Name: use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

Dr Daniel R. Larson yükleme ve 13 nokta bulma ve izleme programı kullanımı ve Nebraska Üniversitesi Lincoln mikroskobu çekirdek confocal mikroskobu görüntüleme için teknik destek ile cömert onun yardım için teşekkür. Bu çalışmada bir katkı Nebraska tarımsal araştırma bölümü, Lincoln, Nebraska Üniversitesi'nin temsil eder ve UNL Hatch fonlar (NF'leri-26-206/katılım numarası-232435 ve NF'leri-26-231/katılım numarası-1013511) tarafından desteklenmiştir.

Hayvan yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Üniversitesi Nebraska-Lincoln adlı tarafından onaylanmış ve tüm yöntemleri ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için CD-1 outbred fareler vardı ad libitum erişim normal kemirgen chow ve su; Onlar 12: 12'karanlık muhafaza: ışık döngüsü.
1. gerekli ortam hazırlanması
<ol><li>(OMM) temel medya için 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2<...

<ol>
	<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAMP-dependent+regulation+of+ovulatory+response+genes+is+amplified+by+IGF1+due+to+synergistic+effects+on+Akt+phosphorylation+and+NF-kB+transcription+factors.">CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors.</a> Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).</li><li>Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Single+Molecule+mRNA+Fluorescent+in+Situ+Hybridization+(RNA-FISH)+to+Quantify+mRNAs+in+Individual+Murine+Oocytes+and+Embryos.">Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).</li><li>Ruebel, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+modulates+inflammation+and+lipidmetabolism+oocyte+gene+expression:+A+single-cell+transcriptome+perspective.">Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).</li><li>Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).</li><li>Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNA+and+translation+in+the+mammalian+oocyte+and+embryo.">Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo.</a> PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+A+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology.">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li><li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Larson, B., Malayter, D., Shure, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Detection+of+Cytokine+Cancer+Biomarkers+using+Fluorescence+RNA+In+Situ+Hybridization+and+Cellular+Imaging.">Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging.</a> BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).</li><li>Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+&#946;-Actin+mRNA+Detection+in+Neurons+Reveals+a+Mechanism+for+Regulating+Its+Translatability.">Single &#946;-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability.</a> Science. 343 (6169), 419-422 (2014).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+better+mouse+embryo+assay:+effects+of+mouse+strain+and+in+vitro+maturation+on+sensitivity+to+contaminants+of+the+culture+environment.">Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).</li><li>Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+obesity+alters+the+steroidogenic+response+to+ovulatory+stimulation+and+increases+the+abundance+of+mRNAs+stored+in+the+ovulated+oocyte.">Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte.</a> Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).</li><li>Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-dependent+increases+in+oocyte+mRNAs+are+associated+with+increases+in+proinflammatory+signaling+and+gut+microbial+abundance+of+lachnospiraceae+in+female+mice.">Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice.</a> Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).</li><li>Hirao, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effect+of+visible+light+on+meiosis+of+mammalian+eggs+in+vitro.">Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. , (1978).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+Approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).</li><li>Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+follicle+culture+supports+primary+follicle+growth+through+paracrine-acting+signals.">Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals.</a> Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).</li><li>Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+Regulation+of+Kinase+Signaling+Pathways+by+AREs+and+GREs.">Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs.</a> Cells. 5 (1), 4 (2016).</li><li>Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Immunoprecipitation+for+Determining+RNA-Protein+Associations+In+Vivo.">RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).</li><li>Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative,+in+situ+analysis+of+mRNAs+and+proteins+with+subcellular+resolution.">Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).</li><li>Voigt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Quantification+of+Translation-Dependent+Association+of+mRNAs+with+the+Endoplasmic+Reticulum.">Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum.</a> Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).</li><li>Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRICK:+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals.">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods in Enzymology. 572, (2016).</li><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+the+next+challenge.">Phenomics: the next challenge.</a> Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).</li><li>Freimer, N., Sabatti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Phenome+Project.">The Human Phenome Project.</a> Nature Genetics. 34, 15 (2003).</li></ol>

Protokol sırasında küçük adımlar bir dizi başarılı Floresans ve mRNA'ların doğru sayar sağlayacaktır. İlk olarak, protokol koleksiyonu ve yumurta fiksasyonu hemen sonra gerçekleştirilmelidir. PVP yumurta birbirine yapışmasını önlemek için %4 paraformaldehyde fiksaj arabelleğin eklenir unutmayın. Biz deneme koleksiyonu ve yumurta fiksasyonu hemen sonra gerçekleştirmek gerekli bulundu. Herhangi bir gecikme transkript undercounting neden olacak bir çok daha düşük Floresans sinyal sonuçlanır. ...

