Name: use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

Vi tackar Dr. Daniel R. Larson för hans generösa hjälp med installation och användning av plats att hitta och spåra Program 13 och tekniskt stöd från University of Nebraska Lincoln mikroskopi kärnan för konfokalmikroskopi bildtagning. Denna studie utgör ett bidrag av universitetar av Nebraska jordbruks forskningsavdelning, Lincoln, Nebraska och stöddes av UNL Hatch medel (NEB-26-206/anslutningen nummer-232435 och NEB-26-231/anslutningen nummer-1013511).

Djur förfaranden var granskad och godkänd av institutionella djur vård och användning kommittén vid University of Nebraska-Lincoln och alla metoder utfördes i enlighet med tillämpliga riktlinjer och förordningar. För denna studie, CD-1 utkonkurrerat dö ut möss hade ad libitum tillgång till normala gnagare chow och vatten; de bibehölls i en 12:12 mörka: ljus cykel.
1. beredning av krävs media
<ol><li>För base media (OMM), lägga till 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2</sub...

<ol>
	<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAMP-dependent+regulation+of+ovulatory+response+genes+is+amplified+by+IGF1+due+to+synergistic+effects+on+Akt+phosphorylation+and+NF-kB+transcription+factors.">CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors.</a> Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).</li><li>Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Single+Molecule+mRNA+Fluorescent+in+Situ+Hybridization+(RNA-FISH)+to+Quantify+mRNAs+in+Individual+Murine+Oocytes+and+Embryos.">Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).</li><li>Ruebel, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+modulates+inflammation+and+lipidmetabolism+oocyte+gene+expression:+A+single-cell+transcriptome+perspective.">Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).</li><li>Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).</li><li>Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNA+and+translation+in+the+mammalian+oocyte+and+embryo.">Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo.</a> PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+A+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology.">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li><li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Larson, B., Malayter, D., Shure, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Detection+of+Cytokine+Cancer+Biomarkers+using+Fluorescence+RNA+In+Situ+Hybridization+and+Cellular+Imaging.">Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging.</a> BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).</li><li>Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+&#946;-Actin+mRNA+Detection+in+Neurons+Reveals+a+Mechanism+for+Regulating+Its+Translatability.">Single &#946;-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability.</a> Science. 343 (6169), 419-422 (2014).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+better+mouse+embryo+assay:+effects+of+mouse+strain+and+in+vitro+maturation+on+sensitivity+to+contaminants+of+the+culture+environment.">Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).</li><li>Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+obesity+alters+the+steroidogenic+response+to+ovulatory+stimulation+and+increases+the+abundance+of+mRNAs+stored+in+the+ovulated+oocyte.">Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte.</a> Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).</li><li>Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-dependent+increases+in+oocyte+mRNAs+are+associated+with+increases+in+proinflammatory+signaling+and+gut+microbial+abundance+of+lachnospiraceae+in+female+mice.">Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice.</a> Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).</li><li>Hirao, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effect+of+visible+light+on+meiosis+of+mammalian+eggs+in+vitro.">Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. , (1978).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+Approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).</li><li>Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+follicle+culture+supports+primary+follicle+growth+through+paracrine-acting+signals.">Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals.</a> Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).</li><li>Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+Regulation+of+Kinase+Signaling+Pathways+by+AREs+and+GREs.">Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs.</a> Cells. 5 (1), 4 (2016).</li><li>Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Immunoprecipitation+for+Determining+RNA-Protein+Associations+In+Vivo.">RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).</li><li>Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative,+in+situ+analysis+of+mRNAs+and+proteins+with+subcellular+resolution.">Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).</li><li>Voigt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Quantification+of+Translation-Dependent+Association+of+mRNAs+with+the+Endoplasmic+Reticulum.">Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum.</a> Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).</li><li>Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRICK:+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals.">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods in Enzymology. 572, (2016).</li><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+the+next+challenge.">Phenomics: the next challenge.</a> Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).</li><li>Freimer, N., Sabatti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Phenome+Project.">The Human Phenome Project.</a> Nature Genetics. 34, 15 (2003).</li></ol>

