Name: performing spectroscopy on plasmonic nanoparticles with transmission-based nomarski-type differential interference contrast microscopy
Uploaded: 2019-06-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy at JoVE.com

Dr. Anthony S. Stender ønsker at anerkende teknisk støtte gennem Nanoscale og Quantum fænomener Institute (NQPI) på Ohio University. Denne artikel blev muliggjort gennem opstartsfinansiering til Dr. Stender ved Ohio University.

1. forberedelse af prøver med standard glas mikroskopi
<ol><li>Forbered glas mikroskop-slides til prøve aflejring. Bemærk: under visse omstændigheder kan det være mere hensigtsmæssigt at opbevare glasset i ultrarent vand i stedet for ethanol. Men, opbevaring i vand eller luft gør glasset hydrofobe over tid.<ol>
<li>For de bedste resultater, købe glas eller kvarts mikroskop slides og dække glas.</li>
		<li>Brug en opstregningen pen til at anbringe et lavt og kort skrabemærke på midten af hver glas dæksedd...

<ol>
	<li>Pluta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+7:+Differential+Interference+Contrast+in.">Ch 7: Differential Interference Contrast in.</a> Advanced Light Microscopy. 2, 146-197 (1989).</li><li>Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Gold+Nanorod+Geometry+on+Optical+Response.">Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response.</a> ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).</li><li>Stender, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Optical+Imaging+and+Spectroscopy.">Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).</li><li>Mehta, S. B., Sheppard, C. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+coherent+image+formation+in+differential+interference+contrast+(DIC)+microscope.">Partially coherent image formation in differential interference contrast (DIC) microscope.</a> Optics Express. 16 (24), 19462-19479 (2008).</li><li>Murphy, D. B., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+1:+Fundamentals+of+Light+Microscopy.">Ch 1: Fundamentals of Light Microscopy.</a> Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second edition. , 1-20 (2012).</li><li>Stender, A. S., Augspurger, A. E., Wang, G., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Polarization+Setting+on+Gold+Nanorod+Signal+at+Nonplasmonic+Wavelengths+Under+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).</li><li>Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+Rotational+Motions+of+Nano-objects+in+Engineered+Environments+and+Live+Cells+with+Gold+Nanorods+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).</li><li>Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Properties+of+Metal+Nanoparticles:+The+Influence+of+Size,+Shape,+and+Dielectric+Environment.">The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).</li><li>Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+All+That's+Gold+Does+Glitter.">Not All That's Gold Does Glitter.</a> MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).</li><li>Maier, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmonics: Fundamentals and Applications. , (2007).</li><li>Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-Dependent+Differential+Interference+Contrast+Microscopy:+Selectively+Imaging+Nanoparticle+Probes+in+Live+Cells.">Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).</li><li>Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+chemical+cleaning+methods+of+glass+in+preparation+for+silanization.">Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization.</a> Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).</li><li>Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Stimulated+Uncapping+Process+of+Gold-Capped+Mesoporous+Silica+Nanoparticles.">Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).</li><li>Murphy, D. B., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+2:+Light+and+Color.">Ch 2: Light and Color.</a> Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , 21-33 (2012).</li><li>Wayne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+3:+The+Dependence+of+Image+Formation+on+the+Nature+of+Light.">Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light.</a> Light and Video Microscopy (Second Edition). , 43-78 (2014).</li><li>Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmonic+Behavior+of+Single+Gold+Dumbbells+and+Simple+Dumbbell+Geometries.">Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).</li><li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark-field+microscopy+studies+of+single+metal+nanoparticles:+understanding+the+factors+that+influence+the+linewidth+of+the+localized+surface+plasmon+resonance.">Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance.</a> Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).</li><li>Choo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-Dependent+Differential+Interference+Contrast+Inversion+of+Anisotropic+Gold+Nanoparticles.">Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).</li><li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon+Coupling+of+Gold+Nanorods+at+Short+Distances+and+in+Different+Geometries.">Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries.</a> Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li></ol>

Ved afbildning med DIC-mikroskopi er det vigtigt at optimere de optiske komponenter, før data indsamles. Selv mindre justeringer af polarisator i midten af et eksperiment kan resultere i betydelige påvirkninger af de endelige data6. Desuden, forskellige materialer kræver forskellige polarisator indstillinger. Selv om store trin størrelser blev udnyttet her til at demonstrere effekten af polariserings vinklen, er det i et faktisk eksperiment bydende nødvendigt at optimere polarisator indstilli...