Ters transkriptaz Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) mRNA Nefelometri için altın standart olmuştur. İki deneyleri, dijital PCR (dPCR)1 ve nicel, real time PCR (qPCR)2 şu anda kullanılır. İki PCR teknikleri, dPCR qPCR tek hücrelerinde mRNA bereket ölçmek için kullanılabilir olduğu ima daha büyük duyarlılığa sahiptir. Ancak, bizim elimizde, deneysel her örnek başına 5-10 yumurta havuzlarda düşük bereket mRNA'ların analizini dPCR veri düşük tekrarlanabilirlik ve yüksek varyasyon3ile üretti. Bu RNA ayıklama ve ters transkripsiyon verimliliği ile ilgili deneysel hata nedeniyle muhtemeldir. RNA sıralama aynı zamanda tek bir fare ve insan yumurta4,5kullanılarak yapılmıştır. Bu teknik büyük olasılıkla bir deney grubu içinde değişkenlik artar Kütüphane üretimi için gerekli cDNA amplifikasyon adımları gerektirir. Ayrıca, düşük bereket transkript tespit olmayabilir. Her ne kadar sıralama fiyatlar son birkaç yıldır gitti, hala maliyet engelleyici Biyoinformatik analizi yüksek maliyet nedeniyle olabilir. Son olarak, mRNA yerelleştirme protein işlevi6için katkıda kayma değişikliklerle dinamik bir süreçtir. Bu nedenle, doğru ve tekrarlanabilir nicel ölçüler ve tek yumurta içinde bireysel mRNA'ların yerelleştirilmesini üretecektir bir teknik benimsemeye Vadisi'ni gezmeye gidiyoruz.
Dallı DNA Floresans in situ hibridizasyon için birleştiğinde yükselterek RNA/cDNA tek tek hücreler 7,8,9tek mRNA'ların etkinleştirme tespiti yerine Floresans sinyali güçlendirir. Tahlil hibridizasyon, amplifikasyon (dallı DNA'yı kullanarak) ve floresan sinyal7yükseltmek için adımları etiketleme floresan bir dizi aracılığıyla gerçekleştirilir. Teknik bir belirli mRNA3,8,10' a tamamlayıcı 18 - 25 Bankası Oligonükleotid sonda çiftlerinin bağlama ile başlar. On beş-yirmi sonda çiftleri her transkript sağlanması özgüllük hedef transkript için tasarlanmıştır. MRNA özgü hibridizasyon dallı bir yapılandırma oluşturan ön amfi ve amplifikatör probları tarafından takip edilir. Yaklaşık olarak, 400 etiket fluorophores 8000-fold artış bireysel mRNA (şekil 1)11olarak algılanmasını sağlayan Floresans sonuçlanan her amplifikatör bağlamak.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg"> Şekil 1: SM-balık protokolünün şematik. Transkript belirli sonda, sıralı hibridizasyon dallı DNA amplifikatör ve mRNA gösterilir bir hedefe fluorophore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Önceki çalışmalarda in situ hibridizasyon (SM-balık) Lokalize β-aktin mRNA bireysel nöronlar12 ve servikal kanser HPV DNA molekülünü Floresans kullanarak satırları7hücre. Bilgisayar yazılımı nokta bulma ve izleme programı bireysel punctate floresan sinyal tanımlar ve başarıyla mRNA'ların her hücre3,13sayısını ölçmek için kullanılır.