En serie smärre steg under protokollet kommer att säkerställa framgångsrika fluorescens och korrekt räkningarna av mRNA. Det första måste protokollet utföras omedelbart efter insamling och fixering av oocyterna. Observera att PVP är 4% paraformaldehyd fixering bufferten att förhindra oocyter fastnar till varandra. Vi hittade att det är nödvändigt att utföra experimentet omedelbart efter insamling och fixering av oocyterna. Varje försening resulterar i en mycket lägre fluorescens signal som skulle leda til...

Transkriptas polymeras-kedjereaktion (PCR) har varit den gyllene standarden för mRNA kvantifieringsmetoden. Två analyser, digital PCR (dPCR)1 och kvantitativa, real time PCR (qPCR)2 används för närvarande. Av de två PCR-teknikerna har dPCR större känslighet än qPCR tyder på att det kunde användas att mäta mRNA överflöd i enstaka celler. Dock i våra händer producerat dPCR analys av låg överflöd mRNA i pooler av 5 till 10 ägg per varje experimental prov data med låg reproducerbarhet och hög variation3. Detta beror sannolikt på den experimentella fel i samband med RNA-extraktion och omvänd transkription effektivitet. RNA-sekvensering har också utförts med ett enda musklick och mänskliga äggceller4,5. Denna teknik kräver cDNA förstärkning steg krävs för bibliotek produktion vilket sannolikt ökar variationen inom en experimentell grupp. Låg överflöd avskrifter kan dessutom inte upptäckas. Även om sekvensering priserna har gått ner de senaste åren, kan det fortfarande vara kostnadseffektivt oöverkomliga på grund av de höga kostnaderna för bioinformatik analyser. Slutligen, mRNA lokalisering är en dynamisk process med rumsliga förändringar bidrar till protein funktion6. Därför har vi ställt ut för att anta en teknik som skulle ge exakta och reproducerbara kvantitativa åtgärder och lokalisering av enskilda mRNA i enda oocyter.
Grenad DNA kopplat till fluorescens in situ hybridisering förstärker fluorescens signal i stället för ljudförstärkande RNA/cDNA möjliggör detektering av enda mRNA i enskilda celler 7,8,9. Analysen utförs genom en serie av hybridisering, amplifiering (med förgrenade DNA) och fluorescens märkning steg för att förstärka fluorescens signal7. Tekniken börjar med bindningen av 18 - till 25-base oligonukleotiden sonden par som kompletterar en specifik mRNA3,8,10. Femton till tjugo sonden par är utformade för varje avskrift säkerställa specificitet för målet avskriften. MRNA-specifika hybridisering följs av förförstärkare och slutsteg sonder som bildar en förgrenad konfiguration. Ungefärligt binder 400 etikett fluorophores till varje förstärkare, vilket resulterar i en 8000-fold ökning fluorescens som möjliggör identifiering av enskilda mRNA (figur 1)11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg"> Figur 1: Schematisk av protokollet SM-fisk. Sekventiell hybridisering av avskrift specifika sond, grenad DNA förstärkare och fluorophore till ett mål som mRNA visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tidigare studier med enda molekyl fluorescens i situ hybridisering (SM-fisk) lokaliserade β-aktin mRNA i enskilda nervceller12 och humant papillomvirus DNA i livmoderhalscancer cell linjer7. Det datorprogram som plats att hitta och spåra programmet identifierar enskilda punktuell fluorescerande signalen och har framgångsrikt använts för att kvantifiera antalet mRNA i varje cell3,13.
Baserat på resultaten av mRNA detection i nervceller12, hypotesen vi att SM-fisk skulle visa sig vara ett användbart verktyg att kvantifiera avskrift nivåer i murina oocyter och embryon inklusive låg överflöd mRNA. Men tekniken är optimerad för användning med vidhäftande fast celler och formaldehyd fast paraffin inbäddade (FFPE) vävnadssnitt. Oocyter kan inte följa en bild, även när de är belagda med Poly-L-Lysin. Dessutom är de mer ömtålig än somatiska celler och vävnadssnitt resulterar i cellen lysis när de utsätts för vissa av de egenutvecklade buffertarna i kommersiellt tillgängliga kit3. För att övervinna dessa utmaningar, var oocyter fast och manuellt överförs mellan droppar av buffertar. Dessutom byttes permeabilisering och tvätta buffertar i kits för att minska cellys. Fördesignade sonder köps tillsammans med fisk kit eller specifika avskrifter kan begäras. Varje egenutvecklade probe set finns i en av tre fluorescens kanaler (C1, C2 och C3) för att låta för multiplexering. I det nuvarande experimentet var murina oocyter dual-färgade och kvantifieras med hjälp av en C2 Nanog sond och en C3 Pou5f1 sond. Dessa sonder valdes baserat på rapporterade uttryck för Nanog och Pou5f1 i oocyter och embryon. Vid avslutningen av hybridisering steg placerades oocyter i droppar anti fade montering media för ansökan till histologiska bilder. Confocal bilder har använts för att kvantifiera antalet punktuell fluorescerande signaler som företräder enskilda mRNA. Förutom att kvantifiera mRNA, imaging visade också den rumsliga fördelningen av specifika mRNA i cellen, är som andra RNA kvantifiering metoder oförmögen att uppnå. Denna teknik visade sig ha låg variabilitet inom en experimentell grupp som medger användning av mindre antal ägg i varje experimentell grupp att identifiera betydande skillnader mellan experimentella grupper3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="607">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">(&#177;)-&#945;-Lipoic acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T1395</td>
			<td style="width:172px;">Alpha Lipoic Acid</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">199899</td>
			<td>FAF BSA</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD 10mL TB Syringe</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">309659</td>
			<td>10 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">305109</td>
			<td>27 1/2 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7902</td>
