Name: an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-12-16T12:00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

De auteurs hebben geen erkenningen

Het gebruik van lipoaspirate en abdominoplastiek monsters is goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van Rutgers University-Newark campus.
1. bereiding van weefselkweek media
<ol><li>Sterilely bereid 500 mL weefselkweek media voor voordat u Asc's isoleert. Om de kweekmedia voor te bereiden, voeg 10% gedefinieerd foetaal kalf serum (FCS) en Penicillaire-streptomycine (10.000 U/100 mL) toe aan Dulbecco's minimale essentiële media (DMEM) met hoge glucose en 2 mM L-glutamine. De media kunnen maximaal 3 weken bij 4 °C worden bewaard en moeten altijd warm worden gebruikt (tussenkamer temperatuur tot 37 °C).<ol>
<li>Als een andere media de voorkeur heeft voor cultuur van de stamcellen, bereidt u die media in plaats daarvan voor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolatie van Asc's van vetweefsel
<ol><li>Verkrijgen van lipoaspiraten of correctie monster (s). Na IRB-goedkeuring, verkrijgen dergelijke monsters als gooi weefsel na verschillende chirurgische procedures. Het vervoer van de lipoaspiraten naar het laboratorium in welk vaartuig de chirurg het weefsel verwijderd; transport correctie samples in een operatiekamer specimen zak of container.</li>
	<li>Bewaar het monster (de monsters) bij kamertemperatuur tot 6 uur of bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur indien niet onmiddellijk verwerkt. Weefselmonsters die na de bovengenoemde tijden worden verwerkt, zullen waarschijnlijk een verminderde celopbrengst hebben. Houd correctie monsters vochtig door toevoeging van 1x steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing.</li>
	<li>Voer vanaf dat moment alle stappen uit in een laminaire stroom afzuigkap onder aseptische omstandigheden. Draag handschoenen voor persoonlijke bescherming. Houd 10% bleekwater, 70% ethanol en papieren handdoeken in de buurt om alle biologisch gemorste stoffen snel schoon te maken. Overtollig weefsel als biomedisch afval afvoeren.</li>
	<li>Steek de monsters in < stukken van 1 mm. Als het abdominoplastiek blok te groot is om mee te werken, snijd dan een beheersbare grootte van het weefsel van het blok af vóór het hakken. Breng het abdominoplastie weefsel over naar het deksel van een steriele 100 mm plaat. Gebruik een steriele naald om een stukje weefsel op zijn plaats te houden en gebruik een steriele scalpel om de stukjes af te snijden door ze te knippen of zachtjes af te scheuren van het bulk weefsel.<ol>
<li>Deze stap is over het algemeen niet nodig voor lipoaspiraten. Echter, als grote weefsel brokken worden waargenomen in de lipoaspirate, verwijder dergelijke stukken met steriele Tang en proces als hierboven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng het weefsel over naar een frisse buis en inverteer of schud het monster 5 – 6 keer om ervoor te zorgen dat alle lagen worden gemengd. Optioneel: als de lipoaspirate volledig is afgewikkeld, verwijder en gooi de olie laag vóór het mengen.</li>
	<li>Overdracht 2.5 – 5 mL van weefsel naar een 100 mm vacuüm-gas plasma behandelde weefselcultuur plaat (tabel van materialen). Meet het volume van het monster door in een nieuwe centrifugebuis te gieten. Gebruik indien nodig een steriele spatel om te helpen bij het overbrengen van het weefsel.</li>
	<li>Voeg een gelijkwaardig volume aan weefselkweek media toe aan de plaat. Zwenk de plaat voorzichtig om de inhoud te mengen.</li>
	<li>Inbroed de Paten bij 37 °C in 5% CO2 tot een voldoende aantal cellen op de basis van de plaat wordt gezien. Na verloop van tijd, zullen de cellen migreren van binnen het weefsel op het oppervlak van de plaat, op welk punt ze zullen zich houden aan het plastic. Als ze het weefsel verlaten, zullen de cellen verschijnen als kleine clusters rond de weefsel stukken.</li>
	<li>Elke 24 h, Verwijder zo veel mogelijk vloeistof en vervang met een vergelijkbare hoeveelheid media. Laat de stukjes weefsel op zijn plaats, indien mogelijk.</li>
