Forhøre personlige Autoreactive Germinal sentre av Photoactivation i en blandet Chimeric modell av autoimmunitet

Denne fysiologisk relevante chimeriske modellen av spontane autoreaktive germinalsentre tillater kobling av cellulær lokalisering in vivo med nedstrøms molekylære analyser. Den største fordelen med den blandede kimeriske modellen av autoreaktive germinalsentre er dens allsidige og marginale natur, slik at avhør av nesten alle ønskede cellulære undergrupper eller molekylære veier. Den fysiologiske relevansen av denne modellen av autoimmun sykdomsutvikling muliggjør ny innsikt som kan hjelpe til med å fremme nye terapier.

Denne benmarg chimera modellen kan brukes i immunologi, immuno-onkologi, og stamcelleforskning. Fotoaktiveringskomponenten har bred bruk, da den knytter vevs lokalisering til nedstrøms celleanalyse. Benmargsforberedelsen og rekonstituering og in vivo merking og vev explantation trinn er alle teknisk komplekse prosedyrer som gir seg godt til visuelle demonstrasjoner.

For å trekke ut donor 564Igi mus lårben og tibia, fjern huden fra en baklem, og pop ut kneet og ankelleddene ved å trekke på foten kraftig. Fortsett å bryte ankelleddet. Deretter trekker du foten mot kroppen mens du holder fast på tibia, og fjerner dermed sener og muskler fra tibia.

Bryt kneleddet for å frigjøre tibia, og trekk beinet mot kroppen mens du holder på lårbenet for å strippe sener og muskler fra lårbenet. Deretter gjør du et snitt på hofteleddet, og kutt senene før du trekker lårbenet ut av hoftekontakten. Etter å ha fjernet de kontralaterale bakbenbeinene på lignende måte, gni forsiktig beinene med et grovt papirhåndkle for å fjerne eventuelle gjenværende muskler og bindevev, og skyll de strippede beinene i iskald benmargsbuffer.

Deretter bruker dumont nummer syv tang for å overføre bein til en beholder med frisk benmargsbuffer på is. For å trekke ut benmargscellene, skyll en mørtel i iskald benmargsbuffer, og bruk en 10-milliliter serologisk pipette for å erstatte vaskebufferen med 10 milliliter frisk, iskald benmargsbuffer. Bruk tangen til å overføre beinene til mørtelen, og bruk en pestle til å knuse og male beinene for å frigjøre benmargen.

Bruk 10-milliliter pipetten til å samle benmargsekstraktet før du passerer benmargsløsningen gjennom en 70-mikrometercellesil i et konisk rør på 50 milliliter på is. Skyll deretter mørtelen med ytterligere 10 milliliter frisk, iskald benmargsbuffer for å sikre en fullstendig gjenoppretting av cellene. For å forberede donorsuspensjoner, bland de riktige volumene av fotoaktive GFP og 564Igi donormarg i et 50-milliliter konisk rør, og pellet cellene ved sentrifugering.

Gjenoppstjen den blandede cellepelleten i en konsentrasjon på en gang 10 til de åtte cellene per milliliter iskald benmargsbuffer, og overfør cellene til et forkjølet, 1,5 milliliter mikrocentrifugrør på is. Deretter bekrefter du mangel på respons på tåklemme i den bedøvede CD45.1-mottakermusen, og knipser røret av donorbenmargsceller for å sikre tilstrekkelig gjenoppliving. Legg 200 mikroliter benmargblanding i en 0,3 milliliter, 30-gauge insulinsprøyte, og med mottakeren på siden, forsiktig strekke huden over og under øyet for å litt pop øyet ut.

Sett sprøyten forsiktig inn i en omtrentlig 30-graders vinkel inn i forsiden av øyekontakten, og ta vare på å unngå øyet og det omkringliggende vevet. Når nålen berører benet som understreker øyekontakten, trekker du kanylen tilbake ca. 0,5 millimeter før du bruker jevnt trykk for å injisere donorbenmargen langsomt. Deretter returnerer du musen til buret med ad libitum antibiotikavann, med overvåking til full gjenoppretting.

For å merke popliteal lymfeknute, fortynne to mikroliter av fycoerythrin-merket rotte anti-mus CD169 antistoff i 18 mikroliter pbs, og legge til to 10-mikroliter dråper av antistoffet på et stykke plast parafin film. Legg hver dråpe i en enkelt 0,3 milliliter insulinsprøyte med en 30-gauge nål, og injiser 10 mikroliter antistoff i fotplaten til det bedøvede mottakerdyret. Før du høster lymfeknuten, legg en firkantet dekkslips på en flat overflate, og bruk en vakuumfettbelastet, fem milliliter sprøyte for å spore kantene på dekkslipsen med fett omtrent en til to millimeter fra hver kant.