Siden 1980 ' erne er differentialinterferens kontrast (DIC) mikroskopi i vid udstrækning blevet betragtet som en vigtig billedbehandlings metode, der er forbeholdt mikroskaleringsobjekter inden for de biologiske videnskaber. Men i løbet af sin udvikling i 1950 ' erne og 1960 ' erne, var det tænkt som en teknik for materialevidenskab1. Med de seneste fremskridt i de materielle videnskaber i forbindelse med plasmonic nanopartikler, en øget interesse i karakterisering af materialer med optisk mikroskopi har fundet sted.
Mange optiske teknikker er helt sikkert til rådighed for nanomateriale karakterisering (f. eks mørke felt, brightfield, polariseret lys, fluorescens, etc.). Mørkt felt er meget populært i nanopartikel forskning, men det er udelukkende baseret på indsamling af scatter og giver begrænset information om komplekse prøver2. Fluorescens kan være nyttig, men kun med prøver, der luminesce eller som kan være korrekt farves. DIC mikroskopi har flere træk, der gør det til et værdifuldt værktøj til analyse af nanopartikler. De hyppigst anførte fordele ved DIC i forhold til andre metoder og med hensyn til plasmonic nanopartikler er: ingen prøve farvning kræves, ingen Halo effekter, overfladisk dybdeskarphed, og høj lateral opløsning3. DIC har yderligere styrker, der er værdifulde for plasmonic nanopartikel forskning. Først og fremmest er to iboende og ortogononale polariserings felter til stede, og de kan måles samtidigt til spektroskopi formål2. For det andet, det depolariserede signal af nanopartikler er ikke fanget i det endelige billede2, som kan give anledning til alvorlig bekymring i mørke felt spektroskopi målinger.
Formålet med denne artikel er at give en klar metodologi for anvendelse af transmitteret-lys Nomarski DIC mikroskopi til at udføre spektroskopi på plasmoniske nanopartikler. Selvom DIC er en kraftfuld teknik, der kan anvendes på meget forskellige materialer, er det også en teknik, der kræver stor dygtighed og forståelse for at betjene det ordentligt, når Imaging nanopartikler. Transmissions baseret Nomarski DIC-mikroskopi har en kompleks lyskurve1 , som kun vil blive gennemgået kortvarigt. Det optiske tog af DIC vises i figur 1. Lys overføres gennem mikroskopet ved først at passere gennem en polarisator og en stråle-opdeling Nomarski prisme, før de bliver fokuseret af kondensatoren på prøve planet. Efter at have passeret målet, møder lyset en stråle-kombinering Nomarski prisme og en analysator, før du afslutter til detektoren. De to polarisatorer og Nomarski-prismer er afgørende for dannelsen af DIC-billedet og er ansvarlige for at producere di's to ortogonale polariserings felter1. For læseren interesseret i at vide mere om de arbejder principper og optiske sti Nomarski DIC mikroskoper, eller forskellene mellem Nomarski DIC og andre stilarter af DIC, henvises til andre velskrevne konti om disse emner1, 4 af , 5 ) i , 6 af , 7. der er
Det er lige så vigtigt at forstå den grundlæggende karakter af plasmonic nanopartikler, før du forsøger at udføre spektroskopi på dem, hvad enten det er med Nomarski DIC, mørkt felt, eller enhver anden mikroskopi teknik. På området for plasmonics defineres nanopartikler som partikler med dimensioner på skalaen 10-100 nm8,9. Nanopartikler kan antage mange former (f. eks. kugler, stænger, stjerner, dumbbells, etc.), og de fleste af deres vigtige egenskaber opstår som følge af interaktioner med lys i den ultraviolette-synlige-nær infrarød rækkevidde af det elektromagnetiske spektrum. Udtrykket "plasmonic" er ikke begrænset til nanopartikler10; men når man diskuterer nanopartikler, anvendes det som reference til lokaliseret overflade Plasmon resonans (LSPR). LSPR er et fænomen, hvor lednings elektroner i en nanopartikel svinger på grund af en Coulombic interaktion med elektromagnetisk stråling af et meget specifikt og relativt smal frekvensbånd8. Ved disse samme frekvenser udviser plasmonic nanopartikler øget absorption og spredning af lys, hvilket gør dem observerbare med optisk mikroskopi. I mange tilfælde foretrækkes det at observere nanopartiklerne, mens du placerer båndpas filtre før kondensatoren2, for at forbedre billedbehandlings kontrast og for at eliminere lys, der ikke inducerer lspr-effekten. Brug af filtre gør det også muligt at udføre enkelt partikel spektroskopi eksperimenter.
LSPR-relaterede optiske adfærd er meget afhængig af størrelsen og formen af nanopartiklerne, og det kan undersøges med mange optiske mikroskopi teknikker. Men for at dechifrere orientering information af plasmonic nanopartikler med en Anisotropisk (dvs., ikke-sfærisk) form, er det nødvendigt at udnytte polarisering af lys felt. Ved forsigtigt at rotere polariserings feltet eller prøve substratet i små intervaller er det muligt at overvåge de orienterings afhængige spektroskopiske egenskaber for de enkelte nanopartikler. Rotation og polarisering kan også hjælpe med at afgøre, om en spektral funktion skyldes en dipolær eller højere ordre svingning af nanoparti Rens overfladeelektroner. I tilfælde af isotropiske (dvs. sfæriske) nanopartikler forbliver spektral profilen dog i det væsentlige uændret, når prøven drejes under polariseret lys.