	<li>Zodra een voldoende aantal cellen worden genoteerd op de plaat (> 10 clusters van > 15 – 25 cellen op de plaat) of na 7 dagen, afhankelijk van wat eerder is, verwijder alle overgebleven stukjes weefsel.</li>
	<li>Cultuur de asc's in weefselcultuur media totdat ze 70% confluentie bereiken of totdat de clusters worden dichte (> 5 dichte clusters van cellen op de plaat, elk met een diameter van ongeveer > 500 μm), op welk punt de cellen moeten worden gepasseerde.</li>
</ol>3 cultuur van ASCs
<ol><li>Doorgang de Asc's wanneer de bovenliggende plaat ongeveer 70% confluency bereikt. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de ASC-culturen meer dan confluentie hebben.</li>
	<li>Spoel de plaat zachtjes met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing en trypsinoseer de aanhechting cellen. Om de cellen te trypsiniseren, aspireren de fosfaatgebufferde zoutoplossing en voeg 1 mL trypsine met 0,25% EDTA toe aan elke plaat en incuberen bij 37 °C gedurende 5 minuten. Bevestig na 5 minuten de hechting met microscopie. Als de cellen nog steeds aanhandig zijn, retourneer de cellen dan nog 5 minuten naar de incubator.</li>
	<li>Voeg een kleine hoeveelheid media (ongeveer 25% van het totale trypsine-volume) toe aan de plaat om de trypsine te deactiveren en was de basis van de plaat zachtjes met behulp van de media/trypsine. Om de plaat te wassen, houdt u de plaat in een lichte hoek en Pipetteer de media/trypsine voorzichtig van de bovenkant van de plaat naar beneden, waarbij alle wekelijks aangesloten cellen van de plaat losraken. De cellen kunnen worden herverguld met een verhouding van 1:3 of worden geseerd bij een dichtheid van 120000 – 500000 cellen per plaat.<ol>
<li>Als zaaien op basis van het aantal cellen, breng de trypsine/media van de plaat in een conische centrifugebuis, en pellet de cellen door centrifugeren op 300 x g gedurende 7 min. respendeer de cellen in weefselkweek media (ongeveer 1 ml per begin plaat) en Tel de cellen vóór het zaaien. Om de cellen te tellen, breng 10 μL van de celsuspensie over in de hemocytometer en Tel de cellen die aanwezig zijn in het 4 x 4-kwadrant op elke hoek van het rooster. Gemiddelde deze waarden samen en vermenigvuldig de waarde met 104 om het celnummer te berekenen.</li>
		<li>Voeg media toe aan de plaat voordat u de cellen zaaien. Voeg de cellen op een druppelsgewijs manier toe en zwenk vervolgens de plaat om gelijkmatige verdeling over de plaat te garanderen. Opmerking: na 3 passages moeten de aanhandige cellen asymmetrisch en spindel vormig lijken. ASC fenotype en Behavior kunnen worden bevestigd met behulp van Flowcytometrie en differentiatie-testen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bevestiging van ASC fenotype en Behavior met behulp van Flowcytometrie en differentiatie-assays<ol>
<li>Stroom cytometrie<ol>
<li>Verzamel en pellet de cellen zoals hierboven beschreven. Was de gepileerde met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing en label de cellen met de fabrikant aanbevolen volume antilichamen. Een gedetailleerd protocol voor flow cytometrie, een gemeenschappelijke laboratoriumprocedure, vindt u hier12,14,15.</li>
			<li>Selecteer oppervlak markerings panelen van de volgende om de ASC fenotype: Negative voor CD14, CD31, CD34, CD45 en CD106 te bevestigen; en positief voor CD29, CD36, CD44, CD73, CD90, en CD10516,17,18,19. De aanwezigheid van CD36 en afwezigheid van CD106 Asc's uit beenmerg-afgeleide MSCs20.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Differentiatie-assays: Bevestig responsen-differentiatie met behulp van een msc-differentiatie Kit. Kits zijn verkrijgbaar bij meerdere fabrikanten om adipogene, osteogenic en chondrogenic differentiatie capaciteit te bevestigen. Wijzig de door de kit geleverde media elke 3 – 4 dagen volgens de protocollen van de fabrikant gedurende 3 weken of tot de morfologische differentiatie wordt waargenomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultuur de cellen voor meerdere passages; het aantal benodigde passages zal afhangen van de toepassing (en). Bevestig bij elke passage de morfologie en het fenotype van de MSC-cel met behulp van de bovengenoemde celoppervlak markeringen, en zorg ervoor dat de capaciteit van multi Lineage-differentiatie niet verloren is gegaan. Hoewel het uitbreidingspotentieel verschilt van donoren, kunnen de meeste monsters worden uitgebreid voor maximaal 6-9 passages.</li>
