Förhör enskilda autoreaktiva stilbildande centrum av ljusaktivering i en blandad chimära modell av autoimmunitet

Denna fysiologiskt relevanta chimeric modell av spontana autoreaktiv germinal centers möjliggör länkning av cellulära lokalisering in vivo med nedströms molekylära analyser. Den största fördelen med den blandade chimeric modell av autoreaktiva germinal centra är dess mångsidiga och marginella natur, vilket gör att förhör av praktiskt taget alla önskade cellulära delmängd eller molekylär väg. Den fysiologiska relevansen av denna modell av autoimmun sjukdom utveckling möjliggör nya insikter som kan hjälpa utvecklingen av nya terapier.

Denna benmärgsmärer modell kan användas i immunologi, immuno-onkologi, och stamcellsforskning. Komponenten photoactivation har bred användning, eftersom den länkar vävnadslokalisering till nedströms cellanalys. Benmärgen förberedelse och rekonstituering och in vivo märkning och vävnad explantation steg är alla tekniskt komplexa förfaranden som lämpar sig väl för visuella demonstrationer.

För att extrahera givaren 564Igi mus lårbenet och skenbenet, ta bort huden från en bakben, och pop ut knä och fotleder genom att dra på foten kraftfullt. Fortsätt att bryta fotleden. Dra sedan foten mot kroppen medan du håller fast skenbenet och därigenom strippa senor och muskler från skenbenet.

Bryt knäleden för att frigöra skenbenet, och dra benet mot kroppen medan du håller fast vid lårbenet för att ta av senor och muskler från lårbenet. Gör sedan ett snitt vid höftleden, och skär senorna innan du drar lårbenet ur höftuttaget. Efter att ha tagit bort de kontralaterala bakbenen ben på ett liknande sätt, noggrant gnugga benen med en grov pappershandduk för att ta bort eventuella kvarvarande muskler och bindväv, och skölj de avskalade benen i iskall benmärgsbuffert.

Använd sedan Dumont nummer sju tövingar för att överföra benen till en behållare med färsk benmärgsbuffert på is. För att extrahera benmärgscellerna, skölj en mortel i iskall benmärgsbuffert, och använd en 10-milliliter serologisk pipetten för att ersätta tvättbufferten med 10 milliliter färsk, iskall benmärgsbuffert. Använd tärnarna för att överföra benen till morteln, och använd en mortelstöt för att krossa och mala benen för att frigöra benmärgen.

Använd 10-milliliterpipetten för att samla upp benmärgsextraktet innan benmärgslösningen skickas genom en 70-mikrometercellsil till ett koniskt rör på 50 milliliter på is. Skölj sedan mortel med ytterligare 10 milliliter färsk, iskall benmärgsbuffert för att säkerställa en fullständig återhämtning av cellerna. För att förbereda givaren suspensioner, blanda lämpliga volymer av photoactivatable GFP och 564Igi givaren märg i en 50-milliliter koniska röret, och pellet cellerna genom centrifugeringen.

Resuspend den blandade cell pelleten vid en koncentration av en gånger 10 till de åtta cellerna per milliliter av iskall benmärgsbuffert, och överföra cellerna till en förkyld, 1,5-milliliter mikrocentrifugrör på is. Därefter bekräfta en brist på svar på tå nypa i den sövda CD45.1 mottagaren musen, och flick röret av givaren benmärgsceller för att säkerställa en tillräcklig resuspension. Ladda 200 mikroliter benmärgsblandning i en 0,3-milliliter, 30-gauge insulinspruta, och, med mottagaren på sidan, försiktigt sträcka huden över och under ögat för att något pop ögat ut.

Sätt försiktigt in sprutans spets i ungefärlig 30-gradig vinkel i ögonhålans framsida, var försiktig för att undvika ögat och den omgivande vävnaden. När nålspetsen vidrör benet som understryker ögonhålan, dra tillbaka nålen ca 0,5 millimeter innan du använder stadigt tryck för att långsamt injicera donatorbenmärgen. Sedan, tillbaka musen till sin bur med ad libitum antibiotika vatten, med övervakning tills full återhämtning.

För att märka popliteal lymfkörteln, späd två mikroliter av phycoerythrin-märkt råtta anti-mus CD169 antikropp i 18 mikroliter pbs, och tillsätt två 10-mikroliter droppar av antikroppen på en bit av plast paraffin film. Ladda varje droppe i en enda 0,3-milliliter insulinspruta med en 30-gauge nål, och injicera 10 mikroliter av antikroppar i fotplattan av den sövda mottagardjur. Innan du skördar lymfkörtdeln, placera en fyrkantig täckplatta på en plan yta, och använda en vakuum fett-lastad, fem-milliliter spruta för att spåra kanterna på täcket med fett ungefär en till två millimeter från varje kant.