SM-balık transkript düzeyleri fare yumurta ve embriyo düşük bereket mRNA'ların da dahil olmak üzere quantitate için yararlı bir araç olduğunu kanıtlayacak ki nöronlar12mRNA tespiti sonuçlarına dayanarak, biz onaylanmadığına karar. Ancak, teknik yapisan sabit hücreleri ile kullanım için optimize edilmiş ve parafin sabit formaldehit (FFPE) doku bölümleri gömülü. Bile Poly-L-lizin ile kaplı olan yumurtalar bir slayt için uygun değil. Ayrıca, onlar somatik hücre ve doku bölümleri ne zaman piyasada kitleri3özel arabellekleri bazıları tabi hücre lizis sonuçlanan daha kırılgan. Bu zorlukları aşmak için yumurta sabit ve el ile arabellekleri damla arasında transfer. Ayrıca, permeabilization ve yıkama arabellekleri kitleri hücre lizis azaltmak için değiştirildi. Önceden tasarlanmış probları balık seti ile birlikte satın alınan veya belirli transkript talep edilebilir. Her özel yoklama kümesi birinde üç Floresans kanal (C1, C2 ve C3) çoğullama için izin kullanılabilir. Geçerli deneyde, çift lekeli ve quantified C2 MicroRNAs sonda ve C3 Pou5f1 sonda kullanarak fare yumurta vardı. Bu sonda bildirilen ifadede yumurta ve embriyo MicroRNAs ve Pou5f1 göre seçildi. Hibridizasyon adımlar sonucunda, yumurta damla uygulama histolojik slaytlar için anti-fade montaj ortamının yerleştirildi. Confocal görüntüleri bireysel mRNA'ların temsil punctate floresan sinyallerini sayısını ölçmek için kullanılmıştır. MRNA'ların, görüntüleme Ayrıca belirli mRNA kayma dağılımını hücre içinde gösterdi. miktarının yanı sıra hangi diğer RNA miktar yöntemleri elde edemiyoruz. Bu teknik deneysel grupları3arasındaki önemli farkları belirlemek için her deney grubu içinde yumurta daha küçük sayıda kullanımına izin veren bir deney grubu içinde düşük değişkenlik var kanıtladı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="607">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">(&#177;)-&#945;-Lipoic acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T1395</td>
			<td style="width:172px;">Alpha Lipoic Acid</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">199899</td>
			<td>FAF BSA</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD 10mL TB Syringe</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">309659</td>
			<td>10 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:223px;">BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:123px;">305109</td>
			<td>27 1/2 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7902</td>
			<td>CaCl2-2H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Citric acid</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2404</td>
			<td>Citrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G6152</td>
			<td>Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Easy Grip Petri Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">351008</td>
			<td>35 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Edetate Disodium</td>
			<td style="width:91px;">Avantor</td>
			<td style="width:123px;">8994-01</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:91px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14084-08</td>
			<td>Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:91px;">Atlanta biologicals</td>
			<td style="width:123px;">S10250</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">15710-064</td>
			<td>Gentamicin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GlutaMAX-I (100X)</td>
			<td style="width:91px;">gibco</td>
			<td style="width:123px;">35050-061</td>
			<td>Glutamax</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gold Seal Micro Slides</td>
			<td style="width:91px;">Gold Seal</td>
			<td style="width:123px;">3039</td>
			<td>25 x 75mm slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Gonadotropin, From Pregnant Mares&#39; Serum</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G4877</td>
			<td>eCG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">hCG recombinant</td>
			<td style="width:91px;">NHPP</td>
			<td style="width:123px;">AFP8456A</td>
			<td>hCG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3884</td>
			<td>Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jewelers Style Forceps</td>
			<td style="width:91px;">Integra</td>
			<td style="width:123px;">17-305X</td>
			<td>Forceps 4-3/8&#34;, Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">L-(+)-Lactic Acid, free acid&#160;</td>
			<td style="width:91px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:123px;">190228</td>
			<td>L-Lactate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M2773</td>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:91px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">25-025-Cl</td>
			<td>NEAA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-542-C</td>
			<td>25 x 25x 0.15 mm cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501891-C2</td>
			<td>Nanog Probe</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">501611-C3</td>
			<td>Pou5f1 Probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MOPS</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P6148</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PES 0.22 um Membrane -sterile</td>
			<td style="width:91px;">Millex-GP</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>0.22 um filters</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0930</td>
