Denne protokol giver en enkel omkostningseffektiv måde at isolere ASC'er uden brug af barske enzymer eller centrifugeringstrin, som kan ændre cellefænotypen og adfærden. Manglen på barske trin giver mindre manipulerede celler end dem, der isoleres ved hjælp af enzymer og centrifugering, hvilket minimerer spørgsmål om, hvorvidt eksperimentelle observationer er en artefakt af isolationsmetoden. Denne explant metode kan generere kliniske relevante ASC'er, der skal indføres i en patient til behandling af en række sygdomme eller udvide i livet råd til forskning applikationer.
Det er svært at forklare hakkemetoden i ord. Den visuelle demonstration kan tjene andre forskere besværet med at lære at bryde ud af vævet selv. Lignende explant metoder kan bruges til at isolere andre populationer af MSC' er, såsom dem fra navlestrengsvæv.
For at hakke abdominoplasty vævsprøver, først overføre vævet til låget af en steril 100 millimeter plade. Brug derefter en steril nål til at holde et stykke væv på plads og bruge en steril skalpel til at skære vævet i mindre end en millimeter stykker. Vævet overføres til et frisk rør, og prøven vendes eller rystes fem til seks gange for at sikre blanding af alle lag.
Derefter, med en steril spatel, overføre 2,5 til fem milliliter væv til en 100 millimeter vakuum gasplasma behandlet væv kultur plade. Prøvens volumen måles ved at hælde i et frisk centrifugerør. Dernæst tilsættes et tilsvarende volumen af vævskulturmedier til pladen og svir forsigtigt pladen for at blande indholdet.
Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i fem procent kuldioxid, indtil et tilstrækkeligt antal celler ses på bunden af pladen. Når et tilstrækkeligt antal celler er noteret på pladen eller efter syv dage, alt efter hvad der er før, fjerne alle resterende stykker af væv. Dernæst kultur ASC'erne i vævskultur medier, indtil de når 70%sammenløbet, eller indtil klyngerne bliver tætte på hvilket tidspunkt cellerne skal passage.
Skyl forsigtigt pladen med 1X fosfat buffered saltvand. For at trypsinize de klæbende celler, aspirere fosfat buffered saltvand, tilsæt en milliliter trypsin suppleret med 0,25% EDTA til hver plade og inkubere ved 37 grader Celsius i fem minutter. Tilføj en lille mængde medier til pladen for at deaktivere trypsin.
Derefter forsigtigt pipette mediet trypsin fra toppen af pladen nedad, miste eventuelle svagt fastgjorte celler fra pladen. For at frø cellerne, først tilføje medier til pladen. Derefter tilsættes cellerne i en dråbevis måde og derefter hvirvle pladen for at sikre jævn fordeling på tværs af pladen.
Efter tre passager, fortsætte med at flyde cytometri og differentiering assays. Efter tre passager blev det konstateret, at isolerede ASC'er fra lipoaspirat- og maveplastikprøver havde en MSC-morfologi og fænotype, svarende til isolerede ASC'er efter enzymatisk fordøjelse. Ligesom andre MSC'er er de eksplan isolerede ASC'er negative for CD45 og positive for CD73, CD90 og CD105.
Ved hakning af vævet skal overfladearealet af hvert stykke være tilstrækkeligt stort til, at ASC'erne kan migrere ud af vævet. Disse er grundlæggende stamceller, der kan bruges til en bred vifte af applikationer. De isolerede ASC'er kan anvendes til alle downstream-programmer, in vivo eller in vitro.