Når de ses gennem et DIC-mikroskop (figur 2), har nanopartikler en luftig disk med et skygge støbt hvidt og sort udseende mod en grå baggrund. Sfæriske nanopartikler vil bevare dette udseende under rotation og med skiftende af båndpas filtre; men partiklerne vil gradvist forsvinde fra visningen, da filterets centrale bølgelængde bliver yderligere adskilt fra sfærens eneste dipolære LSPR bølgelængde11. Udseendet af nanoroder kan ændre ganske dramatisk, da de er roteret2. Nanorods har to LSPR-bånd med dipolær opførsel, hvis placering er baseret på nanorods ' fysiske dimensioner. Når længdeaksen af en nanorod er orienteret parallelt med en af de DIC polariserings felter, vil den luftige skive vises alle hvide eller alle sorte, hvis de ses med et båndpas filter forbundet med denne LSPR bølgelængde. Efter rotation af prøven 90 °, vil det tage på den modsatte farve. Alternativt, da den tværgående akse af en nanorod er vinkelret på længdeaksen, vil stangen tage på den modsatte farve, når du skifter mellem filtre, der matcher LSPR bølgelængder for de to akser. På andre retninger og filterindstillinger, vil nanoroder fremstå mere som kugler, præsenterer en række skygge-støbt luftige skive mønstre. For nanoroder med en tværakse < 25 nm kan det være svært at detektere signal ved den pågældende lspr-bølgelængde ved hjælp af DIC-mikroskopi.
For at udføre enkelt partikel spektroskopi er det vigtigt at bruge de korrekte optiske komponenter og at justere dem korrekt. Der skal anvendes et objektiv, der kan bruges til DIC-mikroskopi. For enkelt partikel eksperimenter er 80x eller 100x olie mål ideelle. Nomarski DIC prismer normalt kommer i tre varianter: standard, høj kontrast, og høj opløsning. Den ideelle type afhænger i høj grad af formålet med eksperimentet og størrelsen af nanopartiklerne. Standard prismer er fint til mange eksperimenter; men når man arbejder med mindre nanopartikler (< 50 nm), kan høje kontrast prismer være gavnlig, da partikel kontrasten aftager, efterhånden som partiklerne falder i størrelse11. Justering af DIC kontrast opnås enten ved at rotere en polarisator eller ved at oversætte en af de DIC prismer, afhængigt af mikroskopet mærke eller model6.
Efter indstilling Kohler belysning og polarisator indstillinger, er det vigtigt at ikke justere disse indstillinger, mens indsamling spektroskopi data. Desuden skal et konstant gennemsnitligt baggrunds signal holdes på alle tidspunkter under dataindsamlingen, selv når der skiftes mellem filtre og vinkel indstillinger. Den faktiske ideelle baggrund værdi afhænger af det dynamiske område af det videnskabelige kamera, men generelt bør baggrunden være i intervallet 15% – 40% af den maksimale detekteringsniveau af kameraet. Dette reducerer sandsynligheden for mætning af kamerasensoren, samtidig med at den optimale partikel kontrast aktiveres. Til indsamling af spektroskopi data, er det nødvendigt at arbejde med et videnskabeligt kamera, der fanger billeder i sort og hvid, i modsætning til et farvekamera.
Prøveforberedelse er et andet kritisk aspekt af Imaging plasmonic nanopartikler. Det er bydende nødvendigt, at operatørerne af DIC-mikroskopi har en forståelse af prøvens optiske egenskaber og af prøvens substrat. "Pre-renset" mikroskop glas er ikke tilstrækkeligt forberedt til billedbehandlings nanopartikler, og det skal rengøres grundigt før prøven aflejres for at sikre uhindret observation af prøven. Mange rense protokoller for mikroskop-slides er tidligere dokumenteret12, men det er ikke et skridt, der normalt rapporteres i eksperimentelle undersøgelser.
Endelig, dataanalyse metoder er den endelige komponent til enkelt partikel spektroskopi. Den maksimale og mindste intensitet for hver nanopartikel skal måles, samt den lokale baggrunds gennemsnit. Partiklerne af interesse bør placeres i områder uden baggrunds affald, substrat defekter eller ujævn belysning. En metode til bestemmelse af spektral profilen af en nanopartikel er ved at beregne partikel kontrast ved hver bølgelængde ved hjælp af ligningen under11,13,14,15:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg">
Alternativt kan en enkelt partikls spektrum opdeles i dets individuelle maksimale og minimale signalkomponenter, som repræsenterer DIC to polariserings felter, hvorved de to samtidigt indsamlede Direct-afhængige spektre vises. gennem de to ligninger:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg">
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg">