	<li>Cryopreserve de cellen en opslaan in vloeibare stikstof voor toekomstig gebruik.</li>
</ol>4 cryopreservering van Asc's
<ol><li>Bereid 10 mL Vries oplossingen A en B voor.<ol>
<li>Voor Vries oplossing A, Voeg 20% FCS toe aan DMEM met hoge glucose.</li>
		<li>Voor Vries oplossing B, Voeg 20% FCS en 20% Dimethylfumaraat sulfide (DMSO) toe aan DMEM met hoge glucose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet de cellen door centrifugeren op 300 x g gedurende 5 min. respendeer de cellen in een klein volume Vries oplossing a en Tel de cellen met behulp van een hemocytometer zoals in stap 3.3.1.</li>
	<li>Bereken het uiteindelijke volume waarin de cellen worden geresuspendeerd om een uiteindelijke celconcentratie van 500000 – 1000000 cellen/mL te bereiken. Gebruik Vries oplossing A om de pellet te hervatten in 50% van dat eindvolume. Voeg langzaam een gelijk volume Vries oplossing B druppelsgewijs toe terwijl de buis wordt opgewonden om de uiteindelijke celconcentratie te bereiken.</li>
	<li>Vries de cellen onmiddellijk in 1 – 2 mL cryoflesjes. Vries de cryoflesjes in een getemperde vriezer of in een Vries bakje geplaatst bij-80 °C, waardoor de temperatuur met 1 °C/min wordt verlaagd. Na de gecontroleerde bevriezing ('s nachts voor een Vries container), de cellen overbrengen naar vloeibare stikstof voor lange termijn opslag.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal/stem+cells+in+drug+therapy:+New+perspective.">Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective.</a> Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).</li><li>Conde-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+Mechanical+Isolation+of+Adipose-derived+Stromal+Vascular+Fraction:+Review+of+Upcoming+Techniques.">Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Hendijani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+An+advantageous+method+for+isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+tissues.">Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues.</a> Cell Proliferation. 50 (2), (2017).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells.">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+a+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+different+methods+of+handling+human+liposuction+aspirate+and+their+effect+on+adipocytes+and+adipose+derived+stem+cells.">In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-Free+Isolation+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).</li><li>Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+effective+strategy+for+the+isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+minimally+manipulated+adipose-derived+stem+cells+for+more+rapid+and+safe+stem+cell+therapy.">A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy.</a> Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discussion+on+adult+mesenchymal+stem+cells+for+drug+delivery:+pros+and+cons.">A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons.</a> Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Barlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+placenta-+and+bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).</li><li>Munoz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feline+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+show+similar+phenotype+and+functions+with+regards+to+neuronal+differentiation+as+human+MSCs.">Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs.</a> Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).</li><li>Amati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+cord+blood:+evaluation+of+in+vitro+quality+parameters+prior+to+clinical+use.">Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14 (2017).</li><li>Bajek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+liposuction+method+influence+the+phenotypic+characteristic+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells.