Name: an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-12-16T12:00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Forfatterne har ingen bekræftelser

Brugen af lipoaspirat og mave prøver er blevet godkendt af den institutionelle Review Board (IRB) af Rutgers University — Newark campus.
1. fremstilling af vævskultur medier
<ol><li>Sterilely klargør 500 mL vævskultur medier, før de isolerer ASCs. For at forberede kultur medierne tilsættes 10% defineret føtal kalv serum (FCS) og penicillin-streptomycin (10.000 U/100 mL) til Dulbecco's minimale essentielle medier (DMEM) med høj glukose og 2 mM L-glutamin. Mediet kan opbevares ved 4 °C i op til 3 uger og skal altid anvendes varmt (mellem rumtemperatur og 37 °C).<ol>
<li>Hvis et andet medie foretrækkes til stamcellernes kultur, bør du i stedet forberede mediet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolering af ASCs fra fedtvæv
<ol><li>Få lipoaspirater eller mave-eller abdominalprøve (r). Efter IRB-godkendelse, indhente sådanne prøver som kassere væv efter forskellige kirurgiske procedurer. Transporterer lipoaspiraterne til laboratoriet i det fartøj, kirurgen fjernede vævet; transport mave prøver i en operationsstue prøve pose eller container.</li>
	<li>Prøven (erne) opbevares ved stuetemperatur i op til 6 timer eller ved 4 °C i op til 24 timer, hvis den ikke behandles med det samme. Vævsprøver behandlet ud over de førnævnte tidspunkter vil sandsynligvis have en formindsket celle udbytte. Hold mave prøver fugtig ved tilsætning af 1x steril fosfat bufferet saltvand.</li>
	<li>Fra dette punkt og fremefter, udføre alle trin i en laminar flow hætte under aseptiske forhold. Bær handsker til personlig beskyttelse. Hold 10% blegemiddel, 70% ethanol og papirhåndklæder i nærheden for hurtigt at rydde op i eventuelle biologiske udslip. Bortskaffelse af overskydende væv som biomedicinsk affald.</li>
	<li>Stikprøverne i < 1 mm stykker. Hvis den mave blok er for stor til at arbejde med, skære en håndterbar størrelse af væv ud af blokken før hakning. Overføre det mave vævet til låget på en steril 100 mm plade. Brug en steril nål til at holde et stykke væv på plads og brug en steril skalpel til at hakde brikkerne ud ved enten at skære eller forsigtigt shredding ud af bulk-vævet.<ol>
<li>Dette trin er generelt ikke nødvendigt for lipoaspirater. Men hvis der observeres store Vævsstykker i lipoaspiratet, fjernes sådanne bidder med sterile pincet og behandles som ovenfor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overføres vævet til et friskt rør og vendes eller rystes prøven 5 – 6 gange for at sikre, at alle lag blandes. Valgfrit: Hvis lipoaspiratet er helt afregnet, skal du fjerne og kassere olie laget før blanding.</li>
	<li>Overfør 2,5 – 5 mL væv til en 100 mm vakuum-gas plasma behandlet vævskultur plade (tabel over materialer). Måleprøvens rumfang ved at hælde i et friskt centrifugeglas. Brug om nødvendigt en steril spatel til at hjælpe med at overføre vævet.</li>
	<li>Tilsæt en tilsvarende mængde vævskultur medier til pladen. Drej forsigtigt pladen for at blande indholdet.</li>
	<li>Der inkubaterer Pates ved 37 °C i 5% CO2 , indtil der er et tilstrækkeligt antal celler på pladens bund. Over tid, vil cellerne migrere fra i vævet på pladens overflade, på hvilket tidspunkt de vil holde sig til plastik. Når de forlader vævet, vil cellerne fremstå som små klynger omkring vævs stykkerne.</li>
	<li>Hver 24 h, fjerne så meget væske som muligt og erstatte med en lignende mængde medier. Lad stykker af væv på plads, hvis det er muligt.</li>
	<li>Når et tilstrækkeligt antal celler er noteret på pladen (> 10 klynger af > 15 – 25 celler på pladen) eller efter 7 dage, afhængigt af hvad der er før, fjerne alle resterende stykker af væv.</li>
	<li>Kultur ASCs i vævskultur medier, indtil de når 70% konfluency eller indtil klyngerne bliver tætte (> 5 tætte klynger af celler på pladen, hver med en diameter på ca. > 500 μm), på hvilket tidspunkt cellerne skal passaged.</li>
</ol>3 ASCs-kultur
<ol><li>Passage ASCs, når den overordnede plade når ca. 70% konfluency. Pas på at undgå over konfluency af ASC kulturer.</li>
