Name: use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

ونحن نشكر الدكتور دانييل ر. لارسون لمساعدته السخية مع تركيب واستخدام ل العثور على الفور وتتبع البرنامج 13 والدعم التقني لجامعة نبراسكا لنكولن مجهرية الأساسية للتصوير المجهري [كنفوكل]. هذه الدراسة يمثل مساهمة من جامعة "نبراسكا شعبة البحوث الزراعية"، لينكولن في نبراسكا، وتدعمها "أموال هاتش نتحدث عنه" (NEB-26-206/الانضمام رقم-232435 ورقم NEB-26-231/الانضمام-1013511).

إجراءات الحيوان تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة نبراسكا-لينكولن وأجريت جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة. لهذه الدراسة، أووتبريد مؤتمر نزع السلاح-1 الفئران كانت متواصلة للوصول إلى تشو القوارض العادية والمياه؛ أنها اس?...

<ol>
	<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAMP-dependent+regulation+of+ovulatory+response+genes+is+amplified+by+IGF1+due+to+synergistic+effects+on+Akt+phosphorylation+and+NF-kB+transcription+factors.">CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors.</a> Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).</li><li>Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Single+Molecule+mRNA+Fluorescent+in+Situ+Hybridization+(RNA-FISH)+to+Quantify+mRNAs+in+Individual+Murine+Oocytes+and+Embryos.">Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).</li><li>Ruebel, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+modulates+inflammation+and+lipidmetabolism+oocyte+gene+expression:+A+single-cell+transcriptome+perspective.">Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).</li><li>Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).</li><li>Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNA+and+translation+in+the+mammalian+oocyte+and+embryo.">Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo.</a> PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+A+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology.">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li><li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Larson, B., Malayter, D., Shure, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Detection+of+Cytokine+Cancer+Biomarkers+using+Fluorescence+RNA+In+Situ+Hybridization+and+Cellular+Imaging.">Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging.</a> BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).</li><li>Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+&#946;-Actin+mRNA+Detection+in+Neurons+Reveals+a+Mechanism+for+Regulating+Its+Translatability.">Single &#946;-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability.</a> Science. 343 (6169), 419-422 (2014).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+better+mouse+embryo+assay:+effects+of+mouse+strain+and+in+vitro+maturation+on+sensitivity+to+contaminants+of+the+culture+environment.">Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).</li><li>Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+obesity+alters+the+steroidogenic+response+to+ovulatory+stimulation+and+increases+the+abundance+of+mRNAs+stored+in+the+ovulated+oocyte.">Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte.</a> Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).</li><li>Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-dependent+increases+in+oocyte+mRNAs+are+associated+with+increases+in+proinflammatory+signaling+and+gut+microbial+abundance+of+lachnospiraceae+in+female+mice.">Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice.</a> Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).</li><li>Hirao, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effect+of+visible+light+on+meiosis+of+mammalian+eggs+in+vitro.">Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. , (1978).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+Approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).</li><li>Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+follicle+culture+supports+primary+follicle+growth+through+paracrine-acting+signals.">Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals.</a> Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).</li><li>Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+Regulation+of+Kinase+Signaling+Pathways+by+AREs+and+GREs.">Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs.</a> Cells. 5 (1), 4 (2016).</li><li>Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Immunoprecipitation+for+Determining+RNA-Protein+Associations+In+Vivo.">RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).</li><li>Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative,+in+situ+analysis+of+mRNAs+and+proteins+with+subcellular+resolution.">Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).</li><li>Voigt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Quantification+of+Translation-Dependent+Association+of+mRNAs+with+the+Endoplasmic+Reticulum.">Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum.</a> Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).</li><li>Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRICK:+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals.">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods in Enzymology. 572, (2016).</li><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+the+next+challenge.">Phenomics: the next challenge.</a> Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).</li><li>Freimer, N., Sabatti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Phenome+Project.">The Human Phenome Project.</a> Nature Genetics. 34, 15 (2003).</li></ol>

سوف تضمن سلسلة من الخطوات البسيطة خلال البروتوكول fluorescence ناجحة ودقيقة تهم مرناس. أولاً، يجب إجراء البروتوكول فورا بعد جمع والتثبيت لبويضات. لاحظ أن تتم إضافة حماية الأصناف النباتية إلى المخزن المؤقت التثبيت بارافورمالدهيد 4% لمنع بويضات من الالتصاق ببعضها البعض. وجدنا أنه من الضروري إجرا...

