Name: use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

Wir danken Dr. Daniel R. Larson für seine großzügige Unterstützung bei der Installation und Verwendung von Spot zu finden und Tracking-Programm 13 und die technische Unterstützung von der University of Nebraska Lincoln Mikroskopie Kern für die konfokale Mikroskopie-Bildgebung. Diese Studie ist ein Beitrag von der University of Nebraska Agricultural Research Division, Lincoln, Nebraska und wurde unterstützt von UNL Luke Mittel (NEB-26-206/Accession Number-232435 und NEB-26-231/Zbl-Nummer-1013511).

Tierische Verfahren wurden geprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der University of Nebraska-Lincoln genehmigt und alle Methoden wurden im Einklang mit geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Für diese Studie CD-1 fremd-Mäuse hatten ad libitum Zugang zu normalen Nagetier Chow und Wasser; Sie waren in einem 12:12 dunkle gepflegt: Licht-Zyklus.
1. Vorbereitung der erforderlichen Medien
<ol><li>Fügen Sie für base Medien (OMM) 100 mM NaCl, 5 mM ...

<ol>
	<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAMP-dependent+regulation+of+ovulatory+response+genes+is+amplified+by+IGF1+due+to+synergistic+effects+on+Akt+phosphorylation+and+NF-kB+transcription+factors.">CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors.</a> Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).</li><li>Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Single+Molecule+mRNA+Fluorescent+in+Situ+Hybridization+(RNA-FISH)+to+Quantify+mRNAs+in+Individual+Murine+Oocytes+and+Embryos.">Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).</li><li>Ruebel, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+modulates+inflammation+and+lipidmetabolism+oocyte+gene+expression:+A+single-cell+transcriptome+perspective.">Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).</li><li>Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).</li><li>Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNA+and+translation+in+the+mammalian+oocyte+and+embryo.">Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo.</a> PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+A+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology.">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li><li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Larson, B., Malayter, D., Shure, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Detection+of+Cytokine+Cancer+Biomarkers+using+Fluorescence+RNA+In+Situ+Hybridization+and+Cellular+Imaging.">Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging.</a> BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).</li><li>Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+&#946;-Actin+mRNA+Detection+in+Neurons+Reveals+a+Mechanism+for+Regulating+Its+Translatability.">Single &#946;-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability.</a> Science. 343 (6169), 419-422 (2014).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+obesity+alters+the+steroidogenic+response+to+ovulatory+stimulation+and+increases+the+abundance+of+mRNAs+stored+in+the+ovulated+oocyte.">Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte.</a> Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).</li><li>Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-dependent+increases+in+oocyte+mRNAs+are+associated+with+increases+in+proinflammatory+signaling+and+gut+microbial+abundance+of+lachnospiraceae+in+female+mice.">Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice.</a> Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).</li><li>Hirao, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effect+of+visible+light+on+meiosis+of+mammalian+eggs+in+vitro.">Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. , (1978).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+Approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).</li><li>Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+follicle+culture+supports+primary+follicle+growth+through+paracrine-acting+signals.">Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals.</a> Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).</li><li>Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+Regulation+of+Kinase+Signaling+Pathways+by+AREs+and+GREs.">Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs.</a> Cells. 5 (1), 4 (2016).</li><li>Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Immunoprecipitation+for+Determining+RNA-Protein+Associations+In+Vivo.">RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).</li><li>Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative,+in+situ+analysis+of+mRNAs+and+proteins+with+subcellular+resolution.">Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).</li><li>Voigt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Quantification+of+Translation-Dependent+Association+of+mRNAs+with+the+Endoplasmic+Reticulum.">Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum.</a> Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).</li><li>Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRICK:+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals.">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods in Enzymology. 572, (2016).</li><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+the+next+challenge.">Phenomics: the next challenge.</a> Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).</li><li>Freimer, N., Sabatti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Phenome+Project.">The Human Phenome Project.</a> Nature Genetics. 34, 15 (2003).</li></ol>

Eine Reihe von kleinen Schritten während des Protokolls gewährleisten die erfolgreiche Fluoreszenz und genaue Grafen von mRNAs. Erstens muss das Protokoll unmittelbar nach Sammlung und Fixierung der Eizellen erfolgen. Beachten Sie, dass die 4 % Paraformaldehyd Fixierung Puffer zu verhindern, dass Eizellen aneinander kleben PVP hinzugefügt wird. Wir fanden, dass es unmittelbar nach der Sammlung und Fixierung der die Eizellen das Experiment durchführen muss. Jede Verzögerung führt zu einer viel niedrigeren Fluoreszen...

Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde der Goldstandard für die mRNA Quantifizierung. Derzeit werden zwei Assays, digitale PCR (dPCR)1 und quantitative, real Time PCR (qPCR)2 verwendet. Die zwei PCR-Techniken hat dPCR höhere Empfindlichkeit als qPCR darauf hindeutet, dass es verwendet werden, könnte um mRNA Fülle in einzelnen Zellen zu messen. Aber in unseren Händen produziert dPCR Analyse der niedrigen Fülle mRNAs in Pools von 5 bis 10 Eizellen pro jede experimentelle Probe Daten mit geringen Reproduzierbarkeit und hohe Variation3. Dies ist wahrscheinlich auf die experimentellen Fehler in Verbindung mit RNA-Extraktion und reversen Transkription Effizienz. RNA-Sequenzierung wurde auch mit einem einzigen Mausklick und menschliche Eizellen4,5durchgeführt. Diese Technik erfordert cDNA Verstärkung für die Bibliothek-Generation, die wahrscheinlich erhöht die Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe erforderlichen Schritte. Darüber hinaus können niedrige Fülle Protokolle nicht nachweisbar sein. Obwohl Sequenzierung Preise ab den letzten Jahren gestiegen sind, kann es noch unerschwinglich wegen der hohen Kosten der Bioinformatik Analysen sein. Zu guter Letzt ist mRNA Lokalisierung ein dynamischer Prozess mit räumlichen Veränderungen zur Protein-Funktion6. Daher setzen wir um eine Technik zu verabschieden, die genaue und reproduzierbare quantitative Maßnahmen und Lokalisierung der einzelnen mRNAs in einzelne Eizellen produzieren würde.
Verzweigte DNA gekoppelt mit Fluoreszenz in Situ Hybridisierung verstärkt Fluoreszenzsignal eher als verstärkendes RNA/DNA ermöglicht Nachweis von einzelnen mRNAs in einzelnen Zellen 7,8,9. Der Test erfolgt durch eine Reihe von Hybridisierung, Amplifikation (mit verzweigten DNA) und Fluoreszenz Kennzeichnung Schritte um die Fluoreszenz-Signal7verstärken. Das Verfahren beginnt mit der Bindung von 18 - 25 Base Oligonukleotid-Sonde-Paare, die einen spezifischen mRNA3,8,10ergänzen. Fünfzehn bis zwanzig Sonde Paare eignen sich für jedes Protokoll Gewährleistung Spezifität für das Ziel-Transkript. Die mRNA-spezifische Hybridisierung folgt Vorverstärker und Endstufe Sonden, die eine verzweigte Konfiguration bilden. Ungefähr binden 400 Label Fluorophore an jeden Verstärker, was zu einem 8000-fold Anstieg in Fluoreszenz ermöglicht die Erkennung von einzelnen mRNAs (Abbildung 1)11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische des SM-Fisch Protokolls. Sequenzieller Hybridisierung von Transkript Sonde, verzweigte DNA-Verstärker und Fluorophor, ein Ziel-mRNA gezeigt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Frühere Studien mit Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SM-Fisch) lokalisiert β-Aktin mRNAs in einzelnen Neuronen12 und humanes Papillomavirus DNA bei Gebärmutterhalskrebs Zell-Linien7. Die Computersoftware, die Stelle zu finden und Tracking-Programm identifiziert einzelne punktförmige Fluoreszenzsignal und wurde erfolgreich verwendet, um die Anzahl der in jeder Zelle3,13mRNAs zu quantifizieren.
