Name: use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

Vi takker Dr. Daniel R. Larson for hans generøse hjælp med installation og brug af i stedet at finde og programmet til sporing af 13 og teknisk støtte fra University of Nebraska Lincoln mikroskopi kerne for konfokalmikroskopi billeddannelse. Denne undersøgelse er et bidrag af University of Nebraska landbrugs forskning Division, Lincoln, Nebraska og blev støttet af UNL Hatch midler (NEB-26-206/tiltrædelse af-232435 og NEB-26-231/tiltrædelse nummer-1013511).

Animalske procedurer blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget på University of Nebraska-Lincoln og alle metoder blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og forordninger. For denne undersøgelse, outbred CD-1 mus havde ad libitum adgang til normale gnaver chow og vand; de blev opretholdt i en 12:12 mørke: lys cyklus.
1. forberedelse af krævede medier
<ol><li>Base medier (OMM), tilføje 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO<su...

<ol>
	<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAMP-dependent+regulation+of+ovulatory+response+genes+is+amplified+by+IGF1+due+to+synergistic+effects+on+Akt+phosphorylation+and+NF-kB+transcription+factors.">CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors.</a> Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).</li><li>Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Single+Molecule+mRNA+Fluorescent+in+Situ+Hybridization+(RNA-FISH)+to+Quantify+mRNAs+in+Individual+Murine+Oocytes+and+Embryos.">Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).</li><li>Ruebel, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+modulates+inflammation+and+lipidmetabolism+oocyte+gene+expression:+A+single-cell+transcriptome+perspective.">Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).</li><li>Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).</li><li>Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNA+and+translation+in+the+mammalian+oocyte+and+embryo.">Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo.</a> PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+A+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology.">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li><li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Larson, B., Malayter, D., Shure, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Detection+of+Cytokine+Cancer+Biomarkers+using+Fluorescence+RNA+In+Situ+Hybridization+and+Cellular+Imaging.">Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging.</a> BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).</li><li>Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+&#946;-Actin+mRNA+Detection+in+Neurons+Reveals+a+Mechanism+for+Regulating+Its+Translatability.">Single &#946;-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability.</a> Science. 343 (6169), 419-422 (2014).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+better+mouse+embryo+assay:+effects+of+mouse+strain+and+in+vitro+maturation+on+sensitivity+to+contaminants+of+the+culture+environment.">Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).</li><li>Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+obesity+alters+the+steroidogenic+response+to+ovulatory+stimulation+and+increases+the+abundance+of+mRNAs+stored+in+the+ovulated+oocyte.">Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte.</a> Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).</li><li>Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-dependent+increases+in+oocyte+mRNAs+are+associated+with+increases+in+proinflammatory+signaling+and+gut+microbial+abundance+of+lachnospiraceae+in+female+mice.">Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice.</a> Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).</li><li>Hirao, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effect+of+visible+light+on+meiosis+of+mammalian+eggs+in+vitro.">Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. , (1978).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+Approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).</li><li>Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+follicle+culture+supports+primary+follicle+growth+through+paracrine-acting+signals.">Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals.</a> Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).</li><li>Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+Regulation+of+Kinase+Signaling+Pathways+by+AREs+and+GREs.">Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs.</a> Cells. 5 (1), 4 (2016).</li><li>Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Immunoprecipitation+for+Determining+RNA-Protein+Associations+In+Vivo.">RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).</li><li>Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative,+in+situ+analysis+of+mRNAs+and+proteins+with+subcellular+resolution.">Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).</li><li>Voigt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Quantification+of+Translation-Dependent+Association+of+mRNAs+with+the+Endoplasmic+Reticulum.">Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum.</a> Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).</li><li>Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRICK:+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals.">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods in Enzymology. 572, (2016).</li><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+the+next+challenge.">Phenomics: the next challenge.</a> Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).</li><li>Freimer, N., Sabatti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Phenome+Project.">The Human Phenome Project.</a> Nature Genetics. 34, 15 (2003).</li></ol>

En række mindre trin under protokollen vil sikre vellykkede fluorescens og nøjagtige optællinger af mRNAs. Først skal protokollen udføres straks efter samling og fiksering af oocyter. Bemærk, at PVP er tilføjet til 4% PARAFORMALDEHYD fiksering buffer til at forhindre oocyter klistrer til hinanden. Vi fandt, at det er nødvendigt at udføre eksperimentet umiddelbart efter indsamling og fiksering af oocyter. Enhver forsinkelse resulterer i en meget lavere fluorescens signal, som ville resultere i undercounting af ud...