	<li>Skyl pladen forsigtigt med 1x fosfat bufferet saltvand og trypsinere de vedede celler. For at trypsinere cellerne, Aspirér fosfat bufferet saltvand og tilsæt 1 mL trypsin med 0,25% EDTA til hver plade og Inkuber ved 37 °C i 5 min. Efter 5 min, Bekræft de-overholdelse af mikroskopi. Hvis cellerne stadig er overholder, skal du returnere cellerne til inkubator i yderligere 5 minutter.</li>
	<li>Tilsæt en lille mængde medier (ca. 25% af den totale trypsin-volumen) til pladen for at deaktivere trypsin, og vask forsigtigt bunden af pladen ved hjælp af mediet/trypsin. For at vaske pladen skal du holde pladen i en lille vinkel og forsigtigt afpipettere mediet/trypsin fra toppen af pladen nedad og løsne alle ugentlige tilsluttede celler fra pladen. Cellerne kan genbruges ved et 1:3-forhold eller seedet med en densitet på 120000 – 500000 celler pr. plade.<ol>
<li>Hvis såning er baseret på celletal, skal du overføre trypsin/mediet fra pladen til et konisk centrifugeglas og pille cellerne ved at centrifugeres ved 300 x g i 7 min. resuspension af cellerne i vævskultur medier (ca. 1 ml pr. startplade) og Tæl cellerne før såning. For at tælle cellerne skal du overføre 10 μL af cellesuspensionen til hemocytometer og tælle cellerne til stede i 4 x 4 kvadrant i hvert hjørne af gitteret. Gennemsnitlige disse værdier sammen og Multiplicerer værdien med 104 for at beregne celle nummeret.</li>
		<li>Tilsæt mediet til pladen før såning af cellerne. Tilsæt cellerne på en dråbevis måde og drej derefter pladen for at sikre jævnt fordeling over pladen. Bemærk: efter 3 passager skal de vedlige celler fremstå asymmetriske og spindel formede. ASC fænotype og adfærd kan bekræftes ved hjælp af flow cytometri og differentierings analyser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bekræftelse af ASC fænotype og adfærd ved hjælp af flow cytometri og differentierings assays<ol>
<li>Flow cytometri<ol>
<li>Saml og pellet cellerne som beskrevet ovenfor. Skyl pelleteret med 1x fosfat bufferet saltvand og mærk cellerne med producentens anbefalede volumener af antistof. En detaljeret protokol for strømnings cytometri, en fælles laboratorieprocedure, kan findes her12,14,15.</li>
			<li>Vælg overflade markerings paneler fra følgende for at bekræfte ASC phenotype: negativ for CD14, CD31, CD34, CD45 og CD106; og positiv for CD29, CD36, CD44, CD73, CD90 og CD10516,17,18,19. Tilstedeværelsen af CD36 og fravær af CD106 skelne ASCs fra knoglemarv-afledte MSCs20.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Differentierings assays: Bekræft multi differentiering ved hjælp af et MSC differentierings kit. Kits er tilgængelige fra flere producenter til at bekræfte adipogenic, osteogen, og chondrogenic differentiering kapacitet. Skift de medfølgende medier hver 3 – 4 dage i henhold til producentens protokoller i 3 uger, eller indtil der observeres morfologisk differentiering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kultur cellerne for flere passager; antallet af nødvendige passager vil afhænge af ansøgningen (erne). Ved hver passage skal du bekræfte MSC-cellens morfologi og fænotype ved hjælp af de førnævnte celleoverflade markører og sikre, at differentierings kapaciteten for flere alders typer ikke er gået tabt. Mens ekspansions potentialet varierer blandt donorer, kan de fleste prøver udvides til op til 6-9 passager.</li>
	<li>Kryopreserver cellerne og opbevar dem i flydende nitrogen til fremtidig brug.</li>
</ol>4 cryopreservation af ASCs
<ol><li>Klargør 10 mL fryse opløsninger A og B.<ol>
<li>Til frysning af opløsning A tilsættes 20% FCS til DMEM med høj glukose.</li>
		<li>Til frysning af opløsning B tilsættes 20% FCS og 20% dimethylsulfid (DMSO) til DMEM med høj glukose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 5 min. resuspension af cellerne i en lille mængde fryse opløsning a og Tæl cellerne ved hjælp af et hemocytometer som i trin 3.3.1.</li>
	<li>Beregn den endelige volumen, at cellerne vil blive resuspenderet i at nå en endelig celle koncentration på 500000 – 1000000 celler/mL. Brug fryse opløsning A til at resuspendere pellet i 50% af denne endelige volumen. Tilsæt langsomt en tilsvarende mængde fryse opløsning B dråbevis, mens du agiterer røret for at nå den endelige celle koncentration.</li>
