Name: use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

Vi takker Dr. Daniel R. Larson for hans sjenerøs hjelp med installasjon og bruk av sted å finne og sporing Program 13 og teknisk støtte fra University of Nebraska Lincoln mikroskopi kjernen for AC confocal mikroskopi avbilding. Denne studien representerer et bidrag på University of Nebraska Agricultural Research Division, Lincoln, Nebraska og ble støttet av UNL Luke midler (NB-26-206/tiltredelse-232435 og NB-26-231/tiltredelse-1013511).

Animal prosedyrer blir gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på University of Nebraska-Lincoln og alle metodene ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og regler. For denne studien, CD-1 outbred musene hadde ad lib tilgang til normal gnager chow og vann. de ble opprettholdt i en 12:12 mørke: lyset syklus.
1. utarbeidelse av nødvendige medier
<ol><li>For basen medier (OMM), kan du legge 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4...

<ol>
	<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAMP-dependent+regulation+of+ovulatory+response+genes+is+amplified+by+IGF1+due+to+synergistic+effects+on+Akt+phosphorylation+and+NF-kB+transcription+factors.">CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors.</a> Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).</li><li>Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Single+Molecule+mRNA+Fluorescent+in+Situ+Hybridization+(RNA-FISH)+to+Quantify+mRNAs+in+Individual+Murine+Oocytes+and+Embryos.">Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).</li><li>Ruebel, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+modulates+inflammation+and+lipidmetabolism+oocyte+gene+expression:+A+single-cell+transcriptome+perspective.">Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).</li><li>Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).</li><li>Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNA+and+translation+in+the+mammalian+oocyte+and+embryo.">Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo.</a> PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+A+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology.">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li><li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Larson, B., Malayter, D., Shure, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Detection+of+Cytokine+Cancer+Biomarkers+using+Fluorescence+RNA+In+Situ+Hybridization+and+Cellular+Imaging.">Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging.</a> BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).</li><li>Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+&#946;-Actin+mRNA+Detection+in+Neurons+Reveals+a+Mechanism+for+Regulating+Its+Translatability.">Single &#946;-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability.</a> Science. 343 (6169), 419-422 (2014).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+better+mouse+embryo+assay:+effects+of+mouse+strain+and+in+vitro+maturation+on+sensitivity+to+contaminants+of+the+culture+environment.">Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).</li><li>Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+obesity+alters+the+steroidogenic+response+to+ovulatory+stimulation+and+increases+the+abundance+of+mRNAs+stored+in+the+ovulated+oocyte.">Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte.</a> Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).</li><li>Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-dependent+increases+in+oocyte+mRNAs+are+associated+with+increases+in+proinflammatory+signaling+and+gut+microbial+abundance+of+lachnospiraceae+in+female+mice.">Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice.</a> Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).</li><li>Hirao, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effect+of+visible+light+on+meiosis+of+mammalian+eggs+in+vitro.">Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. , (1978).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+Approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).</li><li>Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+follicle+culture+supports+primary+follicle+growth+through+paracrine-acting+signals.">Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals.</a> Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).</li><li>Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+Regulation+of+Kinase+Signaling+Pathways+by+AREs+and+GREs.">Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs.</a> Cells. 5 (1), 4 (2016).</li><li>Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Immunoprecipitation+for+Determining+RNA-Protein+Associations+In+Vivo.">RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).</li><li>Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative,+in+situ+analysis+of+mRNAs+and+proteins+with+subcellular+resolution.">Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).</li><li>Voigt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Quantification+of+Translation-Dependent+Association+of+mRNAs+with+the+Endoplasmic+Reticulum.">Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum.</a> Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).</li><li>Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRICK:+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals.">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods in Enzymology. 572, (2016).</li><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+the+next+challenge.">Phenomics: the next challenge.</a> Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).</li><li>Freimer, N., Sabatti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Phenome+Project.">The Human Phenome Project.</a> Nature Genetics. 34, 15 (2003).</li></ol>

En rekke mindre trinn under protokollen sikrer vellykket fluorescens og nøyaktig antall mRNAs. Protokollen må først utføres umiddelbart etter innsamling og fiksering av oocytes. Merk at PVP legges til 4% paraformaldehyde fiksering bufferen slik at oocytes henger sammen. Vi fant at det er nødvendig å utføre eksperimentet umiddelbart etter innsamling og fiksering av oocytes. Forsinkelser resulterer i en mye lavere fluorescens signal som vil føre til undercounting av transkripsjoner. Dette skyldes delvis RNA degrade...

