Name: investigating alterations in caecum microbiota after traumatic brain injury in mice
Uploaded: 2019-09-19T13:00:00
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tutte le procedure eseguite sono state approvate dal Comitato Sperimentale di Etica Animale dell'Università di Hejiang. Tutti gli strumenti e i materiali utilizzati in chirurgia sono sterili. Il processo di proceudre TBI dura circa 20 minuti.
1. Cura degli animali
<ol><li>Utilizzare topi C57BL/6J maschi da 5 a 6 settimane (20-25 g di peso) in questo esperimento.</li>
	<li>Mantenere i topi su un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h e assicurarsi che ricevano cibo e acqua al libitum. Fornire le s...

<ol>
	<li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).</li><li>Maas, A. I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury:+integrated+approaches+to+improve+prevention,+clinical+care,+and+research.">Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research.</a> The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).</li><li>Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+manifestations+of+traumatic+brain+injury.">Systemic manifestations of traumatic brain injury.</a> Handbook of Clinical Neurology. 127, 205-218 (2015).</li><li>Kabadi, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-percussion-induced+traumatic+brain+injury+model+in+rats.">Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats.</a> Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).</li><li>Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+microbiota,+immune+and+nervous+systems+in+health+and+disease.">Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease.</a> Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).</li><li>Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+the+intestinal+microbiota+and+the+brain.">The interplay between the intestinal microbiota and the brain.</a> Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).</li><li>Cryan, J. F., Dinan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind-altering+microorganisms:+the+impact+of+the+gut+microbiota+on+brain+and+behaviour.">Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).</li><li>Nicholson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+Traumatic+Brain+Injury+Alters+the+Gastrointestinal+Microbiome+in+a+Time-Dependent.">Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent.</a> Shock. , (2018).</li><li>Houlden, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+induces+specific+changes+in+the+caecal+microbiota+of+mice+via+altered+autonomic+activity+and+mucoprotein+production.">Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).</li><li>Treangen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury+in+Mice+Induces+Acute+Bacterial+Dysbiosis+Within+the+Fecal+Microbiome.">Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).</li><li>Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+fluid+percussion:+model+of+traumatic+brain+injury+in+mice.">Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Thompson, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+fluid+percussion+brain+injury:+a+15-year+review+and+evaluation.">Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation.</a> Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).</li><li>Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+and+caecal+microbiota+profiles+of+mice+do+not+cluster+in+the+same+way.">Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way.</a> Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).</li></ol>

Presentato qui è un protocollo semplice ed efficiente per determinare i cambiamenti nel microbiota cecale dopo il TBI nei topi. L'induzione di lesioni cerebrali e la raccolta di campioni di contenuto di caecum sono parti critiche del protocollo.
Nonostante i ricercatori abbiano studiato i cambiamenti del microbiota intestinale dopo la TBI, la lesione cerebrale utilizzata in questi studi era CCI-8 e modelli di goccia/impatto indotti9. Tuttavia, i...