وقد عكس المنتسخة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) معيار الذهب كوانتيتاتيون مرناً. وتستخدم حاليا فحوصات اثنين والرقمية بكر (دبكر)1 والوقت الحقيقي، والكمية بكر (qPCR)2 . تقنيات PCR اثنين، قد دبكر حساسية أكبر من قبكر مما يوحي بأنه يمكن استخدامه لقياس وفرة مرناً في الخلايا المفردة. ومع ذلك، أنتج تحليل دبكر مرناس وفرة منخفضة في برك من 5 إلى 10 بويضات كل كل عينة تجريبية في أيدينا، البيانات مع إمكانية تكرار نتائج منخفضة وعالية التباين3. ومن المرجح نتيجة لخطأ التجريبية المرتبطة باستخراج الحمض النووي الريبي وكفاءة النسخ العكسي. تسلسل الحمض النووي الريبي قد أجريت باستخدام ماوس واحدة وبويضات بشرية4،5. ويتطلب هذا الأسلوب كدنا التضخيم الخطوات المطلوبة لتوليد المكتبة مما يزيد من احتمال تقلب داخل مجموعة تجريبية. وعلاوة على ذلك، قد لا تكون النصوص وفرة منخفضة قابلة للاكتشاف. على الرغم من أن تسلسل الأسعار تراجعت في السنوات القليلة الماضية، لا يزال يمكن أن يكون تكلفة باهظة بسبب التكلفة العالية للتحليلات المعلوماتية. وأخيراً، مرناً الترجمة عملية دينامية مع التغيرات المكانية المساهمة في وظيفة البروتين6. ولذلك، نحن المبينة على اعتماد أسلوب التي ستنتج التدابير الكمية الدقيقة واستنساخه وتوطين مرناس الفردية في بويضات واحد.
تشعبت الحمض النووي بالإضافة إلى الأسفار في التهجين الموقعي تضخيم الإشارات fluorescence بدلاً من زيادة الحمض النووي الريبي/كدنا تمكين الكشف عن مرناس واحدة في الخلايا الفردية 7،،من89. الفحص يتم من خلال سلسلة من التهجين والتضخيم (باستخدام الحمض النووي تشعبت) والأسفار وسم خطوات من أجل تضخيم الإشارات fluorescence7. ويبدأ التقنية ملزمة أزواج مسبار اليغنوكليوتيد 18-25 قاعدة مكملة لمحددة مرناً3،،من810. أزواج التحقيق خمسة عشر إلى عشرين مصممة لخصوصية ضمان كل نسخة لنص الهدف. ويعقب التهجين مرناً على حدة تحقيقات ما قبل مكبر للصوت ومكبر للصوت التي تشكل تكويناً متفرع. تقريبا، ربط 400 التسمية fluorophores كل مكبر للصوت، أدى إلى زيادة 8000-fold في الأسفار يتيح الكشف عن مرناس الفردية (الشكل 1)11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg"> رقم 1: التخطيطي البروتوكول SM-الأسماك- التهجين متسلسلة من محاضر جلسات التحقيق المحددة، تشعبت الحمض النووي مكبر للصوت وفلوروفوري إلى هدف يرد مرناً. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
خلية الدراسات السابقة باستخدام جزيء واحد الأسفار في الموقع مرناس β-أكتين التهجين (SM-الأسماك) المترجمة في الخلايا العصبية الفردية12 وفيروس الورم الحليمي البشري الحمض النووي في سرطان عنق الرحم خطوط7. برامج الكمبيوتر "العثور على الفور" و "تتبع البرنامج" يحدد إشارة الفلورسنت الشروريه الفردية وقد استخدمت بنجاح لتقدير عدد مرناس في كل خلية3،13.
استناداً إلى نتائج الكشف مرناً في الخلايا العصبية12، افترضنا أن SM-الأسماك من شأنه أن يثبت أداة مفيدة كوانتيتاتي مستويات نسخة في بويضات مورين والأجنة بما في ذلك مرناس وفرة منخفضة. ومع ذلك، الأسلوب هو الأمثل للاستخدام مع خلايا ثابتة ملتصقة وفورمالدهايد ثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ أقسام الأنسجة (فب). لا يمكن أن تلتزم بويضات شريحة، حتى عندما كانوا المغلفة مع بولي-L-يسين. وعلاوة على ذلك، فأكثر هشاشة من خلايا جسدية وأقسام الأنسجة الناتجة في تحلل الخلية عند التعرض لبعض المخازن المؤقتة الملكية في مجموعات المتاحة تجارياً3. للتغلب على هذه التحديات، بويضات كانت ثابتة ونقلها يدوياً بين قطرات من المخازن المؤقتة. وعلاوة على ذلك، استعيض عن مخازن بيرميبيليزيشن، والمياه والصرف الصحي في المجموعات لتقليل تحلل الخلية. المسابر المصممة مسبقاً يتم شراؤها جنبا إلى جنب مع مجموعة الأسماك أو يمكن أن يطلب إلى وقائع محددة. يتوفر كل مجموعة التحقيق الملكية في واحدة من ثلاث قنوات الفلورية (C1 و C2 و C3) للسماح بالإرسال المتعدد. في التجربة الحالية، كانت بويضات موريني المزدوج الملون وكمياً باستخدام مجس C2 نانوج وتحقيق C3 Pou5f1 . واختيرت هذه المسابر استناداً إلى التعبير عنها نانج و Pou5f1 في بويضات والأجنة. في ختام خطوات التهجين، وضعت بويضات في قطرات من تصاعد تتلاشى المضادة وسائل الإعلام لتطبيقها على الشرائح النسيجي. واستخدمت الصور [كنفوكل] للتحديد الكمي لعدد الإشارات الفلورسنت الشروريه التي تمثل مرناس الفردية. بالإضافة إلى تحديد كمية مرناس، كما أظهر تصوير التوزيع المكاني مرناً محددة في الخلية، يتم فيها أساليب القياس الكمي الحمض النووي الريبي أخرى غير قادر على تحقيق. وتبين هذه التقنية قد تقلب منخفض داخل مجموعة تجريبية تسمح باستخدام عدد أقل من بويضات في كل مجموعة تجريبية لتحديد وجود اختلافات كبيرة بين المجموعات التجريبية3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="607">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">(&#177;)-&#945;-Lipoic acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T1395</td>
			<td style="width:172px;">Alpha Lipoic Acid</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">199899</td>
			<td>FAF BSA</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD 10mL TB Syringe</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">309659</td>
			<td>10 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">305109</td>
			<td>27 1/2 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7902</td>
			<td>CaCl2-2H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Citric acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2404</td>
			<td>Citrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G6152</td>
			<td>Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Easy Grip Petri Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">351008</td>
			<td>35 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Edetate Disodium</td>
			<td style="width:91px;">Avantor</td>
			<td style="width:123px;">8994-01</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:91px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14084-08</td>