			<td>PVP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60128</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60218</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:91px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">P36934</td>
			<td>Antifade reagent without DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320858</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 1</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320852</td>
			<td>Amplifier 1</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 2</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320853</td>
			<td>Amplifier 2</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 3</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320854</td>
			<td>Amplifier 3</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT A</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320855</td>
			<td>Amplifier 4 ALT A</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT B</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320856</td>
			<td>Amplifier 4 ALT B</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope FL AMP 4 ALT C</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320857</td>
			<td>Amplifier 4 ALT C</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320851</td>
			<td>FISH Reagent Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320871</td>
			<td>Negative Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe 3-plex Positive Control</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">320881</td>
			<td>Positive Control</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Probe Diluent</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">300041</td>
			<td>Probe Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnositics</td>
			<td style="width:123px;">322337</td>
			<td>Protease III</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease III &#38; IV Reagent Kit</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322340</td>
			<td>FISH Protease Kit</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">RNAscope Protease IV</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">322336</td>
			<td>Protease IV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">S/S Needle with Luer Hub 30G</td>
			<td style="width:91px;">Component Supply Co.</td>
			<td style="width:123px;">NE-301PL-50</td>
			<td>blunt 30 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S6191</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">306576</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sodium pyruvate, &#62;= 99%</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5280</td>
			<td>Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Solution 6 Well Dish</td>
			<td style="width:91px;">Agtechinc</td>
			<td style="width:123px;">D18</td>
			<td>6 well dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Taurine</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8691</td>
			<td>Taurine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue Culture Dish</td>
			<td style="width:91px;">Falcon Corning</td>
			<td style="width:123px;">353002</td>
			<td>60 mm dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single molecule fluorescent in situ hybridization (sm-fish) to quantify and localize mrnas in murine oocytes

Geçerli yöntemleri düzenli olarak yumurta ve embriyo mRNA ölçmek için kullanılan dijital ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR), nicel, gerçek zamanlı RT-PCR (RT-qPCR) ve RNA sıralama içerir. Bu tekniklerin bir tek yumurta veya embriyo kullanılarak gerçekleştirildiğinde, düşük-kopya mRNA'ların güvenilir bir şekilde tespit edilmedi. Bu sorunu çözmek için yumurta veya embriyo birlikte analiz için havuza; Ancak, bu kez yüksek değişkenlik örnekleri arasında yol açar. Bu protokol için Floresans in situ hibridizasyon (balık) dallı DNA kimya kullanarak içinde nasıl kullanılacağını açıklar. Bu teknik mRNA'ların tek tek hücreleri içinde kayma desenini tanımlar. Teknik nokta bulma ve izleme bilgisayar yazılım ile birleştiğinde, mRNA'ların Hücre bolluğu da sayısal. Bu tekniği kullanarak, bir deney grubu içinde azaltılmış değişkenlik var ve daha az sayıda yumurta ve embriyo deneysel grupları arasında önemli farklılıklar tespit etmek gerekir. Piyasada bulunan dallı DNA SM-kesitli dokularda veya slaytlardaki yapışık hücreleri mRNA'ların algılamak için optimize balık kitleri. Ancak, yumurta etkili slaytlara uymayan ve bazı reaktif kitinde oosit lizis kaynaklanan çok sert. Bu lizis önlemek için birçok değişikliği balık seti için yapılmıştır. Özellikle, yumurta permeabilization ve yıkama arabellekleri yumurta ve embriyo ayirt için tasarlanmış özel arabellekleri yerine. 6-iyi levha permeabilization, yıkama ve incubations sonda ve amplifikatör ile gerçekleştirilen ve yumurta montaj medya iletişim kuralı'nı sonundaki slaytlarda yerleştirildi. Bu değişiklikler ticari olarak mevcut kit özellikle, oosit lizis sınırlamaları aşmak başardık. Doğru ve tekrarlanarak mRNA'ların tek tek yumurta içinde saymak için bilgisayar yazılımı kullanılmıştır. Birlikte, bu iletişim kuralını PCR ve sıralamanın Tek Kişilik hücrelerde belirli transkript ifadesi karşılaştırmak için bir alternatif temsil eder.