Reverse transkriptase Polymerasekædereaktionen (PCR) har været guldstandarden til mRNA-kvantificering. To assays, digital PCR (dPCR)1 og kvantitative, real time PCR (qPCR)2 bruges aktuelt. Af de to PCR teknikker har dPCR større følsomhed end qPCR tyder på, at det kunne bruges til at måle mRNA overflod i enkelte celler. Men i vores hænder, dPCR analyse af lav overflod mRNAs i puljer af 5 til 10 oocyter pr. hver eksperimentel prøve har produceret data med lav reproducerbarhed og høj variation3. Dette er sandsynligvis på grund af eksperimentelle fejl forbundet med RNA udvinding og reverse transkription effektivitet. RNA sekventering har også udført ved hjælp af en enkelt mus og menneskelige oocyter4,5. Denne teknik kræver cDNA forstærkning trin, der kræves for den bibliotek generation, hvilket sandsynligvis øger variation inden for en eksperimentel musikgruppe. Endvidere må lav overflod udskrifter ikke kunne påvises. Selvom sekventering priser er gået ned de sidste par år, kan det stadig være omkostningseffektivt uoverkommelige på grund af de høje udgifter til Bioinformatik analyser. Endelig, mRNA lokalisering er en dynamisk proces med rumlige ændringer bidrager til protein funktion6. Derfor, vi satte sig for at vedtage en teknik, der vil producere nøjagtige og reproducerbare kvantitative foranstaltninger og lokalisering af individuelle mRNAs i enkelt oocyter.
Forgrenede DNA koblet til fluorescens i situ hybridisering forstærker fluorescens signal snarere end forstærkende RNA/cDNA muliggør påvisning af enkelt mRNAs i enkelte celler 7,8,9. Analysen udføres gennem en række hybridisering, forstærkning (ved hjælp af forgrenede DNA) og fluorescens mærkning skridt for at forstærke fluorescens signal7. Teknikken, der begynder med bindingen af 18 - 25 base oligonukleotid sonde-par, der supplerer en specifik mRNA3,8,10. Femten til tyve sonde par er designet til hver afskrift sikring specificitet for target udskrift. MRNA-specifikke hybridisering er efterfulgt af pre-forstærker og forstærker sonder, der danner et forgrenet konfiguration. Ca, 400 etiket fluorophores binder til hver forstærker, hvilket resulterer i en 8000-fold stigning i fluorescens giver mulighed for påvisning af individuelle mRNAs (figur 1)11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg"> Figur 1: skematisk af SM-fisk protokol. Sekventiel hybridisering af udskrift specifikke sonde, forgrenet DNA forstærker og fluorophore til et mål mRNA er vist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tidligere undersøgelser ved hjælp af enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering (SM-fisk) lokaliseret β-actin mRNAs i individuelle neuroner12 og humant papillomvirus DNA i livmoderhalskræft celle linjer7. Computersoftware stedet at finde og programmet til sporing af identificerer enkelte punktformet fluorescerende signal og held har været anvendt til at opgøre antallet af mRNAs i hver celle3,13.
Baseret på resultaterne af mRNA påvisning i neuroner12, hypotese vi at SM-fisk ville vise sig at være et nyttigt redskab til at kvantificere udskrift niveauer i murine oocytter og embryoner herunder lav overflod mRNAs. Men teknikken er optimeret til brug med vedhængende fast celler og formaldehyd fast paraffin indlejret (FFPE) væv sektioner. Oocyter kan ikke overholde et dias, selv når de er belagt med Poly-L-lysin. Derudover er de mere skrøbelige end somatiske celler og væv sektioner resulterer i celle lysis når de udsættes for nogle af leverandørejet bufferne i kommercielt tilgængelige kits3. For at overvinde disse udfordringer, oocyter fast og manuelt overført mellem dråber af buffere. Desuden blev permeabilization og vask buffere i kits udskiftet for at reducere celle lysering. Foruddesignede sonder er købt sammen med fisk kit eller specifikke udskrifter kan bestilles. Hver proprietære sonde sæt er tilgængelige i en af tre fluorescens kanaler (C1, C2 og C3) at tillade multiplexing. I den aktuelle eksperiment var murine oocyter dual-farvede og kvantificeret ved hjælp af en C2 Nanog sonde og en C3 Pou5f1 sonde. Disse prober blev udvalgt på baggrund af de rapporterede udtryk for Nanog og Pou5f1 i oocytter og embryoner. Ved afslutningen af hybridisering trin blev oocyter placeret i dråber af anti-fade montering medier for ansøgning til histologisk dias. Konfokal billeder blev brugt til at opgøre antallet af punktformet fluorescerende signaler, som repræsenterer individuelle mRNAs. Ud over at kvantificere mRNAs, imaging viste også den geografiske fordeling af den specifikke mRNA i cellen, er som andre RNA kvantificering metoder ude af stand til at opnå. Denne teknik vist sig for at have lav variation inden for en eksperimentel musikgruppe der tillader anvendelse af mindre antal oocyter i hver eksperimentelle gruppe for at identificere væsentlige forskelle mellem eksperimentelle grupper3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="607">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">(&#177;)-&#945;-Lipoic acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T1395</td>
			<td style="width:172px;">Alpha Lipoic Acid</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">199899</td>
			<td>FAF BSA</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD 10mL TB Syringe</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">309659</td>
			<td>10 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">305109</td>
			<td>27 1/2 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7902</td>
			<td>CaCl2-2H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Citric acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2404</td>
			<td>Citrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G6152</td>