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1117px;" width="1117">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Contrad 70</td>
			<td style="width:228px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:157px;">1002</td>
			<td style="width:439px;">For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ethanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">A962-4</td>
			<td>For cleaning and storing microscope glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Glass microscope cover slips</td>
			<td style="width:228px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:157px;">260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:228px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:157px;">26007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Gold nanorods</td>
			<td style="width:228px;">Nanopartz</td>
			<td style="width:157px;">DIAM-SPR-25-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Gold nanospheres (80 nm)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">742023-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">ImageJ</td>
			<td style="width:228px;">NIH</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td>Free Software availabe for data analysis from NIJ</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:293px;">Nail polish</td>
			<td style="width:228px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:157px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Nikon Ti-E microscope</td>
			<td style="width:228px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:228px;">Airgas</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:228px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:157px;">77054098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Scribing pen</td>
			<td style="width:228px;">Amazon</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td>Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ultrapure water</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>18 megaohm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing spectroscopy on plasmonic nanoparticles with transmission-based nomarski-type differential interference contrast microscopy

Differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi er et kraftfuldt billedbehandlings værktøj, der er mest almindeligt anvendt til billedbehandlings mikroskop objekter ved hjælp af synligt lys. Formålet med denne protokol er at gøre detaljeret rede for en gennemprøvet metode til fremstilling af plasmidiske nanopartikler og udføre enkelt partikel spektroskopi på dem med DIC-mikroskopi. Flere vigtige trin skal følges nøje for at udføre gentagelig spektroskopi eksperimenter. For det første kan landmærker ætses ind i prøve substratet, som hjælper med at lokalisere prøveoverfladen og i at spore området af interesse under eksperimenter. Dernæst skal substratet renses ordentligt for snavs og kontaminanter, som på anden måde kan hæmme eller sløre undersøgelsen af prøven. Når en prøve er korrekt forberedt, skal den optiske vej af mikroskopet justeres ved hjælp af Kohler belysning. Med en standard Nomarski stil DIC mikroskop, kan rotation af prøven være nødvendig, især når de plasmonic nanopartikler udviser orienterings afhængige optiske egenskaber. Fordi DIC mikroskopi har to iboende ortogononale polariserings felter, afslører bølge-afhængig DIC kontrast mønster orienteringen af stang formede plasmaale nanopartikler. Endelig skal dataindsamling og dataanalyser udføres omhyggeligt. Det er almindeligt at repræsentere DIC-baserede spektroskopi-data som en kontrast værdi, men det er også muligt at præsentere den som intensitets data. I denne demonstration af DIC for enkelt partikel spektroskopi, er fokus på sfæriske og stang formede guld nanopartikler.