			<td>Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:91px;">Atlanta biologicals</td>
			<td style="width:123px;">S10250</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">15710-064</td>
			<td>Gentamicin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GlutaMAX-I (100X)</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">35050-061</td>
			<td>Glutamax</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gold Seal Micro Slides</td>
			<td style="width:91px;">Gold Seal</td>
			<td style="width:123px;">3039</td>
			<td>25 x 75mm slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Gonadotropin, From Pregnant Mares&#39; Serum</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G4877</td>
			<td>eCG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">hCG recombinant</td>
			<td style="width:91px;">NHPP</td>
			<td style="width:123px;">AFP8456A</td>
			<td>hCG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3884</td>
			<td>Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jewelers Style Forceps</td>
			<td style="width:91px;">Integra</td>
			<td style="width:123px;">17-305X</td>
			<td>Forceps 4-3/8&#34;, Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">L-(+)-Lactic Acid, free acid&#160;</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">190228</td>
			<td>L-Lactate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M2773</td>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:91px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">25-025-Cl</td>
			<td>NEAA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-542-C</td>
			<td>25 x 25x 0.15 mm cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501891-C2</td>
			<td>Nanog Probe</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501611-C3</td>
			<td>Pou5f1 Probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MOPS</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P6148</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PES 0.22 um Membrane -sterile</td>
			<td style="width:91px;">Millex-GP</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>0.22 um filters</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0930</td>
			<td>PVP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60128</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60218</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:91px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">P36934</td>
			<td>Antifade reagent without DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320858</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 1</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320852</td>
			<td>Amplifier 1</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 2</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320853</td>
			<td>Amplifier 2</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 3</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320854</td>
			<td>Amplifier 3</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT A</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320855</td>
			<td>Amplifier 4 ALT A</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT B</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320856</td>
			<td>Amplifier 4 ALT B</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT C</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320857</td>
			<td>Amplifier 4 ALT C</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320851</td>
			<td>FISH Reagent Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320871</td>
			<td>Negative Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Positive Control</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320881</td>
			<td>Positive Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe Diluent</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">300041</td>
			<td>Probe Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnositics</td>
			<td style="width:123px;">322337</td>
			<td>Protease III</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III &#38; IV Reagent Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322340</td>
			<td>FISH Protease Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease IV</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322336</td>
			<td>Protease IV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">S/S Needle with Luer Hub 30G</td>
			<td style="width:91px;">Component Supply Co.</td>
			<td style="width:123px;">NE-301PL-50</td>
			<td>blunt 30 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6191</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">306576</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium pyruvate, &#62;= 99%</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5280</td>
			<td>Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Solution 6 Well Dish</td>
			<td style="width:91px;">Agtechinc</td>
			<td style="width:123px;">D18</td>
			<td>6 well dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Taurine</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8691</td>
			<td>Taurine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue Culture Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">353002</td>
			<td>60 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes

وتشمل الأساليب الحالية المستخدمة بشكل روتيني لتقدير مرناً في بويضات والأجنة الرقمي النسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (دبكر) والكمية، في الوقت الحقيقي RT-PCR (RT-qPCR) وتسلسل الحمض النووي الريبي. عندما يتم تنفيذ هذه التقنيات باستخدام واحدة من البويضات أو الأجنة، لا يتم كشف مرناس منخفضة-نسخة موثوق بها. للتغلب على هذه المشكلة، بويضات أو أجنة يمكن أن تجمع معا للتحليل؛ ومع ذلك، وهذا غالباً ما يؤدي إلى تباين عال بين العينات. في هذا البروتوكول، يصف لنا استخدام الفلورية في الموقع التهجين (الأسماك) استخدام تشعبت كيمياء الحمض النووي. ويحدد هذا الأسلوب النمط المكاني مرناس في الخلايا الفردية. عندما يقترن التقنية "العثور على الفور" وتتبع برامج الكمبيوتر، يمكن أيضا قياس وفرة مرناس في الخلية. باستخدام هذا الأسلوب، وهناك انخفاض تقلب داخل مجموعة تجريبية وعدد أقل من بويضات والأجنة هي المطلوبة للكشف عن اختلافات كبيرة بين المجموعات التجريبية. متوفرة تجارياً الحمض النووي تشعبت SM-مجموعات الأسماك قد تم الأمثل للكشف عن مرناس في مقطعة الأنسجة أو الخلايا ملتصقة على الشرائح. ومع ذلك، بويضات لا تلتزم بشكل فعال الشرائح وبعض الكواشف في المجموعة التي كانت قاسية جداً أدى إلى تفسخ البويضيه. لمنع هذا تحلل، تم إجراء تعديلات عدة لطقم السمك. على وجه التحديد، استبدال البويضيه مخازن بيرميبيليزيشن، والمياه والصرف الصحي المصممة الفلورة بويضات والأجنة في مخازن الملكية. أجريت بيرميبيليزيشن ويغسل، وإينكوبيشنز مع تحقيقات ومكبر للصوت في لوحات 6-جيدا ووضعت بويضات على الشرائح في نهاية البروتوكول باستخدام وسائل الإعلام المتزايدة. وكانت هذه التعديلات قادرة على التغلب على القيود المفروضة على عدة متاحة تجارياً، على وجه الخصوص، تحلل البويضيه. بدقة، وتكاثر عدد مرناس في بويضات الفردية، تم استخدام برامج الكمبيوتر. معا، وهذا البروتوكول يمثل بديلاً لبكر وتسلسل مقارنة التعبير عن وقائع محددة في الخلايا المفردة.