Basierend auf den Ergebnissen der mRNA-Erkennung in Neuronen12vermutet wir, dass SM-Fisch ein nützliches Instrument zur Abschrift Ebenen in murinen Eizellen und Embryonen einschließlich niedrige Fülle mRNAs quantitate beweisen würde. Aber die Technik ist optimiert für die Verwendung mit festen adhärente Zellen und Formaldehyd fixiert Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten (FFPE). Eizellen können nicht zu einer Folie haften, auch wenn sie mit Poly-L-Lysin beschichtet sind. Darüber hinaus sind sie empfindlicher als Körperzellen und Gewebeschnitte was in Zelle Lysis, wenn einige der proprietären Puffer in kommerziell erhältlichen Kits3ausgesetzt. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurden Eizellen behoben und manuell zwischen Tropfen der Puffer übertragen. Darüber hinaus wurden Permeabilisierung und waschen Puffer in den Kits ersetzt, um die lyse der Zellen zu verringern. Vordefinierte Sonden sind neben dem Fisch-Kit gekauft oder bestimmte Protokolle angefordert werden können. Jedes proprietäre Sonde-Set ist erhältlich in einer der drei Fluoreszenz-Kanäle (C1, C2 und C3) multiplexing zu ermöglichen. Im aktuellen Experiment wurden murine Eizellen Dual-gebeizt und quantifizierte mit einer Sonde C2 Nanog und C3 Pou5f1 Sonde. Diese Sonden wurden anhand der gemeldeten Ausdruck von Nanog und Pou5f1 in Eizellen und Embryonen ausgewählt. Zum Abschluss der Hybridisierung Schritte wurden Eizellen in Tropfen von Anti-Fade Montage Medien für die Anwendung auf histologischen gelegt. Konfokale Bilder wurden verwendet, um die Anzahl der punctata fluoreszierende Signale zu quantifizieren, die einzelnen mRNAs darstellen. Neben der Quantifizierung der mRNAs Bildgebung zeigte auch die räumliche Verteilung der spezifischen mRNA in der Zelle sind die RNA-Quantifizierungsmethoden nicht in der Lage, zu erreichen. Dieses Verfahren erwies sich geringe Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe erlaubt die Verwendung einer kleineren Anzahl von Eizellen in jeder experimentellen Gruppe signifikante Unterschiede zwischen experimentellen Gruppen3identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="607">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">(&#177;)-&#945;-Lipoic acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T1395</td>
			<td style="width:172px;">Alpha Lipoic Acid</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">199899</td>
			<td>FAF BSA</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD 10mL TB Syringe</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">309659</td>
			<td>10 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">305109</td>
			<td>27 1/2 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7902</td>
			<td>CaCl2-2H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Citric acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2404</td>
			<td>Citrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G6152</td>
			<td>Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Easy Grip Petri Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">351008</td>
			<td>35 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Edetate Disodium</td>
			<td style="width:91px;">Avantor</td>
			<td style="width:123px;">8994-01</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:91px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14084-08</td>
			<td>Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:91px;">Atlanta biologicals</td>
			<td style="width:123px;">S10250</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">15710-064</td>
			<td>Gentamicin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GlutaMAX-I (100X)</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">35050-061</td>
			<td>Glutamax</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gold Seal Micro Slides</td>
			<td style="width:91px;">Gold Seal</td>
			<td style="width:123px;">3039</td>
			<td>25 x 75mm slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Gonadotropin, From Pregnant Mares&#39; Serum</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G4877</td>
			<td>eCG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">hCG recombinant</td>
			<td style="width:91px;">NHPP</td>
			<td style="width:123px;">AFP8456A</td>
			<td>hCG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3884</td>
			<td>Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jewelers Style Forceps</td>
			<td style="width:91px;">Integra</td>
			<td style="width:123px;">17-305X</td>
			<td>Forceps 4-3/8&#34;, Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">L-(+)-Lactic Acid, free acid&#160;</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">190228</td>
			<td>L-Lactate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M2773</td>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:91px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">25-025-Cl</td>
			<td>NEAA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-542-C</td>
			<td>25 x 25x 0.15 mm cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501891-C2</td>
			<td>Nanog Probe</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501611-C3</td>
			<td>Pou5f1 Probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MOPS</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P6148</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PES 0.22 um Membrane -sterile</td>
			<td style="width:91px;">Millex-GP</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>0.22 um filters</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0930</td>