Når man arbejder med prøver, der er store nok til at blive set med det blotte øje, er det normalt ikke nødvendigt at placere landemærker på glas substratet. Når der arbejdes med nanomaterialer, eller når der kræves rotation af prøven, kan landemærker dog give en nem metode til at finde, skelne mellem og spore retningen af prøven. Selv om mere sofistikerede teknikker kan udnyttes til at forlade vartegn på glas substrater17, skrabe glasset med en opstreg...

Watch this Scientific Journal Video about Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy at JoVE.com

Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

Formålet med denne protokol er at gøre detaljeret rede for en dokumenteret tilgang til fremstilling af plasmidiske nanopartikler og for at udføre enkelt partikel spektroskopi på dem med differentiale interferens kontrast (DIC) mikroskopi.

Udfører spektroskopi på Plasmonic nanopartikler med transmission-baseret Nomarski-type differential interferens kontrast mikroskopi

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

DIC-mikroskopi er bedre end mørkt felt ved billeddannelse plasmoniske nanopartikler i komplekse miljøer. DIC kræver imidlertid også større viden og færdigheder for at opnå reproducerbare resultater. DIC-mikroskopi giver både høj lateral opløsning og lav dybdeskarplynge.Begge disse træk er ekstremt vigtige, når nanopartikler overvåges i celler eller i komplekse miljøer. Til at begynde, skal du bruge en skriblepen til at placere en lavvandet og kort ridse mærke på midten af hvert glas coverslip, og derefter rense glasset som beskrevet i den medfølgende tekst protokol. Brug derefter en mikropipette til at fjerne 100 mikroliter af en 05-milligram-per-milliliter guld nanopartikel opløsning fra sin oprindelige opbevaringsbeholder, og skubbe opløsningen i en 1,5-milliliter centrifuge rør.Centrifuge prøven i 10 minutter ved 6,000 gange tyngdekraften. Når du er færdig, fjernes supernatanten med en mikropipette for at slippe af med det overskydende overfladeaktive stof fra nanopartikelopløsningen. Dernæst tilsættes 100 mikroliter ultra-rent vand til centrifugerøret.Kort vortex prøven til at bryde op pellet, og derefter sonikere det i 20 minutter umiddelbart efter at fuldt resuspendere nanopartikel aggregater. Ved hjælp af en mikropipette, dropcast seks mikroliter af nanopartikel opløsning på den rensede og ridsede glas coverslip. Vend derefter forsigtigt dækslæden og læg den oven på et andet større mikroskopglas.Dråben skal hurtigt fordeles jævnt mellem de to glasstykker. Pas på at undgå at få luftbobler fanget mellem de to stykker glas. Brug en smal linje af neglelak til at forsegle kanterne af dækslæbet for at forhindre fordampning af væsken.Anberet prøven på mikroskopstadiet, og juster mikroskopets mål og kondensator. Juster fokus for at finde brændplanet med prøven på det og find det ridsemærke, der blev oprettet tidligere. Fokuser på det og finjuster fokus, indtil nanopartiklerne kommer til syne.For at bestemme den nøjagtige placering af kondensatoren, udnytte Kohler belysning metode ved at starte med 20x mål, og derefter flytte til høje forstørrelser såsom 80 eller 100x. Vælg derefter et område af interesse inden for eksemplet til billedbehandling. Centrer regionen i kameraets synsfelt, og juster fokus efter behov.Hvis mikroskopet har de Senarmont-designet, skal du starte med polarisatoren, der er indstillet tæt på maksimal baggrundsudryddelse, og drej gradvist polarisatoren mod faldende baggrundsudryddelse. Baggrundsintensiteten vil gradvist stige. Den ideelle indstilling opnås, når nanopartiklerne når deres største intensitetsforskel i forhold til det lokale baggrundsgennemsnit.For plasmoniske nanopartikler opnås den største kontrast typisk med en relativt mørk baggrund ved eller i nærheden af den maksimale baggrundsudryddelse. Sluk for rumbelysning for at forhindre omstrejfende belysning i at interagere med processen. Sæt en 10-nanometer fuld bredde på halv-maksimal band-pass filter med sin centrale bølgelængde co-placeret med de vigtigste lokaliserede overflade plasmon resonans bølgelængde for at se regionen af interesse.Juster derefter lampens intensitet eller eksponeringstid, indtil baggrundsniveauet er på 5 % til 40 % af kameraets maksimale