</a> Bioscience Reports. 35 (3), (2015).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Isolation,+Characterization+and+Expansion+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+(ASCs):+An+Overview.">Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).</li><li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal/stem+cells:+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+(IFATS)+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+(ISCT).">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li><li>Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+without+tissue+destruction:+a+non-enzymatic+method.">Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method.</a> Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).</li><li>Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+"Bench+to+Bedside":+Current+Advancement+on+Large-Scale+Production+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">From "Bench to Bedside": Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Asc's zijn een aantrekkelijke bron van MSCs vanwege de gemakkelijke toegang van het weefsel. Voor zowel klinische als onderzoekstoepassingen moeten wetenschappers rekening houden met de variabiliteit van donoren bij het isoleren en kweken van deze cellen. Om redenen die nog moeten worden opgehelderd, vertonen MSCs van verschillende donoren verschillende capaciteiten om in vitro te vermenigvuldigen, wat vervolgens de migratie van de ASC van de vetweefsel-en proliferatie capaciteit zal beïnvloeden. Hoewel de variabiliteit kan worden waargenomen in de tijd die het kost voor de asc's geïsoleerd van deze enzym vrije explantaten om confluentie te bereiken, was het zeldzaam dat een monster niet in vitro zou prolifereren.
Buiten de variabiliteit van de donor, is de meest waarschijnlijke oorzaak van falen van de cellen om te migreren uit het weefsel en/of vermenigvuldigen in vitro is de lengte van de tijd dat het weefsel werd opgeslagen voorafgaand aan de verwerking. Wanneer de monsters vóór de verwerking > 12 uur mochten zitten of niet vochtig werden gehouden tussen de oogst en de verwerking, werden er armere migratie-en proliferatie percentages waargenomen. De enige monsters die vaak niet zijn toegenomen, waren abdominumoplastie monsters die niet vochtig werden gehouden met een zoutoplossing: in deze gevallen was het weefsel in het midden van het weefsel blok vaak vochtig genoeg om te verwerken, maar af en toe moest het worden weggegooid. Het is dus van cruciaal belang om het weefsel vochtig te houden vanaf het moment van de oogst door verwerking.
In gevallen waarin Asc's niet op de plaat bij de 1 week markering worden waargenomen, moeten de vetweefsel explanten nog steeds uit de weefselkweek platen worden verwijderd, opdat er geen weefsel necrose optreedt. Soms zijn er te weinig cellen om gemakkelijk te identificeren, maar die paar cellen zullen in staat zijn om uit te breiden binnen het cultuur systeem. Als de cellen nog steeds niet worden waargenomen na 3 weken, de isolatie moet worden beschouwd als mislukt.
In sommige gevallen, met name bij abdominoplastiek, is het niet mogelijk om een echt aseptisch monster te verkrijgen vanwege de beperkingen binnen de chirurgische Arena. Als het niet mogelijk is om een steriel vat te gebruiken om het weefsel van de operatiekamer naar een laminaire stroom afzuigkap te transporteren, is het in het algemeen voldoende om de buitenste 1 cm van het weefsel te verwijderen om besmetting van micro-organismen te voorkomen. Als het abdominoplastie monster op de huid is bevestigd, kan de huid worden afgeveegd met 70% ethanol om dat oppervlak te steriliseren voordat het vetweefsel wordt gehakt.
Tijdens het gehakt proces is het van cruciaal belang dat het weefsel wordt fijngehakt in kleine, fijne stukjes. Als de explantaten te groot zijn, zal er onvoldoende oppervlakte zijn om de asc's uit het weefsel en op de plaat te migreren. Verder is het van cruciaal belang dat het weefsel niet langer in de plaat blijft dan noodzakelijk opdat het weefsel necrotisch wordt.