Revers transkriptase polymerasekjedereaksjons (PCR) har vært gullstandarden for mRNA kvantifisering. To analyser, digital PCR (dPCR)1 og kvantitativ, virkelig tid PCR (qPCR)2 brukes for øyeblikket. Av de to PCR teknikkene har dPCR større følsomhet enn qPCR antyder at det kan brukes til å måle mRNA overflod i enkeltceller. Men i våre hender, har dPCR analyse av lav overflod mRNAs i av 5 til 10 oocytes per hvert eksperimentelle utvalg produsert data med lav reproduserbarhet og høy variant3. Dette er sannsynligvis på grunn av eksperimentelle feil forbundet med RNA utvinning og omvendt transkripsjon effektivitet. RNA sekvensering er også utført med et enkelt museklikk og menneskelig oocytes4,5. Denne teknikken krever cDNA forsterkning fremgangsmåtene for biblioteket generasjon som sikkert øker variasjonen i en forsøksgruppen. Videre kan lav overflod utskrifter ikke være synlig. Selv om sekvensering prisene har gått ned de siste årene, kan det likevel være kostnadseffektivt uoverkommelige på grunn av de høye kostnadene av bioinformatikk analyser. Endelig er mRNA lokalisering en dynamisk prosess med romlig endringer bidra til protein funksjon6. Derfor setter vi opp for vedta en teknikk som vil produsere nøyaktig og reproduserbar kvantitative tiltak og lokalisering av personlige mRNAs i én oocytes.
Forgrenede DNA koblet til fluorescens i situ hybridisering forsterker fluorescens signal i stedet for å forsterke RNA/cDNA aktivere gjenkjenning av ett mRNAs i enkeltceller 7,8,9. Analysen utføres gjennom en rekke hybridisering, forsterkning (med forgrenet DNA) og fluorescens merking skritt for å forsterke fluorescens signal7. Teknikken begynner med binding av 18 - til 25-base oligonucleotide sonde par som er komplementære til en bestemt mRNA3,8,10. Femten til tjue sonde parene er designet for hver utskrift sikre spesifisitet for målet transkripsjon. MRNA-spesifikke hybridization etterfølges av pre forsterker og forsterker sonder som danner en forgrenet konfigurasjon. Ca, 400 etiketten fluorophores binder seg til hver forsterker, resulterer i en 8000-fold økning i fluorescens tillater påvisning av individuelle mRNAs (figur 1)11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk av SM-fisk protokollen. Sekvensiell blanding av transkripsjon bestemt sonde, forgrenet DNA forsterker og fluorophore til et mål mRNA vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Tidligere studier med ett molekyl fluorescens i situ hybridisering (SM-fisk) lokalisert β-utgangen mRNAs i individuelle neurons12 og humant papillomavirus DNA i livmorhalskreft celle linjer7. Dataprogramvaren sted å finne og sporing programmet identifiserer individuelle vises punctate fluorescerende signal og har blitt brukt å tallfeste antallet mRNAs i hver celle3,13.