kapacitetsniveau. Ingen objekter i området af interesse bør udvise signalintensiteter, der overstiger 90% af kameraets maksimale intensitet niveau. Billede prøven med en række bånd-pass filtre, der hver har en fuld bredde på halv-maksimum på 10 nanometer, og at som helhed muliggøre billeddannelse på tværs af hele bølgelængde vifte af interesse.Sørg for, at baggrundsintensiteten i billederne forbliver inden for 5 % af hinanden ved at justere eksponeringstiden og ikke lampens effekt. Når du har skiftet filtre, skal du fokusere prøven igen, før du tager billeder. Gem billederne som ukomprimerede TIFF-filer og/eller i softwarens oprindelige filformat for at bevare alle relevante oplysninger.Hvis du vil begynde analysen, skal du åbne billedet med ImageJ. Brug rektangelværktøjet til at tegne et rektangel rundt om det primære interesseområde. Vælg derefter billede på værktøjslinjen, gå til zoom, og vælg til markering.Billedvinduet zoomer ind på det markerede område. Vælg derefter billede, gå til justering, og vælg lysstyrke/kontrast. Hvis du vil forbedre visningen af eksempelområdet, skal du justere billedets minimum, maksimum, lysstyrke og kontrast.Disse justeringer ændrer ikke de videnskabelige data, de giver blot mulighed for bedre synlighed i stikprøveregionen. Brug nu rektanglet værktøjet igen og tegne en boks omkring den første nanopartikel, der skal måles. Boksen bør kun være lidt større end nanopartiklerns luftige skive.Når du er valgt, skal du gå til analyse og vælge målpunkt. Der vises et nyt vindue, der rapporterer minimum-, maksimum- og gennemsnitsintensiteten for de pixel, der er placeret inde i den markerede boks. Fastholdelse af den oprindelige størrelse af kassen, skal du trække boksen til et område umiddelbart ved siden af partiklen, hvor baggrunden kontrast er relativt jævn, og ingen partikler eller forurenende stoffer er til stede.Brug måleværktøjet igen til at bestemme gennemsnitsintensiteten for baggrundsområdet. Gentag denne proces for hver partikel i alle billederne i serien. Eksporter derefter dataene til et regneark for at beregne kontrasten eller intensiteten af hver partikel på tværs af alle bølgelængder og vinkler.Indtast i følgende ligning for at beregne hver partikel kontrast. Endelig grafer spektralprofilen på en given nanopartikelposition ved at afbilde data med bølgelængden langs X-aksen og kontrasten eller intensiteten langs Y-aksen. For at bestemme den optimale billeddannelse indstilling, disse guld nanospheres blev afbildet på flere polarisator indstillinger.Ved nul grader, partiklerne synes for det meste hvid med en mørk stribe løber over deres midtersektion. Dette er tegn på krydspolarisering for nanosfæreprøver. Når polarisatoren roteres til forskellige vinkler, kaster partiklerne mørke skygger mod det ene hjørne.Partikelkontrastværdierne ændrer sig dog dramatisk. For denne prøve er den optimale billeddannelsesindstilling med et polarisatorskift på 10 grader. Her er bølgelængden plottet mod kontrast af guld nanosfærer.Hvert datapunkt repræsenterer i gennemsnit 20 nanosfærer for hver partikeldiameter. Topkontrasten for hver partikel skifter en smule afhængigt af dens størrelse. Intensiteten og rotation er endnu vigtigere med anisotropiske former som denne guld nanorod.Her er bølgelængden plottet mod intensitet ved to forskellige polarisatorindstillinger. I hvert tilfælde er den lyse side intensitet meget stærkere end den mørke side's. Intensiteten profil af en enkelt guld nanorod på sin lokaliserede overflade plasmon resonans bølgelængde under rotation af scenen viser en stor intensitet forskel mellem de mørke og lyse sider, som prøven roteres gennem 180 grader.Prøve billeddannelse er yderst vigtigt. Det kræver både flid og tålmodighed fra mikroskopistens side. Hvis du udfører et eksperiment, der kræver reimaging prøven over en række dage, så landemærker såsom ridser er afgørende for at flytte dit område af interesse.DIC mikroskopi vokser i interesse af forskere, der studerer nanopartikler, især i dynamiske og cellulære miljøer. Fordi DIC tilbyder optimal rumlig opløsning, især i komplekse prøvetagningsmiljøer.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Template Directed Synthesis of Plasmonic Gold Nanotubes with Tunable IR Absorbance