İletişim kuralı tamamlandıktan sonra confocal z-serisi (şekil 4A ve şekil 5), dikişli görüntüleri (şekil 4 c), tek tek görüntüleri sonuç olacaktır ve mRNA sayar (şekil 4B). Çoğullama gerçekleştirildiğinde, Ayrıca birleştirilmiş görüntüleri iki farklı mRNA'ların (...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes at JoVE.com

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Tekrarlanarak mRNA'ların içinde bireysel yumurtalar, tek molekül RNA Floresans in situ olarak sayıları saymak için hibridizasyon (RNA-balık) yapışık olmayan hücreler için optimize edildi. Yumurtalar toplanmıştır, transkript belirli probları ile melezleşmiştir ve bir görüntü miktar yazılımı kullanarak sayılabilir.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Bu teknik sadece lokalizasyona değil, bireysel oositve embriyolarda aday mRNA'ların sayısallaştırılmasına da olanak sağlar. PCR dahil olmak üzere diğer tahlillerle karşılaştırıldığında, tekniğin tamamlanması düşük varyasyonlu tekrarlanabilir verilerle sonuçlanır. Prosedürü gösteren Kelsey Timme, benim laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olacak.Metin protokolünde açıklandığı gibi, beş ila sekiz haftalık bir yaşta gerekli malzeme ve dişi farelerin hazırlanması ile bu prosedüre başlayın. Fareyi %70 etanol kullanarak temizleyin. Karın boşluğuortaya çıkarmak ve kadın üreme sistemi görselleştirmek.Forceps ile yumurtalık tutun ve yumurtalık çevresinden rahim bağları ve aşırı yağ dokusu kaldırın. Oviduct'i rahimden kes. Daha sonra, 35 milimetrelik bir çanak sıcak tutma orta yumurtalık oviduct çifti yerleştirin.Yumurtalık ve herhangi bir çevreleyen yağ dokusu çıkarın. Yarım inç 27 gauge iğne kullanarak oviduct şişmiş ampullae gözyaşı. Gözyaşı ve kümülüs hücre lisit komplekslerinin bulunduğu yere itin.Yumurtalanmış yumurtaları hyaluronidase ile tutma ortamı içeren 100 mikrolitrelik damlaya aktarmak için bir ağız pipeti kullanarak. Kümülüs hücrelerini yerinden çıkarmak için, pipet, ağız pipeti ile tutma ortamı içeren hyaluronidase yukarı ve aşağı metafaz iki oosit kümülüs hücre kompleksleri. Kümülüs hücrelerinden yoksun kaldıktan sonra, her yumurtayı sadece tutma ortamı içeren bir yıkama damlasına aktarmak için ağız pipetini kullanın.Her yıkama damlacık için bunu tekrarlayın. Parçalanmış veya saydam yumurtaları aktarmayın. SM-FISH boyama gerçekleştirmek için, ilk fiksasyon tampon 500 mikrolitre içeren altı kuyu plaka bireysel bir kuyuda oositler düzeltmek.20 veya daha az yumurtayı kuyuya batırın. Yumurtaları oda sıcaklığında 20 dakika sabitleme tamponuna yatırın. Metin protokolünde açıklandığı gibi oositleri yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında 30 dakika permeablizasyon tamponunda yumurta ları kuluçkaya yatırın.Başka bir yıkamadan sonra, yumurtaları 80 mikrolitre önceden seyreltilmiş proteaz üç tampon oda sıcaklığında 30 dakika aktarın. Nanog, Pou5f1 ve DapB 1'den 50'ye kadar sonda seyreltme için ısıtılmış sonda setlerini seyreltin. 40 santigrat derecede iki saat boyunca transkript spesifik prob 80 mikrolitre içinde kuluçka oositler.Yumurtalar sonda ve AMP tamponlar olduğunda, onlar yüzer eğilimindedir. Yumurtaları yavaşça arabelleğe iterek batırmanız esastır. Yumurtaları 500 mikrolitre yıkama tamponuna aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.