			<td>PVP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60128</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60218</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:91px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">P36934</td>
			<td>Antifade reagent without DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320858</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 1</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320852</td>
			<td>Amplifier 1</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 2</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320853</td>
			<td>Amplifier 2</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 3</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320854</td>
			<td>Amplifier 3</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT A</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320855</td>
			<td>Amplifier 4 ALT A</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT B</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320856</td>
			<td>Amplifier 4 ALT B</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT C</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320857</td>
			<td>Amplifier 4 ALT C</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320851</td>
			<td>FISH Reagent Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320871</td>
			<td>Negative Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Positive Control</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320881</td>
			<td>Positive Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe Diluent</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">300041</td>
			<td>Probe Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnositics</td>
			<td style="width:123px;">322337</td>
			<td>Protease III</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III &#38; IV Reagent Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322340</td>
			<td>FISH Protease Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease IV</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322336</td>
			<td>Protease IV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">S/S Needle with Luer Hub 30G</td>
			<td style="width:91px;">Component Supply Co.</td>
			<td style="width:123px;">NE-301PL-50</td>
			<td>blunt 30 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6191</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">306576</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium pyruvate, &#62;= 99%</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5280</td>
			<td>Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Solution 6 Well Dish</td>
			<td style="width:91px;">Agtechinc</td>
			<td style="width:123px;">D18</td>
			<td>6 well dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Taurine</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8691</td>
			<td>Taurine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue Culture Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">353002</td>
			<td>60 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes

Aktuelle Methoden routinemäßig verwendet, um mRNA in Eizellen und Embryonen zu quantifizieren sind digitale Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (dPCR), quantitative, Real-Time RT-PCR (RT-qPCR) und RNA Sequenzierung. Wenn diese Techniken durchgeführt werden, mit einer einzigen Eizelle oder Embryo sind niedrig-Kopie mRNAs nicht zuverlässig erkannt. Um dieses Problem zu überwinden, können Eizellen oder Embryonen für die Analyse zusammengefasst werden; Allerdings führt dies oft zu hohe Variabilität unter den Proben. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung der Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) mit verzweigten DNA-Chemie. Diese Technik identifiziert das räumliche Muster der mRNAs in einzelnen Zellen. Wenn die Technik mit dem Ort zu finden und Tracking-Computer-Software gekoppelt ist, kann die Fülle der mRNAs in der Zelle auch quantifiziert werden. Mit dieser Technik gibt es geringere Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe und weniger Eizellen und Embryonen sind erforderlich, um signifikante Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen erkennen. Handelsübliche verzweigte DNA SM-Fisch-Kits zur Erkennung von mRNAs in geschnittenen Gewebe oder adhärente Zellen auf Folien optimiert worden. Jedoch Eizellen haften nicht effektiv auf Folien und einige Reagenzien im Kit waren zu hart, was zu Eizelle Lyse. Um diese Zerstörung zu verhindern, wurden einige Modifikationen an das Fisch-Kit vorgenommen. Insbesondere ersetzt Eizelle Permeabilisierung und waschen Puffer für die Immunfluoreszenz von Eizellen und Embryonen entwickelt die proprietäre Puffer. Die Permeabilisierung, Waschungen und Inkubationen mit Sonden und Verstärker wurden in 6-Well Platten durchgeführt und Eizellen wurden auf Folien am Ende des Protokolls mit Montage Media platziert. Diese Änderungen konnten die Einschränkungen des kommerziell erhältlichen Kit, insbesondere die Eizelle Lyse zu überwinden. Um präzise und reproduzierbar mRNAs in einzelnen Eizellen zählen, wurde Computer-Software verwendet. Dieses Protokoll ist zusammen, eine Alternative zur PCR und Sequenzierung den Ausdruck der spezifischen Transkripte in Einzelzellen zu vergleichen.

Nach dem Abschluss des Protokolls, das Ergebnis wird Einzelbilder aus der konfokalen Z-Serie (Abbildung 4A und Abbildung 5), Zusammengeheftete Bilder (Abbildung 4), und mRNA zählt (Abbildung 4 b). Beim Multiplexen durchgeführt wird, wird auch sein zusammengeführten Bilder zeigen die Bezeichnung für zwei verschiedene ...