عند انتهاء البروتوكول، وسوف تكون النتيجة صور منفردة من سلسلة z [كنفوكل] (4A الشكل و الشكل 5)، مخيط الصور (الشكل 4)، وتحسب مرناً (الشكل 4)- عندما يتم إجراء الإرسال المتعدد، سيكون هناك أ?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

لعد تكاثر عدد مرناس في بويضات الفردية، صف واحد جزيء الحمض النووي الريبي في الموقع الأمثل التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك) للخلايا غير ملتصقة. بويضات جمعت وتهجين مع تحقيقات محددة نسخة، وكمياً باستخدام برنامج تقدير حجم صورة.

استخدام "واحد جزيء فلوري في الموقع التهجين" (SM-الأسماك) إلى مرناس Quantify و Localize في "بويضات مورين"

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

هذه التقنية لا تسمح فقط توطين، ولكن أيضا كمية من mRNAs المرشح في البويضات الفردية والأجنة. مقارنة مع المقايسات الأخرى، بما في ذلك PCR، والانتهاء من نتائج تقنية في بيانات استنساخ مع اختلاف منخفض. إثبات الإجراء سيكون (كيلسي تيمي) طالبة دراسات عليا في مختبريابدأ هذا الإجراء بإعداد المادة المطلوبة وفئران الإناث في عمر خمسة إلى ثمانية أسابيع كما هو موضح في بروتوكول النص. تنظيف الماوس باستخدام 70٪ الإيثانول. كشف تجويف البطن وتصور الجهاز التناسلي للأنثى.أمسك المبيض مع ملقط وإزالة أربطة الرحم والأنسجة الدهنية الزائدة من جميع أنحاء المبيض. قطع oviduct من الرحم. ثم، ضع زوج أوفيدوج المبيض في عقد دافئ المتوسطة في طبق 35 ملليمتر.إزالة المبيض وأي الأنسجة الدهنية المحيطة. المسيل للدموع ampullae منتفخة من oviduct باستخدام نصف بوصة 27 قياس إبرة. دفع oviduct في موقع المسيل للدموع وسيتم طرد مجمعات البويض خلية cumulus.باستخدام ماصة الفم لنقل البويضات المبيضة إلى قطرة 100 ميكرولتر التي تحتوي على عقد المتوسطة مع الهيالورونيداز. لطرد خلايا الركام، الماصات ميتافاسيس اثنين من مجمعات الخلايا البويضية عابس صعودا وهبوطا في الهيالورونيداس التي تحتوي على عقد المتوسطة مع ماصة الفم. مرة واحدة أنها خالية من خلايا الركام، واستخدام ماصة الفم لنقل كل بويضة إلى قطرة غسل تحتوي على المتوسط فقط عقد.كرر هذا لكل قطرة الغسيل. لا تقم بنقل البويضات المجزأة أو الشفافة. لأداء تلطيخ SM-FISH، قم أولاً بإصلاح البويضات في بئر فردية من لوحة 6 آبار تحتوي على 500 ميكرولترات من مخزن التثبيت المؤقت.غمر 20 بويضة أو أقل في البئر. احتضان البويضات في حاجز التثبيت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل البويضات كما هو موضح في بروتوكول النص، بويضات احتضان في عازلة permeablization لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد غسل آخر، نقل البويضات إلى 80 ميكرولترات من protease المخففة مسبقا ثلاثة العازلة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمييع مجموعات مسبار دافئ ل Nanog ، Pou5f1 ، وDapB واحد إلى 50 في مسبار diluent. تحضن البويضات في 80 ميكرولترات من التحقيق المحدد نسخة لمدة ساعتين في 40 درجة مئوية.عندما تكون البويضات في المسبار والمخازن AMP ، فإنها تميل إلى التعويم. من الضروري أن تغمر البويضات عن طريق دفعها بلطف إلى المخزن المؤقت. نقل البويضات إلى 500 ميكرولترات من عازلة غسل واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.الآن، بويضات احتضان بشكل تسلسلي في مخازن التضخيم. أولا، احتضان البويضات في 80 ميكرولترات من AMP1 لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية. ثم نقل البويضات إلى 500 ميكرولترات من العازلة غسل لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.المقبل، احتضان البويضات في 80 ميكرولترات من AMP2 لمدة 15 دقيقة في 40 درجة مئوية. بعد غسل البويضات كما كان من قبل، احتضان البويضات في 80 ميكرولترات من AMP3 لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية تليها غسل النهائي. وأخيرا، إضافة البويضات إلى 80 ميكرولترات من AMP4FL لمدة 15 دقيقة في 40 درجة مئوية.