	<li>Straks fryse cellerne i 1 – 2 mL cryovials. Fryse kryovialerne i en kontrolleret hastighed fryser eller i en fryse beholder placeret ved-80 °C, hvilket nedsætter temperaturen med 1 °C/min. Efter den kontrollerede fryse (natten over for en fryse container), Overfør cellerne til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal/stem+cells+in+drug+therapy:+New+perspective.">Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective.</a> Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).</li><li>Conde-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+Mechanical+Isolation+of+Adipose-derived+Stromal+Vascular+Fraction:+Review+of+Upcoming+Techniques.">Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Hendijani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+An+advantageous+method+for+isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+tissues.">Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues.</a> Cell Proliferation. 50 (2), (2017).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells.">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+a+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+different+methods+of+handling+human+liposuction+aspirate+and+their+effect+on+adipocytes+and+adipose+derived+stem+cells.">In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-Free+Isolation+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).</li><li>Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+effective+strategy+for+the+isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+minimally+manipulated+adipose-derived+stem+cells+for+more+rapid+and+safe+stem+cell+therapy.">A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy.</a> Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discussion+on+adult+mesenchymal+stem+cells+for+drug+delivery:+pros+and+cons.">A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons.</a> Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Barlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+placenta-+and+bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).</li><li>Munoz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feline+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+show+similar+phenotype+and+functions+with+regards+to+neuronal+differentiation+as+human+MSCs.">Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs.</a> Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).</li><li>Amati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+cord+blood:+evaluation+of+in+vitro+quality+parameters+prior+to+clinical+use.">Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14 (2017).</li><li>Bajek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+liposuction+method+influence+the+phenotypic+characteristic+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells.</a> Bioscience Reports. 35 (3), (2015).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Isolation,+Characterization+and+Expansion+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+(ASCs):+An+Overview.">Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).</li><li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal/stem+cells:+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+(IFATS)+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+(ISCT).">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li><li>Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+without+tissue+destruction:+a+non-enzymatic+method.">Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method.</a> Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).</li><li>Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+"Bench+to+Bedside":+Current+Advancement+on+Large-Scale+Production+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">From "Bench to Bedside": Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre

ASCs er en attraktiv kilde til MSCs på grund af den nemme adgang til vævet. For både kliniske og forsknings applikationer, skal forskerne huske på donor variabilitet ved isolering og dyrkning af disse celler. Af grunde, der endnu ikke er belyst, viser MSCs fra forskellige donorer forskellige kapaciteter til at formere in vitro, hvilket efterfølgende vil påvirke ASC'S migration ud af fedtforklarings-og sprednings kapaciteten. Mens variabilitet kan observeres i den tid, det tager for ASCs isoleret fra disse enzym-fri bruskeksplantater at nå confluency, det var sjældent for en prøve ikke at formere in vitro.