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è un problema di salute pubblica globale e la principale causa di morte e disabilità nei giovani adulti1,2. TBI causa molti decessi ogni anno, e i sopravvissuti sperimentano una varietà di disabilità fisiche, psichiatriche, emotive e cognitive. Pertanto, la TBI è un pesante fardello per la famiglia e le risorse sociali di un paziente. TBI coinvolge sia la lesione cerebrale primaria che si verifica al momento del trauma e qualsiasi lesioni cerebrali secondarie che sviluppano ore a mesi dopo la lesione iniziale. Lesione cerebrale secondaria è mediata da diverse cascate biochimiche, che non sono solo dannose per il cervello, ma hanno anche effetti negativi significativi su vari sistemi di organi, tra cui il sistema gastrointestinale3.
Attualmente, ci sono tre modelli per indurre La TBI negli esperimenti sugli animali: lesione da percussione fluida, l'impatto corticale di controllo (CCI) e l'accelerazione della caduta di peso. Lesione di percussioni fluide laterali (LFPI) è il modello più comunemente usato per stabilire lesioni cerebrali diffuse (DAI)4. Il dispositivo produce lesioni cerebrali attraverso una craniectomia applicando un breve impulso di pressione del fluido alla dura intatta. Questo impulso è creato dallo sciopero del pendolo. LFPI è un metodo di modellazione riproducibile e controllabile per la ricerca TBI.
Il microbioma è definito come i genomi collettivi di tutti i microrganismi che risiedono nel corpo umano. I microbi intestinali, in particolare, non solo svolgono un ruolo importante nell'omeostasi intestinale e nella funzione, ma regolano anche molti aspetti della fisiologia dell'ospite e del funzionamento di altri organi5. Negli ultimi anni, ci sono prove crescenti che indicano che il microbiota intestinale regola lo sviluppo e la funzione del cervello tramite assi cervello-gut6. L'interruzione del microbiota intestinale è stata collegata a diversi disturbi della funzione cerebrale, tra cui il morbo di Parkinson, disturbi dell'umore e autismo7. Recentemente, studi preclinici hanno anche riferito che la lesione cerebrale acuta può indurre cambiamenti nel microbiota intestinale8,9.
Uno studio di Treangen et al.10 ha rilevato diminuzioni significative in tre specie microbiche e aumenti in due specie microbiche dopo il TBI indotto dal CCI. Questa evidenza indica che la modulazione del microbiota intestinale può essere un metodo terapeutico nella gestione TBI. Tuttavia, i meccanismi alla base dei cambiamenti del microbiota intestinale indotti da lesioni cerebrali rimangono sconosciuti. Per questo motivo, è necessario un modello relativamente semplice ed efficiente di studiare i cambiamenti nel microbiota intestinale dopo che è richiesto tè. Pertanto, il presente studio presenta un protocollo per esaminare le alterazioni nel microbiota intestinale dopo la TBI nei topi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:958px;" width="959">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DNA isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:212px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:354px;">51604</td>
			<td style="width:171px;">For fast purification of genomic DNA from stool samples</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gene analysis service</td>
			<td>GENEWIZ</td>
			<td></td>
			<td>Gene analyse service</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heating pad</td>
			<td>Shanghai SAFE Biotech Co.</td>
			<td>TR-200</td>
			<td>heating pad</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Injector</td>
			<td style="width:212px;">The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University</td>
			<td></td>
			<td>injector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LFPI device</td>
			<td style="width:212px;">Virginia 
			Commonwealth University</td>
			<td>FP302</td>
			<td>LFPI device</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Micro cranial drill</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>78061</td>
			<td>Micro cranial drill</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Povidone Iodine</td>
			<td style="width:212px;">The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University</td>
			<td></td>
			<td>Povidone Iodine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating alterations in caecum microbiota after traumatic brain injury in mice

Sempre più prove dimostrano che l'asse microbiota-gut-cervello svolge un ruolo importante nella patogenesi delle malattie cerebrali. Diversi studi dimostrano anche che le lesioni cerebrali traumatiche causano cambiamenti al microbiota intestinale. Tuttavia, i meccanismi alla base della regolazione bidirezionale dell'asse cervello-gut rimangono sconosciuti. Attualmente, esistono pochi modelli per studiare i cambiamenti nel microbiota intestinale dopo lesioni cerebrali traumatiche. Pertanto, lo studio presentato combina protocolli per indurre lesioni cerebrali traumatiche utilizzando un dispositivo di percussioni fluide laterale e l'analisi di campioni di caecum in seguito alla lesione per studiare le alterazioni nel microbioma intestinale. Le alterazioni della composizione del microbiota intestinale dopo lesioni cerebrali traumatiche sono determinate utilizzando il sequenziamento 16S-rDNA. Questo protocollo fornisce un metodo efficace per studiare le relazioni tra microrganismi enterici e lesioni cerebrali traumatiche.

La creazione di TBI è illustrata nella Figura 1. Dopo l'anestesia e la disinfezione, il cuoio capelluto è stato inciso sagittally (Figura 1A). Una craniotomia (3 mm di diametro) è stata trafitta nel cranio sopra la corteccia parietale destra con un trapano elettrico, la dura è stata mantenuta intatta (Figura 1B,C). Una cannula di lesione plastica è stata posta sopra la finestra ...