ماصة 12 ميكرولترات من مضادة تتلاشى تصاعد المتوسطة على وسط شريحة دون إضافة فقاعات إلى الكاشف. نقل البويضات مع أقل قدر ممكن من الغسيل العازلة في المتوسطة المتصاعدة. وأخيراً، قم بتطبيق قسيمة زلة.صور البويضات ثلاثية الأبعاد باستخدام المجهر النقوش ثلاثي الخطوات وحفظ الصور كما هو موضح في بروتوكول النص. اسحب ملفات ND2 إلى فيجي واختر Hyperstack. انقر فوق علامة التبويب صورة، حدد اللون، وانقر على تقسيم الأقنية لفصل القنوات الفلورية للملف ND2.إنشاء ملفات TIFF فردية لكل شريحة Z من البويضات في كل قناة فلورية. للقيام بذلك، انقر فوق علامة التبويب صورة، حدد مكدسات، ثم انقر فوق مكدس إلى صور. ثم انقر فوق علامة التبويب صورة، حدد الكتابة، وانقر فوق RGB Color لتحويل كل شريحة Z إلى صورة ملونة RGB فردية.حفظ كل صورة تم تحويلها كملف TIFF. ضع صورًا من بويضة واحدة لكل قناة فلورية في مجلد جديد لتجنب الارتباك أثناء الخياطة. بعد تسوية الملفات كما هو موضح في بروتوكول النص، انقر فوق علامة التبويب الإضافات، وحدد خياطة، وانقر على مجموعة الشبكة.حدد صور متسلسلة من القائمة المنسدلة وانقر على "حسنا". تصفح الدليل وحدد المجلد الذي يحتوي على كافة الصور شريحة Z لبويضة فردية في طول موجة واحد. انقر فوق "حسناً".حرك شريط التمرير الموجود في أسفل الصورة المخيطة إلى قناة اللون المناسبة للطول الموجي المستخدم. إنشاء الصورة النهائية RGB مخيط عن طريق النقر على صورة، وتحديد نوع، والنقر على RGB اللون. قم بتحويل الصورة المخيطة إلى صورة مُسقطة بحد أقصى 32 بت.للقيام بذلك، انقر فوق صورة، حدد الكتابة، وانقر فوق 32 بت. حفظ هذه الصورة كملف TIFF جديد. افتح الصورة المخيطة 32 بت في برنامج البحث عن النقاط وتتبعها.حدد القائمة المنسدلة Localize وانقر على Localize، والتي ستحسب عدد البقع الموجودة في الصورة. يظهر هنا هو الكم من mRNAs باستخدام مكتشف بقعة وتتبع. يشير السهم الأزرق إلى إشارة إيجابية فوق العتبة.السهم الأبيض يظهر بقعة الفلورسنت تحت العتبة وبالتالي لا يتم حسابها. تم تحليل تعدادات الـ MRNA في وقت لاحق باستخدام أداة تحليل بيانات قياسية. يتم عرض صور تمثيلية لصورة سلسلة Z الأوسط لPouf51 و Nanog.يتم عرض تلطيخ DAPI من الكروموسومات الانحياز على المغزل metaphase اثنين باللون الأبيض. وأظهرت البيانات التي تم جمعها في هذا البروتوكول 775 نسخة Pouf51 و 113 نسخة نانوغ في اثنين من البويضات metaphase. الأهم من ذلك، لم تكن هناك بقع اكتشفت في البويضات التي وصفت مع مسبار DapB، والتي كانت بمثابة السيطرة السلبية.عند استخدام الخلايا غير المنضمة، من المهم أن تحدد تجريبيا أفضل تخفيف من عازلة البروتياز من مجموعة SM-FISH. تم اختبار الكشف عن مرنا باستخدام منحنى المعايرة من تركيزات ثنائية ومخففة متعددة في 1xPBS. كان تخفيف البروتياز المستخدم في هذا البروتوكول من واحد إلى ثمانية حيث أظهر أدنى تباين في متوسط التعبير الفلوري لـ Pouf51 mRNA في البويضتين الفوقيتين.يمكن إجراء الفلور المناعي المتزامن للبروتين المستهدف من أجل المشاركة في توطين مرنا مع بروتين ملزم للرنا. يسمح التعريب المشترك للـ mRNAs مع بروتينات الربط الحمض النووي الريبي للمحققين بتحديد الآليات التي تنظم تخزين الحمض النووي الريبي (MRNA) والترجمة والتحلل داخل البويضة أو الجنين.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

الكشف عن المشترك بين الكروموسومات الزيغ مستقرة من قبل الإسفار متعددة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (mFISH) والطيفية تنميط نووي (سكاى) في الفئران المشعع

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

جيل من الإنشطار بروتين فلوري في<em&gt; المبيضات</em&gt; الأنواع

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

واحدة تحليل جزيء من الليزر المترجمة السورالين Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

التصور الحجمية في الشجاعة القراد بالجامعة-جبل في الموقع التهجين

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...