Ud over donor variabilitet er den mest sandsynlige kilde til svigt af cellerne til at migrere ud af vævet og/eller proliferere in vitro den tid, som vævet blev opbevaret før forarbejdningen. Når prøverne fik lov til at sidde i > 12 timer før forarbejdningen eller ikke blev holdt fugtige mellem høst og forarbejdning, blev der observeret dårligere migrations-og sprednings rater. De eneste prøver, der ofte undladt at formere sig var mave prøver, der ikke blev holdt fugtig med en saltvandsopløsning: i disse tilfælde, væv i midten af vævs blokken var ofte fugtig nok til at behandle, men lejlighedsvis behov for at blive kasseret. Det er derfor afgørende at holde vævet fugtig fra høst tidspunktet gennem forarbejdning.
I tilfælde, hvor der ikke observeres ASC'er på pladen ved 1-ugers mærket, bør de fedtfri planter stadig fjernes fra vævskultur pladerne, så vævsnekrose opstår. Nogle gange er der for få celler til nemt at identificere, men de få celler vil være i stand til at udvide inden for kultur systemet. Hvis cellerne stadig ikke observeres på 3 uger, bør isolationen betragtes som mislykket.
I nogle tilfælde, især af mave-skum, er det ikke muligt at opnå en ægte aseptisk prøve på grund af begrænsningerne i Operations arenaen. Hvis det ikke er muligt at bruge et sterilt fartøj til at transportere vævet fra operationsstuen til en laminar flow hætte, er det generelt tilstrækkeligt at fjerne den yderste 1 cm af vævet for at forhindre kontaminering af mikroorganismen. Hvis den mave prøve er fastgjort til huden, kan huden tørres med 70% ethanol til at sterilisere denne overflade før hakning fedtvæv.
Under hakning proces, er det vigtigt, at vævet er hakket i små, fine stykker. Hvis bruskeksplantater er for store, vil der være utilstrækkelig overflade for ASCs at migrere ud af vævet og på pladen. Endvidere er det afgørende, at vævet ikke forbliver i pladen længere end nødvendigt, for at vævet bliver nekrotisk.
En begrænsning af denne metode er brugen af et enzym (i den beskrevne protokol, trypsin) til at frigøre ASCs under vævskultur processen. Andre ikke-animalske afledte enzymer, såsom Accutase, kan udskiftes for at fjerne behovet for animalske produkter, men dette vil øge omkostningerne ved vævs kulturen. Af denne grund, blandt andre, er talrige grupper undersøger ikke-to-dimensionelle vævskultur metoder såsom bioreaktorer og stilladset-baserede systemer til at øge MSC vækstpotentiale samtidig minimere behovet for at frigøre cellerne fra deres substrat22.
Når du flytter ASCs til klinikken, en stor begrænsning af forklaringsisolerende metode er afhængigheden af en god fremstillingspraksis (GMP) niveau vævskultur facilitet, som mange medicinske centre mangler. I disse tilfælde skal der anvendes en hvilken som helst af de selv lukkede kommercielt tilgængelige enzym-eller Centrifugerings baserede metoder. Men da GMP-faciliteterne bliver mere udbredte, forventes denne virkning at være begrænset. I mellemtiden, selv sådanne faciliteter mangler GMP vævskultur faciliteter kan overveje at bruge explant metode til at studere ASCs in vitro: jo mindre manipulation, jo mere beslægtet disse celler er til deres in vivo modparter11.
Denne metode giver en enkel måde at isolere ASC'er fra fedtvæv-både lipoaspirater og abdominoplasiteter-i fravær af barske enzymer eller Centrifugerings trin. Mens den oprindelige udbytte af ASCs er lavere end andre metoder, den ASCs vil formere sig in vitro, minimere effekten af den lavere oprindelige afkast. Manglen på overdreven eller kraftig manipulation gør ASC'er isoleret på en særlig relevant måde, da der er færre spørgsmål (dvs. om de observerede virkninger skyldes selve cellerne eller cellernes manipulation under isolations processen ).