Basert på resultatene av mRNA gjenkjenning i neurons12, hypotese vi at SM-fisk ville bevise en nyttig verktøyet å quantitate transkripsjon nivåer i murine oocytes og embryo inkludert lav overflod mRNAs. Men teknikken er optimalisert for bruk med tilhenger fast celler og formaldehyd fast parafin innebygd (FFPE) vev deler. Oocytes kan ikke følge et lysbilde, selv når de er belagt med Poly-L-lysine. Videre, de er mer sårbar enn somatiske celler og vev inndelinger som resulterer i cellen lysis når utsatt for noen av proprietære bufferne i kommersielt tilgjengelig kits3. For å overvinne disse utfordringene, oocytes fast og manuelt overføres mellom dråper bufferne. Videre erstattet permeabilization og vask buffere i settene for å redusere celle lysis. Forhåndsutformede sonder kjøpes sammen med fisk kit eller bestemte utskrifter kan forespørres. Hver proprietære sonde er tilgjengelig i en av tre fluorescens kanaler (C1, C2 og C3) for å tillate multipleksing. I gjeldende eksperimentet var murine oocytes dual-farget og kvantifisert ved hjelp av en C2 Nanog sonde og en C3 Pou5f1 sonde. Disse sonder ble valgt basert på rapporterte uttrykk for Nanog og Pou5f1 i oocytes og embryo. Ved avslutningen av hybridisering trinnene plassert oocytes i dråper av anti-fade monterer medier skal histologiske lysbilder. AC confocal bilder ble brukt om å kvantifisere antall vises punctate fluorescerende signaler som representerer personlige mRNAs. Kvantifisere mRNAs, bildebehandling viste også den romlige fordelingen av den spesifikke mRNA i cellen, er hvilke andre RNA kvantifisering metoder ikke å oppnå. Denne teknikken vist seg for å ha lav variasjon innen en forsøksgruppen tillater bruk av mindre antall oocytes i hver forsøksgruppen å identifisere betydelige forskjeller mellom eksperimentelle grupper3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="607">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">(&#177;)-&#945;-Lipoic acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T1395</td>
			<td style="width:172px;">Alpha Lipoic Acid</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">199899</td>
			<td>FAF BSA</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD 10mL TB Syringe</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">309659</td>
			<td>10 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">305109</td>
			<td>27 1/2 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7902</td>
			<td>CaCl2-2H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Citric acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2404</td>
			<td>Citrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G6152</td>
			<td>Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Easy Grip Petri Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">351008</td>
			<td>35 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Edetate Disodium</td>
			<td style="width:91px;">Avantor</td>
			<td style="width:123px;">8994-01</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:91px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14084-08</td>
			<td>Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:91px;">Atlanta biologicals</td>
			<td style="width:123px;">S10250</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">15710-064</td>
			<td>Gentamicin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GlutaMAX-I (100X)</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">35050-061</td>
			<td>Glutamax</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gold Seal Micro Slides</td>
			<td style="width:91px;">Gold Seal</td>
			<td style="width:123px;">3039</td>
			<td>25 x 75mm slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Gonadotropin, From Pregnant Mares&#39; Serum</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G4877</td>
			<td>eCG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">hCG recombinant</td>
			<td style="width:91px;">NHPP</td>
			<td style="width:123px;">AFP8456A</td>
			<td>hCG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3884</td>
			<td>Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jewelers Style Forceps</td>
			<td style="width:91px;">Integra</td>
			<td style="width:123px;">17-305X</td>
			<td>Forceps 4-3/8&#34;, Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">L-(+)-Lactic Acid, free acid&#160;</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">190228</td>
			<td>L-Lactate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M2773</td>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:91px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">25-025-Cl</td>
			<td>NEAA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-542-C</td>
			<td>25 x 25x 0.15 mm cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501891-C2</td>
			<td>Nanog Probe</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501611-C3</td>
			<td>Pou5f1 Probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MOPS</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P6148</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PES 0.22 um Membrane -sterile</td>
			<td style="width:91px;">Millex-GP</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>0.22 um filters</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0930</td>
			<td>PVP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60128</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60218</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:91px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">P36934</td>