Şimdi, yumurtaları amplifikasyon tamponlarında sırayla kuluçkaya yatırın. İlk olarak, 40 santigrat derecede 30 dakika boyunca 80 mikrolitre AMP1 yumurta kuluçka. Daha sonra yumurtaları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 mikrolitre yıkama tamponuna aktarın.Daha sonra, 80 mikrolitre AMP2'de 40 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yat. Daha önce olduğu gibi yumurtaları yıkadıktan sonra, 40 santigrat derecede 30 dakika boyunca 80 mikrolitre AMP3'te yumurtaları kuluçkaya yatırın ve ardından son bir yıkama. Son olarak, 40 santigrat derecede 15 dakika boyunca 80 mikrolitre AMP4FL için oosit ekleyin.Pipet 12 mikrolitre anti-fade montaj ortamı reaktifine kabarcıklar eklemeden bir slaytın ortasına. Yumurtaları mümkün olduğunca az yıkama tamponu yla montaj ortamına aktarın. Son olarak, bir kapak fişi uygulayın.Z-adım konfokal mikroskopi kullanarak üç boyutlu oositleri görüntüleyin ve metin protokolünde açıklandığı gibi görüntüleri kaydedin. ND2 dosyalarını Fiji'ye sürükleyin ve Hyperstack'i seçin. ND2 dosyasının floresan kanallarını ayırmak için Resim sekmesini tıklatın, Renk'i seçin ve Kanalları Böl'ü tıklatın.Her floresan kanaldaki yumurtaların her Z dilimi için tek tek TIFF dosyaları oluşturun. Bunu yapmak için Resim sekmesini tıklatın, Yığınlar'ı seçin ve Resimlere Yığın'ı tıklatın. Ardından, Resim sekmesini tıklatın, Türü seçin ve her Z dilimini tek bir RGB renkli görüntüye dönüştürmek için RGB Color'ı tıklatın.Dönüştürülmüş her görüntüyü TIFF dosyası olarak kaydedin. Dikiş sırasında karışıklığı önlemek için görüntüleri her floresan kanal için tek bir oositi yeni bir klasöre yerleştirin. Metin protokolünde açıklandığı gibi dosyaları normalleştirdikten sonra Eklentiler sekmesini tıklatın, Dikiş'i seçin ve Grid Collection'ı tıklatın.Açılan menüden Sıralı Görüntüler'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Dizine göz atın ve tek bir dalga boyunda tek bir oosit için Tüm Z dilimi görüntülerini içeren klasörü seçin. Tamam'ı tıklatın.Dikişli görüntünün altındaki kaydırıcıyı kullanılan dalga boyu için uygun renk kanalına taşıyın. Resim'e tıklayarak, Tür'u seçerek ve RGB Color'ı tıklatarak son RGB dikişli görüntüyü oluşturun. Dikişli görüntüyü 32 bit maksimum yansıtılan resme dönüştürün.Bunu yapmak için Resim'i tıklatın, Tür''u seçin ve 32 bit'i tıklatın. Bu görüntüyü yeni bir TIFF dosyası olarak kaydedin. 32 bit dikişli görüntüyü bir nokta bulma ve izleme programında açın.Yerelleştir açılır dosyasını seçin ve resimde bulunan nokta sayısını hesaplayacak olan Yerelleştir'i tıklatın. Burada gösterilen nokta bulucu ve izleme kullanarak mRNA'ların nicelleştirilmesidir. Mavi ok, eşiğin üzerindeki pozitif sinyali işaret ediyor.Beyaz ok, eşiğin altında floresan bir nokta gösterir ve bu nedenle sayılmaz. MRNA sayımları daha sonra standart bir veri analizi aracı kullanılarak analiz edildi. Orta Z serisi görüntü temsili görüntüler Pouf51 ve Nanog için gösterilir.Metafaz iki iğde hizalanmış kromozomların DAPI boyama beyaz gösterilir. Bu protokolde toplanan veriler, metafaz iki oositte 775 Pouf51 transkript ve 113 Nanog transkripti gösterdi. Daha da önemlisi, negatif kontrol olarak görev yapan DapB sondası ile etiketlenmiş yumurtalarda herhangi bir nokta saptırılmadı.Non-yapışık hücreleri kullanırken, ampirik SM-FISH kiti proteaz tampon en iyi seyreltme belirlemek önemlidir. mRNA tespiti 1xPBS'de seyreltilmemiş ve birkaç seyreltilmiş proteaz tampon konsantrasyonunun titrasyon eğrisi kullanılarak test edildi. Bu protokolde kullanılan proteaz seyreltme metafaz iki oositlerde Pouf51 mRNA ortalama floresan ekspresyonunda en düşük varyasyonu gösterdiği nden 1-8 arası dır.Bir hedef proteinin eşzamanlı immün-floresansı, mRNA'yı RNA bağlayıcı proteinle birlikte lokalize etmek için yapılabilir. MRNA'ların RNA bağlayıcı proteinlerle birlikte lokalizasyonu, araştırmacıların bir yumurta veya embriyo içinde mRNA depolama, çeviri ve bozulmayı düzenleyen mekanizmaları belirlemelerine olanak tanır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Floresan protein füzyonları üretilmesi<em&gt; Candida</em&gt; Türler

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...