			<td>CaCl2-2H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Citric acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2404</td>
			<td>Citrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G6152</td>
			<td>Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Easy Grip Petri Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">351008</td>
			<td>35 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Edetate Disodium</td>
			<td style="width:91px;">Avantor</td>
			<td style="width:123px;">8994-01</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:91px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14084-08</td>
			<td>Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:91px;">Atlanta biologicals</td>
			<td style="width:123px;">S10250</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">15710-064</td>
			<td>Gentamicin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GlutaMAX-I (100X)</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">35050-061</td>
			<td>Glutamax</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gold Seal Micro Slides</td>
			<td style="width:91px;">Gold Seal</td>
			<td style="width:123px;">3039</td>
			<td>25 x 75mm slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Gonadotropin, From Pregnant Mares&#39; Serum</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G4877</td>
			<td>eCG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">hCG recombinant</td>
			<td style="width:91px;">NHPP</td>
			<td style="width:123px;">AFP8456A</td>
			<td>hCG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3884</td>
			<td>Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jewelers Style Forceps</td>
			<td style="width:91px;">Integra</td>
			<td style="width:123px;">17-305X</td>
			<td>Forceps 4-3/8&#34;, Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">L-(+)-Lactic Acid, free acid&#160;</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">190228</td>
			<td>L-Lactate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M2773</td>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:91px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">25-025-Cl</td>
			<td>NEAA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-542-C</td>
			<td>25 x 25x 0.15 mm cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501891-C2</td>
			<td>Nanog Probe</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501611-C3</td>
			<td>Pou5f1 Probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MOPS</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P6148</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PES 0.22 um Membrane -sterile</td>
			<td style="width:91px;">Millex-GP</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>0.22 um filters</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0930</td>
			<td>PVP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60128</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60218</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:91px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">P36934</td>
			<td>Antifade reagent without DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320858</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 1</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320852</td>
			<td>Amplifier 1</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 2</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320853</td>
			<td>Amplifier 2</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 3</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320854</td>
			<td>Amplifier 3</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT A</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320855</td>
			<td>Amplifier 4 ALT A</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT B</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320856</td>
			<td>Amplifier 4 ALT B</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT C</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320857</td>
			<td>Amplifier 4 ALT C</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320851</td>
			<td>FISH Reagent Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320871</td>
			<td>Negative Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Positive Control</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320881</td>
			<td>Positive Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe Diluent</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">300041</td>
			<td>Probe Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnositics</td>
			<td style="width:123px;">322337</td>
			<td>Protease III</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III &#38; IV Reagent Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322340</td>
			<td>FISH Protease Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease IV</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322336</td>
			<td>Protease IV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">S/S Needle with Luer Hub 30G</td>
			<td style="width:91px;">Component Supply Co.</td>
			<td style="width:123px;">NE-301PL-50</td>
			<td>blunt 30 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6191</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">306576</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium pyruvate, &#62;= 99%</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5280</td>
			<td>Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Solution 6 Well Dish</td>
			<td style="width:91px;">Agtechinc</td>
			<td style="width:123px;">D18</td>
			<td>6 well dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Taurine</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8691</td>
			<td>Taurine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue Culture Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">353002</td>
			<td>60 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes

Nuvarande metoder som rutinmässigt används för att kvantifiera mRNA i oocyter och embryon inkluderar digital omvänd-transkription polymeras-kedjereaktion (dPCR), kvantitativa, real-time RT-PCR (RT-qPCR) och RNA-sekvensering. När dessa tekniker utförs med en enda äggcell eller embryo, upptäcks låg-kopia mRNA inte tillförlitligt. För att lösa detta problem, kan oocyter eller embryon poolas tillsammans för analys. Detta leder dock ofta till hög variation bland prover. I detta protokoll beskriver vi användningen av fluorescens in situ hybridisering (FISH) med hjälp av förgrenade DNA kemi. Denna teknik identifierar det rumsliga mönstret av mRNA i enskilda celler. När tekniken är tillsammans med plats att hitta och spårningsprogramvara, kan mängden av mRNA i cellen också kvantifieras. Med denna teknik, finns det nedsatt variabilitet inom en experimentell grupp och färre oocyter och embryon krävs för att identifiera betydande skillnader mellan experimentella grupper. Kommersiellt tillgängliga Grenade-DNA SM-fisk Kit har optimerats för att påvisa mRNA i sektionerad vävnader eller fastsittande celler på bilderna. Men oocyter effektivt följer inte bilder och vissa reagenser i kit var för hård vilket resulterar i äggcellen lysis. För att förhindra detta lysis, har flera ändringar gjorts i fisk-kit. Specifikt, ersatte äggcell permeabilisering och tvätta buffertar för immunofluorescens av oocyter och embryon de egenutvecklade buffertarna. Den permeabilisering, tvättar och inkubationer med sonder och förstärkare utfördes i 6-bra plattor och oocyter placerades på bilder i slutet av protokollet med montering media. Dessa ändringar skulle kunna övervinna begränsningarna av kommersiellt tillgängliga kit, i synnerhet äggcellen Lys. För att korrekt och reproducibly räkna antalet mRNA i enskilda oocyter, användes datorprogram. Tillsammans, utgör detta protokoll ett alternativ till PCR och sekvensering för att jämföra uttrycket av specifika avskrifter i enstaka celler.

Efter slutförandet av protokollet, kommer att leda enskilda bilder från confocal z-serien (figur 4A och figur 5), sydda bilder (figur 4 c), och mRNA räknar (figur 4B). När multiplexing utförs, kommer det också finnas sammanslagna bilder visar etiketten för två olika mRNA (figur 5</str...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Försäljningsbonus reproducibly numrerar av mRNA i enskilda oocyter, enda molekyl RNA fluorescens in situ var hybridisering (RNA-fisk) optimerad för icke-anhängare celler. Oocyter samlades, hybridiseras med de avskrift särskilda sonderna och kvantifieras med hjälp av ett bildbehandlingsprogram för kvantifiering.