Een beperking van deze methode is het gebruik van een enzym (in het beschreven protocol, trypsine) om de Asc's los te maken tijdens het weefselkweek proces. Andere niet-dierlijke afgeleide enzymen, zoals Accutase, kunnen worden vervangen om de noodzaak van dierlijke afgeleide producten te verwijderen, maar dit zal de kosten van de weefselcultuur verhogen. Om deze reden, onder andere, onderzoeken tal van groepen niet-tweedimensionale weefselkweek methoden zoals bioreactoren en steigersystemen om het MSC-groeipotentieel te vergroten, terwijl de noodzaak om de cellen los te maken van hun substraat22wordt geminimaliseerd.
Bij het verplaatsen van Asc's naar de kliniek, een belangrijke beperking van de explant isolatiemethode is het vertrouwen op een goede productie praktijk (GMP) niveau weefselcultuur faciliteit, die veel medische centra ontbreken. In deze gevallen zou een van de zelf ingesloten, in de handel verkrijgbare, op enzymen of centrifugeren gebaseerde methoden moeten worden gebruikt. Echter, naarmate de GMP-faciliteiten vaker voorkomen, zal dit effect naar verwachting beperkt zijn. Ondertussen, zelfs dergelijke faciliteiten ontbreekt GMP weefselcultuur faciliteiten kunnen overwegen het gebruik van de explant methode voor het bestuderen van Asc's in vitro: hoe minder manipulatie, hoe meer Akin deze cellen zijn voor hun in vivo tegenhangers11.
Deze methode biedt een eenvoudige manier om Asc's van vetweefsel te isoleren-zowel lipoaspiraten als abdominoplasties-bij afwezigheid van harde enzymen of centrifugeren stappen. Hoewel de initiële opbrengst van Asc's lager is dan die van andere methoden, zullen de Asc's in vitro toenemen, waardoor het effect van het lagere initiële rendement wordt geminimaliseerd. Het ontbreken van overmatige of krachtige manipulatie maakt Asc's op een zodanige wijze geïsoleerd dat dit bijzonder relevant is, aangezien er minder vragen zijn (d.w.z. of de waargenomen effecten te wijten zijn aan de cellen zelf of aan de manipulatie van de cellen tijdens het isolatie proces ).

Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn een klasse van multipotente volwassen stamcellen die kunnen worden geïsoleerd uit verschillende volwassen en foetale weefsels, met inbegrip van vetweefsel. Deze cellen zijn een aantrekkelijk celtype voor zowel fundamenteel onderzoek en klinische toepassingen als gevolg van hun plasticiteit om te differentiëren in cellen van alle kiem lagen in vitro, kruis allogene barrières, de thuisbasis van gebieden van ontsteking, en ontsteking onderdrukken (beoordeeld in Sherman, et al.1). Vetweefsel-afgeleide MSCS (asc's) zijn bijzonder aantrekkelijk vanwege hun gemak van obtainment, als vetweefsel wordt over het algemeen beschouwd als gooi weefsel na routine liposuctie en abdominoplastie procedures. Eenmaal verkregen worden de monsters echter in het algemeen onderworpen aan zware omstandigheden – ofwel enzymatische toestand ofwel centrifugeren – om de asc's2,3te isoleren. Deze methode illustreert een eenvoudige procedure voor het isoleren van Asc's met behulp van een explant methode, bij afwezigheid van strenge enzymatische of centrifugeren stappen.