			<td>Antifade reagent without DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320858</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 1</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320852</td>
			<td>Amplifier 1</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 2</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320853</td>
			<td>Amplifier 2</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 3</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320854</td>
			<td>Amplifier 3</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT A</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320855</td>
			<td>Amplifier 4 ALT A</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT B</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320856</td>
			<td>Amplifier 4 ALT B</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT C</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320857</td>
			<td>Amplifier 4 ALT C</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320851</td>
			<td>FISH Reagent Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320871</td>
			<td>Negative Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Positive Control</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320881</td>
			<td>Positive Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe Diluent</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">300041</td>
			<td>Probe Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnositics</td>
			<td style="width:123px;">322337</td>
			<td>Protease III</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III &#38; IV Reagent Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322340</td>
			<td>FISH Protease Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease IV</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322336</td>
			<td>Protease IV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">S/S Needle with Luer Hub 30G</td>
			<td style="width:91px;">Component Supply Co.</td>
			<td style="width:123px;">NE-301PL-50</td>
			<td>blunt 30 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6191</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">306576</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium pyruvate, &#62;= 99%</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5280</td>
			<td>Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Solution 6 Well Dish</td>
			<td style="width:91px;">Agtechinc</td>
			<td style="width:123px;">D18</td>
			<td>6 well dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Taurine</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8691</td>
			<td>Taurine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue Culture Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">353002</td>
			<td>60 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes

Gjeldende metoder rutinemessig brukes å kvantifisere mRNA i oocytes og embryo inkluderer digitale omvendt-transkripsjon polymerasekjedereaksjons (dPCR), kvantitativ, real-time RT-PCR (RT-qPCR) og RNA sekvensering. Når disse teknikkene utføres ved hjelp av en enkelt oocytter og embryo, gjenkjennes lav-kopi mRNAs pålitelig ikke. Du løser dette problemet, kan oocytes eller embryo samordnes sammen for analyse; men fører dette ofte til høy variasjon blant prøver. I denne protokollen beskriver vi bruk av fluorescens i situ hybridisering (fisk) bruker forgrenet DNA kjemi. Denne teknikken identifiserer romlige mønster av mRNAs i enkeltceller. Når teknikken er kombinert med sted å finne og sporingsprogramvare, kan også overflod av mRNAs i cellen kvantifiseres. Bruker denne teknikken, det er redusert variasjon innen en forsøksgruppen og færre oocytes og embryo kreves for å gjenkjenne betydelige forskjeller mellom eksperimentelle grupper. Kommersielt tilgjengelige forgrenet-DNA SM-fisk kits er optimalisert for å oppdage mRNAs i valgte vev eller tilhenger celler i lysbilder. Men oocytes effektivt overholder ikke lysbilder og noen reagenser i kit var for harde resulterer i oocyte lysis. For å forhindre denne lyse, ble flere endringer gjort fisk Kit. Spesielt erstattet oocyte permeabilization og vask buffere designet for immunofluorescence av oocytes og embryo de proprietære bufferne. Den permeabilization, vasker og incubations med sonder og forsterker ble utført i 6-vel plater og oocytes ble plassert på lysbilder på slutten av protokollen bruker monterer medier. Disse endringene kunne overvinne begrensningene til kommersielt tilgjengelige settet, spesielt oocyte lysis. For å nøyaktig og reproduserbar telle antall mRNAs i individuelle oocytes, ble programvare brukt. Sammen, representerer denne protokollen et alternativ til PCR og sekvensering sammenligne uttrykk for bestemte utskrifter i enkeltceller.

Ved ferdigstillelse av protokollen, vil resultatet være enkeltbilder fra AC confocal z-serien (figur 4A og figur 5), sydd bilder (figur 4C), og mRNA teller (figur 4B). Når multipleksing er utført, vil det også være sammenslåtte bilder viser etiketten for to ulike mRNAs (figur 5...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Du reproduserbar teller antallet mRNAs i individuelle oocytes, ett molekyl RNA fluorescens i situ var hybridisering (RNA-fisk) optimalisert for ikke-tilhenger celler. Oocytes var samlet, hybridiserte med transkripsjon bestemt sonder og kvantifisert bruker en kvantifisering programvare.