Användning av enda molekyl fluorescerande i Situ hybridisering (SM-fisk) för att kvantifiera och lokalisera mRNA i murina oocyter

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Denna teknik möjliggör inte bara lokalisering, men också kvantisering av kandidat mRNAs i de enskilda oocyter och embryon. Jämfört med andra analyser, inklusive PCR, resulterar färdigställande av tekniken i reproducerbara data med låg variation. Visar förfarandet kommer att Kelsey Timme, en doktorand i mitt laboratorium.Påbörja denna procedur med beredning av erforderligt material och honmöss vid fem till åtta veckors ålder enligt beskrivningen i textprotokollet. Rengör musen med hjälp av 70%etanol. Exponera bukhålan och visualisera den kvinnliga reproduktionskanalen.Håll äggstocken med tärna och ta bort livmoderns ligament och överflödig fettvävnad från runt äggstocken. Skär äggleden från livmodern. Placera sedan äggstocksoviduct-paret i varmt holdingmedium i en 35 millimeters maträtt.Ta bort äggstocken och eventuell omgivande fettvävnad. Riv den svullna ampullae av oviduct med hjälp av en halv tum 27 gauge nål. Tryck oviduct på platsen för tår och cumulus cell oocyte komplex kommer att utvisas.Med hjälp av en munpipett för att överföra de äggstockade äggcellerna till 100 mikroliterdroppen som innehåller holdingmedium med hyaluronidas. För att rubba cumulusceller, pipettera metafasen två oocyt cumulus cell komplex upp och ner i hyaluronidase som innehåller innehav medium med mun pipetten. När de är utan cumulus celler, använd mun pipetten för att överföra varje äggcell till en tvätt droppe som endast innehåller innehav medium.Upprepa detta för varje tvättdropp. Överför inte fragmenterade eller genomskinliga oocyter. För att utföra SM-FISH färgning, först fixera oocyter i en enskild brunn av en sex brunnsplatta som innehåller 500 mikroliter av fixeringsbuffert.Submerge 20 oocyter eller mindre i brunnen. Inkubera oocyterna i fixeringsbuffert i 20 minuter i rumstemperatur. Efter tvättning av oocyterna enligt beskrivningen i textprotokollet inkubera oocyter i permeabliseringsbuffert i 30 minuter vid rumstemperatur.Efter en annan tvätt, överför oocyterna till 80 mikroliter av prespättade proteas tre buffert i 30 minuter vid rumstemperatur. Späd de uppvärmda sonderade uppsättningarna för Nanog, Pou5f1 och DapB en till 50 i sondutspädningsvätska. Inkubera oocyter i 80 mikroliter av avskriften specifika sonden i två timmar vid 40 grader Celsius.När oocyter är i sonden och AMP-buffertarna tenderar de att flyta. Det är viktigt att du dränka oocyterna genom att försiktigt trycka in dem i bufferten. Överför oocyterna till 500 mikroliter av tvättbuffert och inkubera i 10 minuter i rumstemperatur.Nu, inkubera äggceller sekventiellt i förstärkningsbuffertar. Först inkubera oocyter i 80 mikroliter av AMP1 i 30 minuter vid 40 grader Celsius. Överför sedan oocyterna till 500 mikroliter av tvättbuffert i 10 minuter vid rumstemperatur.Därefter inkubera äggceller i 80 mikroliter av AMP2 i 15 minuter vid 40 grader Celsius. Efter tvättning av oocyterna som tidigare, inkubera oocyterna i 80 mikroliter av AMP3 i 30 minuter vid 40 grader Celsius följt av en sluttvätt. Slutligen, tillsätt äggceller till 80 mikroliter av AMP4FL i 15 minuter vid 40 grader Celsius.Pipett 12 mikroliter av anti-fade monteringsmedium på mitten av en bild utan att lägga till bubblor till reagensen. Överför oocyter med så lite tvättbuffert som möjligt till monteringsmediet. Slutligen, tillämpa en cover slip.Avbilda de tre dimensionella oocyterna med hjälp av Z-stegs konfokalmikroskopi och spara bilderna enligt beskrivningen i textprotokollet. Dra ND2 filer till