De meest voorkomende methode van het isoleren van asc's bestaat uit het wassen van een vetweefsel, enzymatisch verteren van het monster met collagenase, centrifugeren van het monster, en ten slotte lyseren de rode bloedcellen voorafgaand aan het kweken van de ascs4. Hoewel het efficiënt is om een hoge opbrengst van asc's te isoleren, wordt het gebruik van xenogene componenten (bijv. enzymatische spijsvertering met collagenase) meer dan "minimaal gemanipuleerd" door de Amerikaanse Food and Drug Administration beschouwd en kan het Risico's zoals immuunreactie inhouden, waarbij het gebruik van de cellen in de kliniek5,6wordt verboden. Om de Risico's van xenogene componenten te minimaliseren, hebben veel groepen niet-dierlijke afgeleide, gefabriceerde enzymen voorgesteld om het vetweefsel te verteren. Echter, deze enzymen zijn nog steeds hard, en kan de cel fenotype7veranderen.
Andere methoden voor het isoleren van asc's zijn hogesnelheidcentrifugeren, waarbij de krachten zo hoog zijn als 1.200 x gen grondig om de asc's8te isoleren. Zelfs de krachten zo laag als 400 x g waren voldoende in het isoleren van levensvatbare asc's9. Terwijl deze cellen produceren een grote hoeveelheid levensvatbare cellen, veel protocollen niet te vermenigvuldigen na 14 dagen8. Verder levert mechanische isolatie minder herstelde cellen op dan enzymatische spijsvertering, maar een hoger percentage geïsoleerde cellen was Asc's in vergelijking met andere cellen endogene tot vetweefsel bij passage 010.
De isolatie van een zuiverder, meer levensvatbare populatie van Asc's in minder tijd, in combinatie met de kosten en Risico's van xenogene componenten, maakt enzymatische vertering minder en minder aantrekkelijk voor vertaling naar de kliniek. Hoewel mechanische isolatie in eerste instantie een gunstige aanpak is, is er een aanzienlijke ongelijkheid in de gebruikte methoden, en het volume van het verwerkte weefsel is beperkt tot de grootte van de gespecialiseerde centrifugale eenheden, en kan afhankelijk zijn van de consistentie van de operator2.
Hoewel zowel de enzymatische spijsvertering als de centrifugeren snel een hoog volume ASCs opleveren, vertonen deze geïsoleerde cellen fenotypische veranderingen, wat vragen over hun gedrag oplevert wanneer ze terugkeren naar een patiënt2. Een op explant gebaseerde methode van ASC isolation, zoals beschreven in dit protocol, wordt dus in dienst genomen door sommige groepen, waarbij de Asc's migreren uit kleine stukjes van massief vetweefsel3,11,12. Deze migratie is waarschijnlijk een effect van de cellen die worden aangetrokken tot de voedingsrijke media. Net als andere populaties van MSCs, ASCs hechten aan plastic, en overleven en vermenigvuldigen in de gebruikte weefselcultuur media (componenten hieronder), waardoor hun isolatie van de andere celtypen uit het vetweefsel. Hoewel er in eerste instantie minder cellen worden hersteld — vaak nemen > 1 week totdat cellen zichtbaar zijn op de weefselkweek plaat — zullen deze ongemanipuleerde asc's in vitro toenemen, waardoor de cellen kunnen worden uitgebreid naar klinisch relevante volumes11,12,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3003 tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>serum is batch tested to ensure it supports MSC growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells

Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn een populatie van Multipotente cellen die geïsoleerd kunnen worden van diverse volwassen en foetale weefsels, waaronder vetweefsel. Als klinisch relevant celtype zijn optimale methoden nodig om deze cellen in vitro te isoleren en uit te breiden. De meeste methoden voor het isoleren van vetweefsel-afgeleide MSCS (adscs) vertrouwen op harde enzymen, zoals Collagenase, om het vetweefsel te verteren. Echter, terwijl effectief in het afbreken van het vetweefsel en het opleveren van een hoge ADSC herstel, deze enzymen zijn duur en kunnen schadelijk effect hebben op de ADSCs — met inbegrip van de Risico's van het gebruik van xenogene componenten in klinische toepassingen. Dit protocol Details een methode om te isoleren van adscs van verse lipoaspirate en correctie monsters zonder enzymen. Kort, deze methode is afhankelijk van de mechanische loskoppelen van een bulk weefsel gevolgd door een explant-type cultuur systeem. De ADSCs mogen uit weefsel en op de weefselkweek plaat migreren, waarna de ADSCs kunnen worden gekweekt en in vitro worden uitgebreid voor een willekeurig aantal onderzoeks-en/of klinische toepassingen.