Skabelon Instrueret Syntese af plasmoniske Guld Nanorør med Justerbar IR Absorbans

A nearly parallel array of pores can be produced by anodizing aluminum foils in acidic environments1, 2. Applications of anodic aluminum oxide (AAO) ...

Photochemical Oxidative Growth of Iridium Oxide Nanoparticles on CdSe@CdS Nanorods

Fotokemiske oxidative Vækst af Iridium Oxide Nanopartikler på CdSe @ CdS nanorods

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Væske-celle transmissions elektronmikroskopi til sporing samlesæt af nanopartikler

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Sondering struktur og dynamik Interfacial vand med Scanning Tunneling Mikroskopi og spektroskopi

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril

Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril

Kvantitativ SERS-påvisning af urinsyre via dannelse af præcise plasmoniske nanojunktioner inden for aggregater af guldnanopartikler og cucurbit[n]uril

This work describes a rapid and highly sensitive method for the quantitative detection of an important biomarker, uric acid (UA), via surface-enhanced ...

Preparation of Silver-Palladium Alloyed Nanoparticles for Plasmonic Catalysis under Visible-Light Illumination

Forberedelse af sølv-palladium legerede nanopartikler til plasmonisk katalyse under synlig lysbelysning

Localized surface plasmon resonance (LSPR) in plasmonic nanoparticles (NPs) can accelerate and control the selectivity of a variety of molecular ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomprøvesprængningsmikroskopi kombineret med infrarød spektroskopi som et værktøj til sonde enkelt bakteriekemi

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Studying the Effects of Temperature on the Nucleation and Growth of Nanoparticles by Liquid-Cell Transmission Electron Microscopy

Undersøgelse af temperaturens virkninger på kerner og vækst af nanopartikler ved liquid-cell transmission elektronmikroskopi

Temperature control is a recent development that provides an additional degree of freedom to study nanochemistry by liquid cell transmission electron ...

Synthesis of Metal Nanoparticles Supported on Carbon Nanotube with Doped Co and N Atoms and its Catalytic Applications in Hydrogen Production

Syntese af metalnanopartikler understøttet på kulstofnanorør med doterede Co- og N-atomer og dets katalytiske anvendelser i hydrogenproduktion

A method for facile synthesis of nanostructured catalysts supported on carbon nanotubes with atomically dispersed cobalt and nitrogen dopant is presented ...