			<td>Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Easy Grip Petri Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">351008</td>
			<td>35 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Edetate Disodium</td>
			<td style="width:91px;">Avantor</td>
			<td style="width:123px;">8994-01</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:91px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14084-08</td>
			<td>Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:91px;">Atlanta biologicals</td>
			<td style="width:123px;">S10250</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">15710-064</td>
			<td>Gentamicin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GlutaMAX-I (100X)</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">35050-061</td>
			<td>Glutamax</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gold Seal Micro Slides</td>
			<td style="width:91px;">Gold Seal</td>
			<td style="width:123px;">3039</td>
			<td>25 x 75mm slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Gonadotropin, From Pregnant Mares&#39; Serum</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G4877</td>
			<td>eCG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">hCG recombinant</td>
			<td style="width:91px;">NHPP</td>
			<td style="width:123px;">AFP8456A</td>
			<td>hCG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3884</td>
			<td>Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jewelers Style Forceps</td>
			<td style="width:91px;">Integra</td>
			<td style="width:123px;">17-305X</td>
			<td>Forceps 4-3/8&#34;, Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">L-(+)-Lactic Acid, free acid&#160;</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">190228</td>
			<td>L-Lactate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M2773</td>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:91px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">25-025-Cl</td>
			<td>NEAA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-542-C</td>
			<td>25 x 25x 0.15 mm cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501891-C2</td>
			<td>Nanog Probe</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501611-C3</td>
			<td>Pou5f1 Probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MOPS</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P6148</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PES 0.22 um Membrane -sterile</td>
			<td style="width:91px;">Millex-GP</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>0.22 um filters</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0930</td>
			<td>PVP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60128</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60218</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:91px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">P36934</td>
			<td>Antifade reagent without DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320858</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 1</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320852</td>
			<td>Amplifier 1</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 2</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320853</td>
			<td>Amplifier 2</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 3</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320854</td>
			<td>Amplifier 3</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT A</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320855</td>
			<td>Amplifier 4 ALT A</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT B</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320856</td>
			<td>Amplifier 4 ALT B</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT C</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320857</td>
			<td>Amplifier 4 ALT C</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320851</td>
			<td>FISH Reagent Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320871</td>
			<td>Negative Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Positive Control</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320881</td>
			<td>Positive Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe Diluent</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">300041</td>
			<td>Probe Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnositics</td>
			<td style="width:123px;">322337</td>
			<td>Protease III</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III &#38; IV Reagent Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322340</td>
			<td>FISH Protease Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease IV</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322336</td>
			<td>Protease IV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">S/S Needle with Luer Hub 30G</td>
			<td style="width:91px;">Component Supply Co.</td>
			<td style="width:123px;">NE-301PL-50</td>
			<td>blunt 30 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6191</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">306576</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium pyruvate, &#62;= 99%</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5280</td>
			<td>Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Solution 6 Well Dish</td>
			<td style="width:91px;">Agtechinc</td>
			<td style="width:123px;">D18</td>
			<td>6 well dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Taurine</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8691</td>
			<td>Taurine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue Culture Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">353002</td>
			<td>60 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes

Nuværende metoder, der rutinemæssigt anvendes til at kvantificere mRNA i oocytter og embryoner omfatter digitale reverse-transskription polymerase kædereaktion (dPCR), kvantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) og RNA sekvensering. Da disse teknikker er udført ved hjælp af en enkelt oocyt eller embryo, er lav-kopi mRNAs ikke pålideligt registreret. For at løse dette problem, kan æg eller embryoner samles sammen til analyse. men dette fører ofte til stor variation blandt prøver. I denne protokol beskriver vi brugen af fluorescens i situ hybridisering (FISH) ved hjælp af forgrenede DNA kemi. Denne teknik identificerer den rumlige mønster af mRNAs i individuelle celler. Når teknikken er kombineret med stedet at finde og spore computersoftware, kan overfloden af mRNAs i cellen også kvantificeres. Brug af denne teknik, der er nedsat variabilitet i en eksperimenterende gruppe og færre oocytter og embryoner er forpligtet til at påvise betydelige forskelle mellem eksperimentelle grupper. Kommercielt tilgængelige forgrenet DNA SM-fisk kits har været optimeret til at registrere mRNAs i sektioneret væv eller vedhængende celler på dias. Men oocyter effektivt overholder ikke dias og nogle reagenser i sættet var for hårdt, hvilket resulterer i oocyt lysering. For at forhindre denne lysis, blev flere ændringer foretaget til fisk kit. Specifikt, erstattet oocyt permeabilization og vask buffere designet til immunfluorescens af oocytter og embryoner leverandørejet bufferne. Permeabilization, vasker og inkubationer med sonder og forstærker blev udført i 6-godt plader og oocyter blev placeret på dias i slutningen af protokollen ved hjælp af montering medier. Disse ændringer var i stand til at overvinde begrænsningerne af den kommercielt tilgængeligt kit, navnlig oocyt lysering. For at præcist og reproducerbar tælle antallet af mRNAs i individuelle oocytter, blev computersoftware brugt. Sammen, repræsenterer denne protokol et alternativ til PCR og sekventering at sammenligne udtryk for specifikke udskrifter i enkelte celler.