Met behulp van de hier beschreven methode werden asc's met succes geïsoleerd uit lipoaspirate en correctie samples (Figuur 1). Na drie passages bleken de geïsoleerde cellen een MSC-morfologie (asymmetrisch, spindel vorm) en fenotype te hebben, vergelijkbaar met Asc's na enzymatische spijsvertering (Figuur 2). Eerdere studies van onze groep en anderen hebben aangetoond deze asc's te differentiëren in adipocytes, osteocyten, en neuronen zoals andere MSCS, met inbegrip van ascs geïsoleerd door andere middelen11,21.
In de meeste gevallen, ASCs migratie naar de weefselcultuur plaat kan worden gevisualiseerd binnen 3 – 5 dagen door heldere veld microscopie. In sommige gevallen zijn echter alleen verspreide cellen zichtbaar na 7 dagen. In zeldzame gevallen zullen de cellen niet migreren naar de plaat en/of zal niet vermenigvuldigen tot de derde passage. Deze uitkomst correleert in het algemeen met een vertraging in de verwerking van het weefselmonster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig1.jpg"> Figuur 1: schematische weergave van ASC-isolatie van abdominumoplastie en lipoaspirate monsters. Abdominoplasty en lipoaspirate monsters werden verkregen als gooi weefsel na routine chirurgische ingrepen. Abdominumoplastie monsters werden versnipperd, waarna ofwel correctie of lipoaspirate monsters werden verguld als explantaten in weefselkweek media. De Asc's gemigreerd uit het weefsel, naar de nutriëntrijke media. Na 1 week werden de explantaten verwijderd en asc's gekweekt voor downstreamexperimenten en/of klinische toepassingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig1alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig2.jpg"> Figuur 2: geïsoleerde Asc's met een msc morfologie en fenotype. Asc's geïsoleerd door de enzym vrije, explant methode hebben een MSC morfologie en fenotype bij passage 3. A) net als andere MSCS hebben deze asc's een asymmetrische, spil vorm, ongeacht of deze geïsoleerd is door een explant of een enzymatische methode (bijv. Collagenase). De Asc's die met behulp van de enzym methode zijn geïsoleerd, leveren een langere, smallere morfologie op ten opzichte van de uit de explant geïsoleerde Asc's; de laatste dichter lijken op MSCs afgeleid van andere enzym-vrije isolatie methoden, zoals beenmerg afgeleide-MSCs.B) net als andere MSCS zijn de uit de explant geïsoleerde asc's negatief voor CD45 en positief voor CD73, CD90 en CD105. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig2alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Dit protocol biedt een enzym vrije methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit correctie-en lipoaspirate-monsters met behulp van een explant methode. De afwezigheid van harde enzymen of centrifugeer stappen voorziet in klinisch relevante stamcellen die kunnen worden gebruikt voor studies in vitro of teruggeplaatst naar de kliniek.