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Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Diese Technik ermöglicht nicht nur die Lokalisierung, sondern auch die Quantifizierung von Kandidaten-mRNAs in den einzelnen Eizellen und Embryonen. Im Vergleich zu anderen Assays, einschließlich PCR, führt die Vervollständigung der Technik zu reproduzierbaren Daten mit geringer Variation. Demonstriert wird das Verfahren von Kelsey Timme, einem Doktoranden in meinem Labor.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung des benötigten Materials und weiblicher Mäuse im Alter von fünf bis acht Wochen, wie im Textprotokoll beschrieben. Reinigen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Setzen Sie die Bauchhöhle aus und visualisieren Sie den weiblichen Fortpflanzungstrakt.Halten Sie den Eierstock mit Zangen und entfernen Sie die Gebärmutterbänder und überschüssiges Fettgewebe aus der Umgebung des Eierstocks. Schneiden Sie das Eileiteraus der Gebärmutter. Dann legen Sie das Ovarialoviktspaar in einem warmen Haltemedium in eine 35-Millimeter-Schale.Entfernen Sie den Eierstock und alle umgebenden Fettgewebe. Reißen Sie die geschwollenen Ampullen des Eileiters mit einer halben Zoll 27 Gauge Nadel. Drücken Sie das Eileiter an der Stelle der Tränen- und Cumuluszell-Oozytenkomplexe werden vertrieben.Mit einer Mundpipette, um die eigeovten Eizellen auf den 100-Mikroliter-Tropfen zu übertragen, der das Haltemedium mit Hyaluronidase enthält. Um Cumuluszellen zu vertreiben, pipette die Metaphase zwei Oozyten-Cumulus-Zell-Komplexe nach oben und unten in der Hyaluronidase enthaltendes Haltemittel mit der Mundpipette. Sobald sie frei von Cumuluszellen sind, verwenden Sie die Mundpipette, um jede Eizelle auf einen Waschtropfen zu übertragen, der nur haltemittel enthält.Wiederholen Sie dies für jedes Waschtropfen. Übertragen Sie keine fragmentierten oder transparenten Eizellen. Um SM-FISH Färbung durchzuführen, fixieren Sie zuerst Eizellen in einem einzelnen Brunnen einer sechs Brunnenplatte, die 500 Mikroliter Fixationspuffer enthält.Tauchen Sie 20 Eizellen oder weniger in den Brunnen. Inkubieren Sie die Eizellen im Fixationspuffer 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Eizellen, wie im Textprotokoll beschrieben, inkubieren Eizellen in Permeablization Puffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Nach einer weiteren Wäsche die Eizellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf 80 Mikroliter vorverdünnter Protease-Dreipuffer übertragen. Verdünnen Sie die erwärmten Sondensätze für Nanog, Pou5f1 und DapB einbis 50 in Sondenverdünnungsstoff. Oozyten in 80 Mikroliter der Transkript-spezifischen Sonde für zwei Stunden bei 40 Grad Celsius inkubieren.Wenn sich Eizellen in der Sonde und den AMP-Puffern befinden, neigen sie dazu, zu schweben. Es ist wichtig, dass Sie die Eizellen untertauchen, indem Sie sie sanft in den Puffer schieben. Die Eizellen auf 500 Mikroliter Waschpuffer übertragen und 10 Minuten bei Raumtemperatur brüten.Inkubieren Sie nun Oozyten sequenziell in Amplifikationspuffern. Zuerst inkubieren Eizellen in 80 Mikroliter VON AMP1 für 30 Minuten bei 40 Grad Celsius. Dann die Eizellen auf 500 Mikroliter Waschpuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur übertragen.Als nächstes inkubieren Eizellen in 80 Mikroliter VON AMP2 für 15 Minuten bei 40 Grad Celsius. Nach dem Waschen der Eizellen wie zuvor, inkubieren Sie die Eizellen in 80 Mikroliter VON AMP3 für 30 Minuten bei 40 Grad Celsius, gefolgt von einer letzten Wäsche. Zum Schluss oozyten zu 80 Mikroliter n. AMP4FL für 15 Minuten bei 40 Grad Celsius hinzufügen.Pipette 12 Mikroliter Anti-Fade-Montagemedium auf die Mitte eines Dias ohne Zugabe von Blasen zum Reagenz. Eizellen mit möglichst wenig Waschpuffer in das Montagemedium übertragen. Wenden Sie schließlich einen Deckbedeckungszettel an.Stellen Sie die dreidimensionalen Eizellen mit der Konfokalmikroskopie des Z-Schritts ab und speichern Sie die Bilder, wie im Textprotokoll beschrieben. Ziehen Sie ND2-Dateien nach Fidschi und wählen Sie Hyperstack. Klicken Sie auf die Registerkarte Bild, wählen Sie Farbe aus, und klicken Sie auf Kanäle teilen, um die fluoreszierenden Kanäle der ND2-Datei zu trennen.Generieren Sie einzelne TIFF-Dateien für jedes Z-Slice der Eizellen in jedem Fluoreszenzkanal. Klicken Sie dazu auf die Registerkarte Bild, wählen Sie Stapel aus, und klicken Sie auf Stapel na Bild. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Bild, wählen Sie Typ aus, und klicken Sie auf RGB-Farbe, um jedes Z-Slice in ein einzelnes RGB-Farbbild zu konvertieren.Speichern Sie jedes konvertierte Bild als TIFF-Datei. Platzieren Sie Bilder aus einer einzelnen Oozyte für jeden fluoreszierenden Kanal in einem neuen Ordner, um Verwirrung beim Nähen zu vermeiden. Nachdem Sie die Dateien wie im Textprotokoll beschrieben normalisiert haben, klicken Sie auf die Registerkarte Plugins, wählen Stitching aus, und klicken Sie auf Grid Collection.Wählen Sie Sequenzielle Bilder aus dem Dropdown-Menü und klicken Sie auf Okay. Durchsuchen Sie das Verzeichnis, und wählen Sie den Ordner aus, der alle Z-Slice-Bilder für eine einzelne Oozyte bei einer Wellenlänge enthält. Klicken Sie auf Okay.Verschieben Sie den Schieberegler am unteren Rand des genähten Bildes auf den entsprechenden Farbkanal für die verwendete Wellenlänge. Erstellen Sie das endgültige RGB-genähte Bild, indem Sie auf Bild klicken, Typ auswählen und auf RGB-Farbe klicken. Konvertieren Sie das genähte Bild in ein maximal 32-Bit-Bild.Klicken Sie dazu auf Bild, wählen Sie Typ aus, und klicken Sie auf 32-Bit. Speichern Sie dieses Bild als neue TIFF-Datei. Öffnen Sie das 32-Bit-Stitch-Bild in einem Spot-Find- und Tracking-Programm.Wählen Sie die Dropdown-Liste Lokalisieren aus, und klicken Sie auf Lokalisieren, wodurch die Anzahl der im Bild gefundenen Punkte berechnet wird. Hier ist die Quantifizierung von mRNAs mit dem Spotfinder und Tracking zu sehen. Der blaue Pfeil zeigt auf ein positives Signal oberhalb der Schwelle.Der weiße Pfeil zeigt einen fluoreszierenden Punkt unterhalb der Schwelle und wird daher nicht gezählt. Die mRNA-Zählungen wurden anschließend mit einem Standard-Datenanalyse-Tool analysiert. Repräsentative Bilder des Bildes der mittleren Z-Serie werden für Pouf51 und Nanog gezeigt.Die DAPI-Färbung von Chromosomen, die auf der Metaphase zwei Spindel ausgerichtet sind, ist weiß dargestellt. Die in diesem Protokoll gesammelten Daten zeigten 775 Pouf51-Transkripte und 113 Nanog-Transkripte in Metaphase zwei Oozyten. Wichtig ist, dass in Eizellen, die mit der DapB-Sonde beschriftet sind, keine Flecken entdeckt wurden, die als Negativkontrolle dienten.Bei der Verwendung nicht-anhaftender Zellen ist es wichtig, empirisch die beste Verdünnung des Proteasepuffers aus dem SM-FISH-Kit zu identifizieren. Der mRNA-Nachweis wurde mit einer Titrationskurve von unverdünnten und mehreren verdünnten Proteasepufferkonzentrationen in 1xPBS getestet. Die in diesem Protokoll verwendete Protease-Verdünnung war eins bis acht, da sie die geringste Variation in der durchschnittlichen fluoreszierenden Expression von Pouf51 mRNA in Metaphase zwei Oozyten zeigte.Die gleichzeitige Immunfluoreszenz eines Zielproteins kann durchgeführt werden, um die mRNA mit einem RNA-bindenden Protein zu lokalisieren. Die Kolokalisierung der mRNAs mit den RNA-bindenden Proteinen ermöglicht es den Forschern, Mechanismen zu bestimmen, die die speicherung, Translation und Degradation von mRNA innerhalb einer Oozyte oder eines Embryos regulieren.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Die Erzeugung von Fluorescent Protein Fusions in<em&gt; Candida</em&gt; Arten

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...