Efter afslutningen af protokollen vil medføre enkelte billeder fra Konfokal z-serie (figur 4A og figur 5), syet billeder (fig. 4 c), og mRNA tæller (figur 4B). Når multiplexing er udført, vil der også være flettede billeder viser etiketten for to forskellige mRNAs (figur 5)</st...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Hvis du vil reproducerbar tælle antallet af mRNAs i individuelle oocytter, enkelt molekyle RNA fluorescens in situ var hybridisering (RNA-fisk) optimeret til ikke-tilhænger celler. Oocytter blev indsamlet, hybridiseret med udskrift specifikke sonder og kvantificeres ved hjælp af et billede kvantificering software.

Brug af enkelt molekyle fluorescerende i Situ hybridisering (SM-fisk) til tal og Oversæt mRNAs i Murine oocyter

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Denne teknik giver mulighed for ikke kun lokalisering, men også kvantisering af kandidat mRNAs i de enkelte oocytter og embryoner. Sammenlignet med andre analyser, herunder PCR, resulterer færdiggørelsen af teknikken i reproducerbare data med lav variation. Demonstration af proceduren vil være Kelsey Timme, en kandidat studerende i mit laboratorium.Begynd denne procedure med fremstilling af det nødvendige materiale og hunmus fem til otte uger som beskrevet i tekstprotokollen. Rengør musen med 70% ethanol. Eksponere bughulen og visualisere den kvindelige reproduktive tarmkanalen.Hold æggestokken med scepinces og fjerne livmoderen ledbånd og overskydende fedtvæv fra omkring æggestokken. Skær fårukten ud af livmoderen. Derefter placere æggestokkene oviduct par i varm bedrift medium i en 35 millimeter skål.Fjern æggestokkene og eventuelle omkringliggende fedtvæv. Riv den hævede ampullae af oviduct ved hjælp af en halv tomme 27 gauge nål. Skub oviduct på det sted, hvor tåre og cumulus celle oocyt komplekser vil blive udvist.Ved hjælp af en mundpipette til at overføre de ægløsning oocytter til 100 microliter drop indeholder bedrift medium med hyaluronidase. For at løsne cumulus celler, pipette metafase to oocyte cumulus celle komplekser op og ned i hyaluronidase indeholder bedrift medium med munden pipette. Når de er blottet for cumulus celler, bruge munden pipetten til at overføre hver oocyt til en vask dråbe, der kun indeholder medium.Gentag dette for hver vaskedråbe. Overfør ikke fragmenterede eller gennemsigtige oocytter. For at udføre SM-FISH farvning, første fix oocytter i en individuel brønd af en seks brøndplade, der indeholder 500 mikroliter fiksering buffer.Nedsænk 20 oocytter eller mindre i brønden. Inkuber oocytterne i fikseringsbufferen i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter vask af oocytterne som beskrevet i tekstprotokollen skal du inkubere oocytter i permeablization buffer i 30 minutter ved stuetemperatur.Efter en anden vask overføres oocytterne til 80 mikroliter af fortyndet protease med tre buffer i 30 minutter ved stuetemperatur. Fortyndes de opvarmede probed sæt til Nanog, Pou5f1, og DapB en til 50 i sonde fortyndingstyndingstynding. Inkuber oocytter i 80 mikroliter af transskriptionsspecifikke sonde i to timer ved 40 grader Celsius.Når oocytter er i sonden og AMP buffere, de har tendens til at flyde. Det er vigtigt, at du nedsænker oocytterne ved forsigtigt at skubbe dem ind i bufferen. Overfør oocytterne til 500 mikroliter af vaskepude og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.Nu inkubere oocytter sekventielt i forstærkning buffere. Først inkubere oocytter i 80 mikroliter AMP1 i 30 minutter ved 40 grader Celsius. Overfør derefter oocytterne til 500 mikroliter af vaskepude i 10 minutter ved stuetemperatur.Dernæst inkubere oocytter i 80 mikroliter AMP2 i 15 minutter ved 40 grader Celsius. Efter vask oocytter som før, inkubere oocytter i 80 mikroliter af AMP3 i 30 minutter ved 40 grader Celsius efterfulgt af en endelig vask. Endelig tilsættes oocytter til 80 mikroliter AMP4FL i 15 minutter ved 40 grader Celsius.Pipette 12 mikroliter af anti-fade monteringsmedium på midten af et dias uden at tilføje bobler til reagenset. Overfør oocytter med så lidt