Een enzym vrije methode voor isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen van menselijke adipeus

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Dit protocol biedt een eenvoudige kosteneffectieve manier om ASC's te isoleren zonder het gebruik van agressieve enzymen of centrifugatiestappen, die het fenotype en gedrag van de cel kunnen veranderen. Het ontbreken van harde stappen levert minder gemanipuleerde cellen op dan die geïsoleerd met behulp van enzymen en centrifugatie, waardoor de vraag wordt geminimaliseerd of experimentele waarnemingen een artefact van de isolatiemethode zijn. Deze explant methode kan genereren klinisch relevante ASCs worden ingevoerd in een patiënt om een verscheidenheid van ziekten te behandelen of uit te breiden in het leven veroorloven onderzoekstoepassingen.Het is moeilijk om de mesmethode in woorden volledig uit te leggen. De visuele demonstratie kan dienen andere wetenschappers het gedoe van het leren uit elkaar te breken het weefsel zelf. Soortgelijke explant methoden kunnen worden gebruikt om andere populaties van MSCs te isoleren, zoals die van navelstrengweefsels.Om de abdominoplastie weefselmonsters gehakt, breng het weefsel eerst over naar het deksel van een steriele 100 millimeter plaat. Gebruik dan een steriele naald om een stuk weefsel op zijn plaats te houden en gebruik een steriele scalpel om het weefsel in minder dan een millimeter stukken te snijden. Breng het weefsel naar een verse buis en omkeren of schud het monster vijf tot zes keer om het mengen van alle lagen te garanderen.Breng vervolgens, met een steriele spatel, 2,5 tot vijf milliliter weefsel over naar een 100 millimeter vacuümgasplasma behandelde weefselkweekplaat. Meet het volume van het monster door in een verse centrifugebuis te gieten. Voeg vervolgens een gelijkwaardig volume weefselkweekmedia toe aan de plaat en draai de plaat voorzichtig om de inhoud te mengen.Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in vijf procent kooldioxide totdat een voldoende aantal cellen worden gezien op de basis van de plaat. Zodra een voldoende aantal cellen zijn opgemerkt op de plaat of na zeven dagen, afhankelijk van wat eerder is, verwijder alle resterende stukken weefsel. Vervolgens cultuur de ASC's in weefsel cultuur media totdat ze bereiken 70%-samenvloeiing of totdat de clusters dicht worden op welk punt de cellen moeten worden doorgevloeid.Spoel de plaat voorzichtig af met 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing. Om de aanhangende cellen te trypsinize, de fosfaatgebufferde zoutoplossing aan te trekken, voeg een milliliter trypsine toe aangevuld met 0,25%EDTA aan elke plaat en broed gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius. Voeg een kleine hoeveelheid media toe aan de plaat om de trypsine te deactiveren.Dan voorzichtig pipette de media trypsin vanaf de bovenkant van de plaat naar beneden, het verliezen van een zwak bevestigde cellen van de plaat. Om de cellen te zaaien, voegt u eerst media toe aan de plaat. Voeg vervolgens de cellen op een druppelwijze toe en draai de plaat om een gelijkmatige verdeling over de plaat te garanderen.Na drie passages, ga naar cytometrie en differentiatie testen stromen. Na drie passages bleken geïsoleerde ASC's van lipoaspiraat- en abdominoplastiemonsters een MSC-morfologie en fenotype te hebben, vergelijkbaar met geïsoleerde ASC's na een enzymatische spijsvertering. Net als andere MSCs, de explant geïsoleerde ASC's zijn negatief voor CD45 en positief voor CD73, CD90, en CD105.Bij het afsgehakt van het weefsel moet de oppervlakte van elk stuk voldoende groot zijn om de ASC's uit het weefsel te laten migreren. Dit zijn fundamentele stamcellen die kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan toepassingen. De geïsoleerde ASC's kunnen worden gebruikt voor elke downstream toepassing, in vivo of in vitro.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolatie van kanker stamcellen uit menselijke stalen van prostaatkanker

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolatie en Cultuur Uitbreiding van Tumor-specifieke endotheelcellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Een verbeterde werkwijze voor snelle intubatie van de trachea in muizen

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolatie en Cellulaire fenotypering van mesenchymale stamcellen afkomstig van de gewrichtsvloeistof en beenmerg van minivarkens

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creatie en transplantatie van een blad van de stamcel adipeus afkomstige (ASC) in een diabetische wondgenezing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay voor het beoordelen van de Drug Response in patiënten met cystische fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...