Överför kammaren till en kall, plan yta, och fyll vakuumfettkammaren med iskall benmärgsbuffert. För att komma åt popliteal lymfkörtlar, använd raka, fina saxar för att göra ett snitt i huden strax under knägropen av avlivade mottagardjur, och förlänga snittet uppåt längs hamstring-linjen nästan till höftleden. Använda Dumont nummer fem eller nummer sju tång, dra var och en av de exponerade klaffar av huden utåt för att exponera vävnaden i popliteal fossa, och använda tång för att försiktigt komma in i fossa bara mediala till popliteal ven.

Öppna och stäng tången längs axeln av benet för att exponera den underliggande popliteal lymfkörteln innan du använder tummen och pekfingret för att nypa quadriceps muskeln från framsidan proximala till knäet, att pop lymfkörteln ur fossa. Skjut tlyset under lymfkörtknuten för att befria noden från den omgivande vävnaden, och placera den i vakuumfettkammaren. Efter den andra lymfkörtdel har samlats in, placera en andra coverslip på vakuum fett fälg, och tryck ner försiktigt för att stänga kammaren, var noga med att pressa alla luftbubblor.

För att identifiera groddarcentra i skördade mjälte vävnadsprover, placera bildbehandlingskammaren på scenen av en två-foton fluorescerande mikroskop, och använda en 3,5-milliliter plast överföring pipett att placera en droppe av destillerat vatten ovanpå den övre täcket. Sänk målet fram till kontaktpunkten, och använd det överförda ljuset för att fokusera på vävnadens topp. Växla till mörkt läge och två-foton excitation, och ställa in lasern till 940 nanometer.

Lokalisera de enskilda vitmassa områden kantad av CD169 färgning nära ytan av vävnaden, och identifiera periarteriolar lymfoida manteln av den andra övertoner generation i samband med den centrala arteriole. I zonen mellan periarteriolar lymfoida slida och marginella zonen, identifiera förekomsten av mycket autofluorescerande, aktiveras pirrbar-kropp makrofager och, med hjälp av dessa landmärken, dra en region av intresse runt en enda germinal centrum område. Ställ sedan in en Z-stack på cirka 100 till 150 mikrometer på djupet, med början från vävnadens yta och använda en stegstorlek på cirka tre mikrometer innan du byter till en 830-nanometerutexcitationsvåglängd.

Stäng av eller dämpa alla kanaler för att förhindra fotoskador till detektorerna, och bild stacken. Sedan, växla tillbaka till 940-nanometer excitation våglängd, och öppna kanalerna igen, skanning genom stacken för att bekräfta en effektiv fotoaktivering och en avsaknad av photodamage hela bildstacken. Serotypning av de blandade benmärg chimeras avslöjar normaliserade B cell nummer på sex veckor efter reconstitution, med en låg frekvens av 9D11-positiva cirkulerande B-celler som härrör från 564Igi delparten.

Inom den totala lymfocyt porten fanns en låg frekvens av resterande mottagare-härledda celler, om 6%av vilka är CD45.1-härledda, vilket indikerar en övergripande grad av chimerism på cirka 94%Det fanns en praktiskt taget fullständig chimerism i B-cellen fack och en dominans av photoactivatable GFP benmärg-härledda B-celler, en följd av den tunga negativa val av 564Igi-härledda B-celler. Som observerats, in vivo märkning med CD169 underlättar en robust visualisering av marginalzonen. Den andra övertoner signalen är uppenbart i kollagen-innehållande strukturella element och större fartyg, inklusive den centrala arteriole av periarteriolar lymfoida slida och mycket autofluorescerande, aktiveras tingible-body makrofager är associerad med den germinal centrum verksamhet.

Sammantaget tillåter dessa data identifiering av en region av intresse som sannolikt innehåller en enda, fotoaktiv germinal center. Nedströms flöde cytometrisk utvärdering bekräftar ytterligare förekomsten av normaliserade B cell fack nummer, en spontan germinal center befolkningen och en delmängd av photoactivated germinal center B celler. Det är viktigt att begränsa den totala handläggningstiden för explanting, fotoaktivering och vävnadsbearbetningssteg till fyra till sex timmar för att säkerställa en tillräcklig cellutbredning.

De fotoaktiverade cellerna kan flödessorteras och utsättas för encellig sekvensering för att till exempel karakterisera B-cellsreceptorrepertoaren i ett enda germinalcenter. Den blandade chimär modellen har gjort det möjligt att utforska autoreaktiv germinal center biologi på ett nytt djup, till exempel, vilket ger insikt i hur processen för epitope spridning utvecklas. Observera att ljuskällan för två-fotonmikroskopi är mycket kraftfulla pulsade klass 4-lasrar som allvarligt kan skada ögonen.