Fiji och välj Hyperstack. Klicka på fliken Bild, välj Färg och klicka på Dela kanaler om du vill separera lysrörskanalerna i ND2-filen.Generera enskilda TIFF-filer för varje Z-skiva av oocyterna i varje fluorescerande kanal. Gör det genom att klicka på fliken Bild, välja Staplar och klicka på Stapla till bilder. Klicka sedan på fliken Bild, välj Typ och klicka på RGB-färg för att konvertera varje Z-segment till en individuell RGB-färgbild.Spara varje konverterad bild som en TIFF-fil. Placera bilder från en enda äggcell för varje fluorescerande kanal i en ny mapp för att undvika förvirring under syning. Efter att ha normaliserat filerna enligt beskrivningen i textprotokollet klickar du på fliken Plugins, väljer Stitching och klickar på Grid Collection.Välj Sekventiella bilder på dropdown-menyn och klicka på Okej. Bläddra i katalogen och välj mappen som innehåller alla Z-segmentsbilder för en enskild äggcell vid en våglängd. Klicka på Okej.Flytta reglaget längst ned på den sydda bilden till lämplig färgkanal för den våglängd som används. Skapa den slutliga RGB-sydda bilden genom att klicka på Bild, välja Typ och klicka på RGB-färg. Konvertera den sydda bilden till en 32-bitars maximal projicerad bild.Om du vill göra det klickar du på Bild, väljer Typ och klickar på 32-bitars. Spara den här bilden som en ny TIFF-fil. Öppna den 32-bitars sydda bilden i ett program för att hitta och spåra plats.Välj dropdown för Lokalisera och klicka på Lokalisera, som kommer att beräkna antalet fläckar som finns i bilden. Visas här är kvantifiering av mRNAs med hjälp av plats finder och spårning. Den blå pilen pekar på en positiv signal över tröskelvärdet.Den vita pilen visar en lysrörsplats under tröskeln och därför inte räknas. MRNA-räkningarna analyserades därefter med hjälp av ett standardverktyg för dataanalys. Representativa bilder av bilden i den mellersta Z-serien visas för Pouf51 och Nanog.DAPI-färgning av kromosomer som är i linje på metafasen två spindel visas i vitt. De uppgifter som samlats in i detta protokoll visade 775 Pouf51 avskrifter och 113 Nanog avskrifter i metafas två oocyter. Viktigt, det fanns inga fläckar upptäcks i äggceller som är märkta med DapB sond, som fungerade som den negativa kontrollen.Vid användning av icke-vidhäftande celler är det viktigt att empiriskt identifiera den bästa utspädningen av proteasbuffert från SM-FISH-kitet. mRNA-detektering testades med hjälp av en titreringskurva av outspädda och flera utspädda proteasbuffertkoncentrationer i 1xPBS. Proteas utspädning som används i detta protokoll var en till åtta som det visade den lägsta variationen i den genomsnittliga fluorescerande uttryck för Pouf51 mRNA i metafas två oocyter.Samtidig immunfluorescens av ett målprotein kan utföras för att samlokalisera mRNA med ett RNA-bindningsprotein. Samlokalisering av mRNAs med RNA-bindande proteiner gör det möjligt för utredare att bestämma mekanismer som reglerar mRNA lagring, översättning och nedbrytning inom en äggcell eller embryo.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Slumpmässig mutagenes med användning Histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Upptäckt av Inter-kromosomala Stabila Aberrations av flera Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) och Spectral karyotypering (SKY) i bestrålade möss

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generering av fluorescerande protein Fusioner i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Enda molekyl Analys av Laser Lokaliserade psoralen Addukter

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick tarmar av hela-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...