Mesenchymal stamceller (MSCs) er en klasse af Multipotente voksne stamceller, der kan isoleres fra forskellige voksne og føtal væv, herunder fra fedtvæv. Disse celler er en attraktiv celletype for både grundforskning og kliniske anvendelser på grund af deres plasticitet til at skelne i celler af alle kimlag in vitro, Cross allogene barrierer, hjem til områder med betændelse, og undertrykke inflammation (revideret i Sherman, et al.1). Fedtvæv-afledte MSCS (ASCs) er særligt tiltalende på grund af deres lethed af obtainment, som fedtvæv er generelt betragtes kassere væv efter rutine liposuge og mave procedurer. Når prøverne er opnået, udsættes de dog generelt for barske forhold – enten enzymatiske tilstande eller Centrifugerings stoffer – for at isolere ASCs2,3. Denne metode illustrerer en simpel procedure for isolering af ASC'er ved hjælp af en forklarende metode, i mangel af barske enzymatiske eller Centrifugerings trin.
Den mest almindelige metode til isolering af ASCs består i at vaske en fedtprøve, enzymatisk fordøje prøven med kollagenase, centrifugering af prøven og endelig lyserende de røde blodlegemer før dyrkning af ASCs4. Selv om det er effektivt at isolere et højt udbytte af ASC'er, betragtes brugen af xenogeniske komponenter (f. eks. enzymatisk fordøjelse med kollagenase) som mere end "minimalt manipuleret" af den amerikanske fødevare-og lægemiddel administration og kan udgøre risici såsom immunreaktion, der forbyder cellernes brug i klinikken5,6. For at minimere risiciene ved xenogeniske komponenter har mange grupper foreslået ikke-animalske afledte, fremstillede enzymer til at fordøje fedtvæv. Men, disse enzymer er stadig barske, og kan ændre cellen fænotype7.
Andre metoder til isolering af ASCs omfatter højhastigheds centrifugering, ved hjælp af kræfter så højt som 1.200 x g, og vortexning at isolere ASCs8. Selv kræfter så lave som 400 x g var tilstrækkelige til at isolere levedygtige ASCs9. Mens disse celler producerer en stor mængde af levedygtige celler, mange protokoller undladt at formere sig ud over 14 dage8. Yderligere, mekanisk isolation giver færre genvundne celler end enzymatisk fordøjelse, men en højere andel af isolerede celler var ASCs i forhold til andre celler endogene til fedtvæv ved passage 010.
Isolationen af en renere, mere levedygtig population af ASC'er på kortere tid, kombineret med omkostninger og risici ved xenogeniske komponenter, gør enzymatisk fordøjelse mindre og mindre tiltrækkende for oversættelse til klinikken. Mens mekanisk isolation er i første omgang en gunstig tilgang, der er betydelig forskel i de anvendte metoder, og mængden af forarbejdet væv er begrænset til størrelsen af de specialiserede centrifugal enheder, og kan være afhængig af operatørens konsistens2.
Mens både enzymatisk fordøjelse og centrifugering hurtigt giver et højt volumen af ASCs, viser disse isolerede celler fænotypiske ændringer, hvilket giver spørgsmål om deres opførsel, når de returneres til en patient2. En explant-baseret metode til ASC isolation, som beskrevet i denne protokol, er således ansat af nogle grupper, hvorved ASCs migrere ud af små stykker af fast fedtvæv3,11,12. Denne migration er sandsynligvis en effekt af de celler, der trækkes til de næringsrige medier. Ligesom andre populationer af MSCs, ASCs overholde plastik, og overleve og formere sig i de anvendte væv kultur medier (komponenter nedenfor), der tillader deres isolation fra de andre celletyper fra fedtvæv. Mens færre celler i første omgang inddrives-ofte tager > 1 uge, indtil cellerne er synlige på vævskultur pladen-disse umanipulerede ASCs vil formere sig in vitro, tillader udvidelse af cellerne til klinisk relevante volumener11,12,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3003 tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>serum is batch tested to ensure it supports MSC growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells

Mesenchymal stamceller (MSCs) er en population af Multipotente celler, der kan isoleres fra forskellige voksne og føtal væv, herunder fedtvæv. Som en klinisk relevant celletype er det nødvendigt med optimale metoder til at isolere og udvide disse celler in vitro. De fleste metoder til at isolere fedtvæv-afledte MSCS (adscs) stole på barske enzymer, såsom collagenase, at fordøje fedtvæv. Men, mens effektiv til at nedbryde fedtvæv og giver en høj ADSC opsving, disse enzymer er dyre og kan have skadelig virkning på adscs-herunder risikoen for at bruge xenogene komponenter i kliniske anvendelser. Denne protokol beskriver en metode til at isolere adscs fra friske lipoaspirat og mave prøver uden enzymer. Kort, denne metode er afhængig af mekanisk disassociation af enhver bulk væv efterfulgt af en explant-type kultur system. ADSCs er tilladt at migrere ud af væv og på vævskultur pladen, hvorefter ADSCs kan dyrkes og udvides in vitro for et vilkårligt antal forskning og/eller kliniske anvendelser.

