 식별합니다. periarteriolar 림프성 칼집과 한계 영역 사이의 영역에서, 높은 자동 형광의 존재를 식별, 활성화 된 가색 몸 대식세포및, 이러한 랜드 마크를 사용하여, 하나의 발아 센터 영역 주위에 관심의 영역을 그립니다. 이어서, 약 100 내지 150 마이크로미터깊이의 Z 스택을 설정하여 조직의 표면에서 시작하여 약 3 마이크로미터의 단계 크기를 사용하여 830나노미터 의 발동 파장으로 전환한다.
모든 채널을 차단하거나 어둡게 하여 검출기의 광손상을 방지하고 스택을 이미지합니다. 이어서, 940나노미터 의 파장으로 돌아가 채널을 다시 열고, 스택을 통해 스캔하여 화상 스택 전체에 걸쳐 효율적인 광활성화 및 포토피해부재를 확인한다. 혼합 골수 키메라의 세로타이핑은 564Igi 구획에서 유래된 9D11 양성 순환 B 세포의 저주파와 함께, 6주 후 재구성에서 정규화된 B 세포 수를 나타낸다.
총 림프구 게이트 내에서, 잔류 수령인 유래 세포의 저주파가 있었는데, 그 중 약 6%는 CD45.1 유래이며, 약 94%의 키머리즘의 전체적인 정도를 나타내며, B 세포 구획에서 사실상 완전한 키머리즘과 광액활성 GFP 골수 유래 B 세포의 우세가 있었으며, 이는 56I의 중음선택의 결과였다. 관찰된 바와 같이, CD169를 사용하여 생체 내 라벨링은 한계 영역의 강력한 시각화를 용이하게 합니다. 제2 고조파 신호는 관절염 림프구 칼집과 고도로 자동 형광, 발아 센터 활동과 관련된 활성화 된 가색 바디 대식세포의 중앙 동맥을 포함하여 콜라겐 함유 구조 요소 및 주요 선박에서 명백하다.
종합하면, 이러한 데이터를 통해 단일 광액성 발아 센터가 포함된 관심 영역을 식별할 수 있습니다. 다운스트림 흐름 세포 측정 평가는 정규화된 B 세포 구획 수, 자발적발광센터 집단 및 광활성화 발아 센터 B 세포의 하위 집합의 존재를 더욱 확인한다. 충분한 세포 생존가능성을 보장하기 위해 박출, 광활성화 및 조직 처리 단계의 총 처리 시간을 4~6시간으로 제한하는 것이 중요합니다.
상기 광활성화 세포는 단일 발아 센터의 B 세포 수용체 레퍼토리를 특성화하기 위하여, 예를 들어, 단일 세포 시퀀싱을 플로우 정렬및 복종할 수 있다. 혼합 키메라 모델은 새로운 깊이에서 자동 반응성 발아 센터 생물학의 탐구를 허용했습니다, 예를 들어, 에피토프 확산의 과정이 어떻게 전개되는지에 대한 통찰력을 제공. 2광자 현미경 검사용 광원은 눈을 심하게 손상시킬 수 있는 매우 강력한 펄스 클래스 4 레이저입니다.