Bruk av ett molekyl fluorescerende i Situ hybridisering (SM-fisk) å kvantifisere og Localize mRNAs i Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Denne teknikken tillater ikke bare lokalisering, men også kvantitet av kandidat mRNAs i de enkelte oocytes og embryoer. Sammenlignet med andre analyser, inkludert PCR, resulterer fullføring av teknikken i reproduserbare data med lav variasjon. Å demonstrere prosedyren vil være Kelsey Timme, en utdannet student i laboratoriet mitt.Begynn denne prosedyren med utarbeidelsen av det nødvendige materialet og hunnmusene ved fem til åtte ukers alder som beskrevet i tekstprotokollen. Rengjør musen ved hjelp av 70% etanol. Eksponer bukhulen og visualiser den kvinnelige reproduktive kanalen.Hold eggstokken med tang og fjern livmorleddbåndene og overflødig fettvev fra rundt eggstokken. Klipp ovidukten fra livmoren. Deretter plasserer eggstokkoviductparet i varmt holdemedium i en 35 millimeter tallerken.Fjern eggstokken og eventuelle omkringliggende fettvev. Riv den hovne ampullae av oviduct med en halv tomme 27 gauge nål. Skyv oviducten på stedet av tåre og cumulus celle oocyte komplekser vil bli utvist.Bruk en munnpipette til å overføre eggløsningsoocytter til 100 mikroliterdråpen som inneholder holdingmed hyaluronidase. For å løsne cumulus celler, pipette metaphase to oocyte cumulus cellekomplekser opp og ned i hyaluronidase som inneholder holding medium med munnpipetten. Når de er blottet for cumulus celler, bruk munnpipetten til å overføre hver oocyte til en vaskedråpe som bare inneholder holdemedium.Gjenta dette for hver vaskedråpe. Ikke overfør fragmenterte eller gjennomsiktige oocytter. For å utføre SM-FISH-farging, må du først fikse oocytter i en individuell brønn på en seksbrønnplate som inneholder 500 mikroliter fikseringsbuffer.Senk 20 oocytes eller mindre i brønnen. Inkuber oocytter i fikseringsbuffer i 20 minutter ved romtemperatur. Etter å ha vasket oocytes som beskrevet i tekstprotokollen, inkuber oocytes i permeabliseringsbuffer i 30 minutter ved romtemperatur.Etter en annen vask, overfør oocytter til 80 mikroliter med pre-fortynnet protease tre buffer i 30 minutter ved romtemperatur. Fortynn de oppvarmede probesettene for Nanog, Pou5f1 og DapB en til 50 i sondefortynningsmiddel. Inkuber oocytter i 80 mikroliter av transkripsjonsspesifikk sonde i to timer ved 40 grader Celsius.Når oocytes er i sonden og AMP-bufferne, har de en tendens til å flyte. Det er viktig at du senker oocytes ved å forsiktig skyve dem inn i bufferen. Overfør oocytter til 500 mikroliter vaskebuffer og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.Nå inkuber oocytes sekvensielt i forsterkningsbuffere. Først inkubere oocytter i 80 mikroliter av AMP1 i 30 minutter ved 40 grader Celsius. Deretter overfører oocytes til 500 mikroliter vaskebuffer i 10 minutter ved romtemperatur.Deretter inkubere oocytter i 80 mikroliter amp2 i 15 minutter ved 40 grader Celsius. Etter å ha vasket oocytes som før, inkuber oocytes i 80 mikroliter av AMP3 i 30 minutter ved 40 grader Celsius etterfulgt av en endelig vask. Til slutt legger du til oocytter til 80 mikroliter amp4fl i 15 minutter ved 40 grader Celsius.Pipette 12 mikroliter anti-fade montering medium på midten av et lysbilde uten å legge bobler til reagensen. Overfør oocytter med så lite vaskebuffer som mulig inn i monteringsmediet. Til slutt, påfør en dekselseddel.Bilde de tredimensjonale oocytes ved hjelp av Z-trinns konfokal mikroskopi og lagre bildene som beskrevet i tekstprotokollen. Dra ND2 filer til Fiji og velg Hyperstack. Klikk kategorien Bilde, velg Farge, og klikk Del kanaler