Ved hjælp af den metode, der er beskrevet her, blev ASCs med succes isoleret fra lipoaspirat og mave prøver (figur 1). Efter tre passager blev de isolerede celler fundet at have en MSC morfologi (asymmetrisk, spindel form) og fænotype, svarende til ASCs efter enzymatisk fordøjelse (figur 2). Tidligere undersøgelser fra vores gruppe og andre har vist disse ASC'er at differentiere i adipocytter, osteocytter, og neuroner som andre MSCS, herunder ASCs isoleret ved andre midler11,21.
I de fleste tilfælde kan ASCs migration på vævskultur pladen visualiseres inden for 3 – 5 dage ved lyse felt mikroskopi. Men i nogle tilfælde vil kun sparsomme celler være synlige efter 7 dage. I sjældne tilfælde vil cellerne ikke migrere på pladen og/eller vil ikke formere sig indtil den tredje passage. Dette resultat korrelerer generelt med en forsinkelse i behandlingen af vævsprøven.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig1.jpg"> Figur 1: skematisk gengivelse af ASC isolation fra mave og lipoaspirat prøver. Prøver af abdominaloplastik og lipoaspirat blev fremstillet som kassvæv efter rutinemæssige kirurgiske indgreb. Mave prøver blev shredded, hvorefter enten abdominoplastik eller lipoaspirat prøver blev belagt som bruskeksplantater i vævskultur medier. ASCs migrerede ud af vævet, mod næringsrige medier. Efter 1 uge blev bruskeksplantater fjernet, og der blev dyrket ASC'er med henblik på downstream-eksperimenter og/eller klinisk anvendelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig1alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig2.jpg"> Figur 2: isolerede ASC'er med en MSC morfologi og fænotype. ASCs isoleret af den enzym frie, explant metode har en MSC morfologi og fænotype ved passage 3. A) som andre MSCS har disse ASC'er en asymmetrisk spindel form, uanset om den er isoleret med en forklarende eller enzymatisk metode (f. eks. kollagenase). De ASCs isoleret ved hjælp af enzym metoden giver en længere, smallere morfologi i forhold til den explant isolerede ASCs; sidstnævnte er tættere på kvikskranker afledt af andre enzym frie isolations metoder, såsom knoglemarv afledte-MSCs. (B) ligesom andre MSCS er de isolerende isolerede ASC'er negative for CD45 og positive for CD73, CD90 og CD105. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig2alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Denne protokol giver en enzym-fri metode til isolering af mesenchymale stamceller fra mave og lipoaspirat prøver ved hjælp af en forklarings metode. Fraværet af barske enzymer eller Centrifugerings trin giver klinisk relevante stamceller, der kan anvendes til undersøgelser in vitro eller overføres tilbage til klinikken.