vaskebuffer som muligt ind i monteringsmediet. Endelig skal du anvende en følgeseddel.Billede de tredimensionelle oocytter ved hjælp af Z-trins konfokal mikroskopi og gem billederne som beskrevet i tekstprotokollen. Træk ND2-filer til Fiji, og vælg Hyperstack. Klik på fanen Billede, vælg Farve, og klik på Opdel kanaler for at adskille fluorescerende kanaler i ND2-filen.Generér individuelle TIFF-filer for hver Z-udsnit af oocytterne i hver lysstofkanal. Det kan du gøre ved at klikke på fanen Billede, vælge Stakke og klikke på Stak til billeder. Klik derefter på fanen Billede, vælg Tekst, og klik på RGB-farve for at konvertere hvert Z-udsnit til et individuelt RGB-farvebillede.Gem hvert konverteret billede som en TIFF-fil. Placer billeder fra en enkelt oocyt for hver fluorescerende kanal i en ny mappe for at undgå forvirring under syninger. Når du har normaliseret filerne som beskrevet i tekstprotokollen, skal du klikke på fanen Plugins, vælge Syning og klikke på Gittersamling.Vælg Sekventielle billeder i rullemenuen, og klik på Okay. Gennemse mappen, og vælg den mappe, der indeholder alle Z-udsnitsbillederne for en enkelt oocyt på én bølgelængde. Klik på Okay.Flyt skyderen nederst i det syede billede til den relevante farvekanal for den anvendte bølgelængde. Opret det endelige RGB-syede billede ved at klikke på Billede, vælge Tekst og klikke på RGB-farve. Konverter det syede billede til et 32-bit maksimalt projiceret billede.Det gør du ved at klikke på Billede, vælge Tekst og klikke på 32-bit. Gem dette billede som en ny TIFF-fil. Åbn det 32-bit syede billede på et spotstbe- og sporingsprogram.Vælg rullemenuen Lokaliser, og klik på Lokaliser, som beregner antallet af pletter, der findes i billedet. Vist her er kvantificeringen af mRNAs ved hjælp af spotfinder og sporing. Den blå pil peger på et positivt signal over tærsklen.Den hvide pil viser et fluorescerende punkt under tærsklen og tælles derfor ikke. MRNA-tællingerne blev efterfølgende analyseret ved hjælp af et standarddataanalyseværktøj. Repræsentative billeder af billedet i den midterste Z-serie vises for Pouf51 og Nanog.DAPI farvning af kromosomer på linje med metafasen to spindel er vist med hvid. De indsamlede data i denne protokol viste 775 Pouf51 udskrifter og 113 Nanog udskrifter i metafase to oocytter. Vigtigere er det, at der ikke blev fundet pletter i oocytter, der er mærket med DapB-sonden, der fungerede som den negative kontrol.Ved brug af celler, der ikke er i klæbet, er det vigtigt empirisk at identificere den bedste fortynding af proteasebufferen fra SM-FISH-sættet. mRNA-detektion blev testet ved hjælp af en titreringskurve af ufortyndet og flere fortyndede proteasebufferkoncentrationer i 1xPBS. Proteasefortynding, der blev anvendt i denne protokol, var en til otte, da den viste den laveste variation i det gennemsnitlige fluorescerende udtryk for Pouf51 mRNA i metafase to oocytter.Samtidig immunfluorescens af et målprotein kan udføres for at sam lokalisere mRNA med et RNA-bindende protein. Sam-lokalisering af mRNA'erne med RNA-bindingsproteinerne gør det muligt for efterforskere at bestemme mekanismer, der regulerer mRNA-lagring, oversættelse og nedbrydning inden for et oocyt eller embryo.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Tilfældig mutagenese ved anvendelse histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Påvisning af Inter-kromosomale Stabil Afvigelser fra Multiple Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (MFISH) og Spectral Karyotyping (SKY) i bestrålede mus

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Dannelse af fluorescerende protein-fusioner i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Single Molecule Analyse af Laser Lokaliserede Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse af transskription faktor bindende, transskription, Translation og omsætning skal vises Global begivenheder under aktivering af cellulære

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering af mikrobiota i kryds tarme af hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...