for å skille de fluorescerende kanalene i ND2-filen.Generer individuelle TIFF-filer for hver Z-bit av oocytes i hver fluorescerende kanal. Dette gjør du ved å klikke kategorien Bilde, velge Stabler og klikke Stable til bilder. Deretter klikker du kategorien Bilde, velger Tekst og klikker RGB-farge for å konvertere hvert Z-stykke til et individuelt RGB-fargebilde.Lagre hvert konverterte bilde som en TIFF-fil. Plasser bilder fra en enkelt oocyte for hver fluorescerende kanal i en ny mappe for å unngå forvirring under søm. Når du har normalisert filene som beskrevet i tekstprotokollen, klikker du kategorien Plugins, velger Søm og klikker på Rutenettsamling.Velg Sekvensielle bilder fra rullegardinmenyen og klikk på Ok. Bla gjennom katalogen og velg mappen som inneholder alle Z-stykkebildene for en individuell oocyte ved en bølgelengde. Klikk ok.Flytt glidebryteren nederst på det sydde bildet til riktig fargekanal for bølgelengden som brukes. Opprett det endelige RGB-bildet ved å klikke Bilde, velge Type og klikke RGB-farge. Konverter det sydde bildet til et 32-biters maksimalt projisert bilde.Dette gjør du ved å klikke Bilde, velge Type og klikke 32-biters. Lagre dette bildet som en ny TIFF-fil. Åpne det 32-biters sydde bildet på et stedsfunn- og sporingsprogram.Velg rullegardinlisten Lokaliser, og klikk Lokaliser, som beregner antall flekker som finnes i bildet. Vist her er kvantifiseringen av mRNAs ved hjelp av spot finder og sporing. Den blå pilen peker på et positivt signal over terskelen.Den hvite pilen viser et fluorescerende punkt under terskelen og teller derfor ikke. MRNA-tellingene ble senere analysert ved hjelp av et standard dataanalyseverktøy. Representative bilder av det midterste Z-seriebildet vises for Pouf51 og Nanog.DAPI farging av kromosomer justert på metafase to spindel er vist i hvitt. Dataene som ble samlet inn i denne protokollen viste 775 Pouf51 transkripsjoner og 113 Nanog transkripsjoner i metaphase to oocytes. Viktigere, det var ingen flekker oppdaget i oocytes som er merket med DapB sonde, som fungerte som den negative kontrollen.Når du bruker ikke-tilhengerceller, er det viktig å empirisk identifisere den beste fortynningen av proteasebufferen fra SM-FISH-settet. mRNA-deteksjon ble testet ved hjelp av en titreringskurve av ufortynnede og flere fortynnede proteasebufferkonsentrasjoner i 1xPBS. Protease fortynning brukt i denne protokollen var en til åtte som det viste den laveste variasjonen i den gjennomsnittlige fluorescerende uttrykk for Pouf51 mRNA i metaphase to oocytes.Samtidig immunfluorescens av et målprotein kan utføres for å samtidig lokalisere mRNA med et RNA-bindende protein. Samtidig lokalisering av mRNAs med RNA bindende proteiner gjør det mulig for forskere å bestemme mekanismer som regulerer mRNA lagring, oversettelse og nedbrytning i en oocyte eller embryo.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenese Bruke Histone-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Påvisning av Inter-kromosom Stabil Avvik ved Multiple fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) og Spectral karyotypering (SKY) i Bestrålet Mus

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generering av Fluorescent Protein Fusions i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Enkelt Molecule Analyse av Laser Lokalisert psoralen addukter

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick Guts av hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Ett molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyse i spirende gjær vegetativ vekst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...