En enzym-fri metode til isolering og udvidelse af humane Adipose-afledte mesenchymale stamceller

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Denne protokol giver en enkel omkostningseffektiv måde at isolere ASC'er uden brug af barske enzymer eller centrifugeringstrin, som kan ændre cellefænotypen og adfærden. Manglen på barske trin giver mindre manipulerede celler end dem, der isoleres ved hjælp af enzymer og centrifugering, hvilket minimerer spørgsmål om, hvorvidt eksperimentelle observationer er en artefakt af isolationsmetoden. Denne explant metode kan generere kliniske relevante ASC'er, der skal indføres i en patient til behandling af en række sygdomme eller udvide i livet råd til forskning applikationer.Det er svært at forklare hakkemetoden i ord. Den visuelle demonstration kan tjene andre forskere besværet med at lære at bryde ud af vævet selv. Lignende explant metoder kan bruges til at isolere andre populationer af MSC' er, såsom dem fra navlestrengsvæv.For at hakke abdominoplasty vævsprøver, først overføre vævet til låget af en steril 100 millimeter plade. Brug derefter en steril nål til at holde et stykke væv på plads og bruge en steril skalpel til at skære vævet i mindre end en millimeter stykker. Vævet overføres til et frisk rør, og prøven vendes eller rystes fem til seks gange for at sikre blanding af alle lag.Derefter, med en steril spatel, overføre 2,5 til fem milliliter væv til en 100 millimeter vakuum gasplasma behandlet væv kultur plade. Prøvens volumen måles ved at hælde i et frisk centrifugerør. Dernæst tilsættes et tilsvarende volumen af vævskulturmedier til pladen og svir forsigtigt pladen for at blande indholdet.Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i fem procent kuldioxid, indtil et tilstrækkeligt antal celler ses på bunden af pladen. Når et tilstrækkeligt antal celler er noteret på pladen eller efter syv dage, alt efter hvad der er før, fjerne alle resterende stykker af væv. Dernæst kultur ASC'erne i vævskultur medier, indtil de når 70%sammenløbet, eller indtil klyngerne bliver tætte på hvilket tidspunkt cellerne skal passage.Skyl forsigtigt pladen med 1X fosfat buffered saltvand. For at trypsinize de klæbende celler, aspirere fosfat buffered saltvand, tilsæt en milliliter trypsin suppleret med 0,25% EDTA til hver plade og inkubere ved 37 grader Celsius i fem minutter. Tilføj en lille mængde medier til pladen for at deaktivere trypsin.Derefter forsigtigt pipette mediet trypsin fra toppen af pladen nedad, miste eventuelle svagt fastgjorte celler fra pladen. For at frø cellerne, først tilføje medier til pladen. Derefter tilsættes cellerne i en dråbevis måde og derefter hvirvle pladen for at sikre jævn fordeling på tværs af pladen.Efter tre passager, fortsætte med at flyde cytometri og differentiering assays. Efter tre passager blev det konstateret, at isolerede ASC'er fra lipoaspirat- og maveplastikprøver havde en MSC-morfologi og fænotype, svarende til isolerede ASC'er efter enzymatisk fordøjelse. Ligesom andre MSC'er er de eksplan isolerede ASC'er negative for CD45 og positive for CD73, CD90 og CD105.Ved hakning af vævet skal overfladearealet af hvert stykke være tilstrækkeligt stort til, at ASC'erne kan migrere ud af vævet. Disse er grundlæggende stamceller, der kan bruges til en bred vifte af applikationer. De isolerede ASC'er kan anvendes til alle downstream-programmer, in vivo eller in vitro.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcelletransplantation i en In vitro Simuleret Iskæmi / reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Afledt Cellekultur og isolering af CD133<sup&gt; +</sup&gt; Formodede kræftstamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering af kræft stamceller fra humane Prostata Cancer Prøver

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolering og dyrkning Udvidelse af Tumorspecifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

En forbedret fremgangsmåde til hurtig intubation af trachea i mus

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolering og Cellulær Fænotype af mesenchymal stamceller fra Synovialvæske og knoglemarv af minigrise

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Oprettelse og Transplantation af et fedtholdigt-afledte stamceller (ASC) ark i en diabetisk sårheling Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininduceret Hævelse i Intestinal Organoids: An<em&gt; In vitro</em&gt; Assay for Vurdering Drug respons i patienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...