Overfør kammeret til en kald, flat overflate, og fyll vakuumfettkammeret med iskald benmargsbuffer. For å få tilgang til popliteal lymfeknuter, bruk rett, fin saks for å gjøre et snitt i huden like under knegropen til det eutaniserte mottakerdyret, og utvid kuttet oppover langs hamstringlinjen nesten til hofteleddet. Ved hjelp av Dumont nummer fem eller nummer syv tang, trekk hver av de eksponerte klaffer av huden utover for å eksponere vevet i popliteal fossa, og bruk tang til å gå forsiktig inn i fossa bare medial til popliteal venen.

Åpne og lukk tangen langs aksen av benet for å eksponere den underliggende popliteal lymfeknuten før du bruker tommelen og pekefingeren til å klemme quadriceps muskelen fra forsiden proksimal til kneet, for å pop lymfeknuten ut av fossa. Skyv tangene under lymfeknuten for å frigjøre noden fra det omkringliggende vevet, og legg den i vakuumfettkammeret. Etter at den andre lymfeknuten er samlet inn, plasser en ekstra dekkslipp på vakuumfettfelgen, og trykk forsiktig ned for å lukke kammeret, og vær forsiktig med å ekstrudere alle luftboblene.

For å identifisere bakteriesentrene i høstede miltvevsprøver, plasser bildekammeret på scenen av et to-fotonfluoreserende mikroskop, og bruk en 3,5-milliliter plastoverføringspipette for å plassere en dråpe destillert vann på toppen av den øvre dekkslippen. Senk målet til kontaktpunktet, og bruk det overførte lyset til å fokusere på toppen av vevet. Bytt til mørk modus og to-foton eksitasjon, og tune laseren til 940 nanometer.

Finn de enkelte hvite masseområdene som grenser til CD169-fargingen nær overflaten av vevet, og identifiser den periarteriolar lymfoidhylsen av den andre harmoniske generasjonen forbundet med den sentrale arteriole. I sonen mellom periarteriolar lymfoidhylse og marginalsonen, identifisere tilstedeværelsen av svært autofluorescent, aktivert tingible-body makrofager og, ved hjelp av disse landemerkene, trekke en region av interesse rundt en enkelt germinal sentrum område. Deretter setter du opp en Z-stabel på rundt 100 til 150 mikrometer i dybden, fra overflaten av vevet og bruker en trinnstørrelse på omtrent tre mikrometer før du bytter til en 830-nanometer eksitasjonsbølgelengde.

Slå av eller dempe alle kanalene for å hindre fotoskader til detektorene, og bilde stabelen. Deretter bytter du tilbake til 940-nanometerets eksitasjonsbølgelengde, og åpner kanalene på nytt, skanner gjennom bunken for å bekrefte en effektiv fotoaktivering og fravær av fotoskader i hele bildestakken. Serotyping av blandet benmarg chimeras avslører normaliserte B celletall på seks uker etter rekonstituering, med en lav frekvens på 9D11-positive sirkulerende B-celler avledet fra 564Igi-rommet.

Innenfor den totale lymfocyttporten, det var en lav frekvens av gjenværende mottaker-avledede celler, hvorav ca 6% av disse er CD45.1-avledet, noe som indikerer en generell grad av chimerism på ca 94%Det var en nesten fullstendig chimerisme i B-cellerommet og en dominans av fotoaktive GFP benmargsavledede B-celler, en konsekvens av det tunge negative utvalget av 564Igi-avledede B-celler. Som observert forenkler in vivo merking med CD169 en robust visualisering av marginalsonen. Det andre harmoniske signalet er tydelig i kollagenholdige strukturelle elementer og store kar, inkludert den sentrale arteriole av periarteriolar lymfoid kappe og svært autofluorescent, aktivert tingible-body makrofager forbundet med germinal senter aktivitet.

Samlet sett tillater disse dataene identifisering av et interesseområde som sannsynligvis inneholder et enkelt, fotoaktiverbart germinalsenter. Nedstrøms strømning cytometrisk evaluering bekrefter videre tilstedeværelsen av normaliserte B celle rom tall, en spontan germinal senter populasjon, og en undergruppe av fotoaktiverte germinal senter B-celler. Det er viktig å begrense den totale behandlingstiden for explanting, fotoaktivering og vevsbehandlingstrinn til fire til seks timer for å sikre tilstrekkelig cellelevelighet.

De fotoaktiverte cellene kan flytesorteres og utsettes for encellesekvensering for for eksempel å karakterisere B-cellereseptorrepertoaret til et enkelt germinalt senter. Den blandede chimera modellen har tillatt utforskning av autoreaktiv germinal senterbiologi på en ny dybde, for eksempel, og gir innsikt i hvordan prosessen med epitop spredning utfolder seg. Legg merke til at lyskilden for to-foton mikroskopi er svært kraftige pulserende klasse 4 lasere som kan alvorlig skade øynene.