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Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Presentato qui è un protocollo per indurre lesioni cerebrali traumatiche diffuse utilizzando un dispositivo a percussione fluida laterale seguito dalla raccolta del contenuto di caecum per l'analisi del microbioma intestinale.

Indagare sulle alterazioni nel caecum Microbiota dopo una lesione cerebrale traumatica nei topi

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

La simultaneità e le interazioni delle linee tra il cervello e il microbiota intestinale rimangono sconosciute. Utilizzare questa tecnica, è possibile esaminare le alterazioni del microbiota intestinale dopo lesioni cerebrali traumatiche nei topi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente semplice ed efficiente.A dimostrare la procedura sarà Wendong You, uno studente laureato del mio laboratorio. Per l'induzione traumatica di lesioni cerebrali, confermare una mancanza di risposta al dito del piede in un topo anestetizzato e applicare un unguento agli occhi dell'animale. Dopo la rasatura, disinfettare la pelle esposta del cuoio capelluto con il 70% di etanolo prima di incisione del cuoio capelluto in un piano sagittale.Usando le forcep, ritrarre l'incisione su entrambi i lati e separare leggermente il periosteo. Utilizzare un marcatore per disegnare un cerchio di tre millimetri di diametro sull'area parietale destra del cranio a due millimetri di distanza dalla linea mediana. Utilizzare un trapano elettrico per penetrare attentamente nel cranio senza danneggiare la dura.Rimuovere il lembo osseo per esporre una finestra ossea di tre millimetri e posizionare una cannula di plastica sulla craniotomia. Dopo aver cementato la cannula al cranio con acrilico dentale, utilizzare una siringa da cinque millilitri per riempire la cannula con una soluzione salina sterile dello 0,9%, facendo attenzione ad evitare bolle. Accendere l'oscilloscopio e l'amplificatore.Verificare che il tubo ad alta pressione del dispositivo di lesione a percussione del fluido laterale sia privo di bolle d'aria e fornire circa 10 impulsi di prova, fino a quando il dispositivo non fornisce un segnale costante. Regolare l'angolo della posizione iniziale del pendolo per raggiungere un'intensità dell'impulso di circa due atmosfere standard e collegare la cannula della lesione al dispositivo di lesione a percussione del fluido laterale. Premere il grilletto per rilasciare il pendolo, inducendo la lesione cerebrale.Quindi ottenere e trasmettere un impulso alla dura attraverso l'intero sistema di tubi chiuso e riempito di fluido. Dopo l'induzione di lesioni cerebrali, rimuovere la cannula e suturare l'incisione. Quindi posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino a quando non è ambulatorio, prima di riportare l'animale nella sua gabbia di casa con accesso ad libitum a cibo e acqua.Nei punti di tempo sperimentali indicati, esporre l'intestino secondo protocolli standard e utilizzare pinze atraumatiche per separare delicatamente il feco dagli altri tratti intestinali. Quando il tessuto è stato localizzato, tagliare il feco con forbici affilate ed estrarre manualmente il contenuto di caecum su una medicazione sterile. Quindi trasferire il contenuto in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri, per una conservazione di meno 80 gradi Celsius fino all'analisi del microbioma.Il sequenziamento del DNA ricombinante 16S dimostra una ridotta diversità nel caecum microbiota nei topi tre giorni dopo una lesione cerebrale traumatica, con i taxa più abbondanti all'interno del contenuto di caecum dei gruppi di lesioni cerebrali fittizie e traumatiche mostrati nella figura. Inoltre, il ridimensionamento multidimensionale non metrico rivela cambiamenti nella composizione del caecum microbiota dopo una lesione cerebrale traumatica. Ricorda di mantenere dura intatta durante la perforazione del cranio e di essere gentile quando localizza e separa il caecum da altri tratti intestinali.Seguendo questa procedura, la colorazione e l'analisi dell'ematossilina e dell'eosina possono essere eseguito per esaminare il cambiamento istologico e la risposta infiammatoria all'interno dei tratti intestinali dopo una lesione cerebrale traumatica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Ricerca

Neuroscienze

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