Dit protocol biedt een eenvoudige kosteneffectieve manier om ASC's te isoleren zonder het gebruik van agressieve enzymen of centrifugatiestappen, die het fenotype en gedrag van de cel kunnen veranderen. Het ontbreken van harde stappen levert minder gemanipuleerde cellen op dan die geïsoleerd met behulp van enzymen en centrifugatie, waardoor de vraag wordt geminimaliseerd of experimentele waarnemingen een artefact van de isolatiemethode zijn. Deze explant methode kan genereren klinisch relevante ASCs worden ingevoerd in een patiënt om een verscheidenheid van ziekten te behandelen of uit te breiden in het leven veroorloven onderzoekstoepassingen.
Het is moeilijk om de mesmethode in woorden volledig uit te leggen. De visuele demonstratie kan dienen andere wetenschappers het gedoe van het leren uit elkaar te breken het weefsel zelf. Soortgelijke explant methoden kunnen worden gebruikt om andere populaties van MSCs te isoleren, zoals die van navelstrengweefsels.
Om de abdominoplastie weefselmonsters gehakt, breng het weefsel eerst over naar het deksel van een steriele 100 millimeter plaat. Gebruik dan een steriele naald om een stuk weefsel op zijn plaats te houden en gebruik een steriele scalpel om het weefsel in minder dan een millimeter stukken te snijden. Breng het weefsel naar een verse buis en omkeren of schud het monster vijf tot zes keer om het mengen van alle lagen te garanderen.
Breng vervolgens, met een steriele spatel, 2,5 tot vijf milliliter weefsel over naar een 100 millimeter vacuümgasplasma behandelde weefselkweekplaat. Meet het volume van het monster door in een verse centrifugebuis te gieten. Voeg vervolgens een gelijkwaardig volume weefselkweekmedia toe aan de plaat en draai de plaat voorzichtig om de inhoud te mengen.
Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in vijf procent kooldioxide totdat een voldoende aantal cellen worden gezien op de basis van de plaat. Zodra een voldoende aantal cellen zijn opgemerkt op de plaat of na zeven dagen, afhankelijk van wat eerder is, verwijder alle resterende stukken weefsel. Vervolgens cultuur de ASC's in weefsel cultuur media totdat ze bereiken 70%-samenvloeiing of totdat de clusters dicht worden op welk punt de cellen moeten worden doorgevloeid.
Spoel de plaat voorzichtig af met 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing. Om de aanhangende cellen te trypsinize, de fosfaatgebufferde zoutoplossing aan te trekken, voeg een milliliter trypsine toe aangevuld met 0,25%EDTA aan elke plaat en broed gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius. Voeg een kleine hoeveelheid media toe aan de plaat om de trypsine te deactiveren.
Dan voorzichtig pipette de media trypsin vanaf de bovenkant van de plaat naar beneden, het verliezen van een zwak bevestigde cellen van de plaat. Om de cellen te zaaien, voegt u eerst media toe aan de plaat. Voeg vervolgens de cellen op een druppelwijze toe en draai de plaat om een gelijkmatige verdeling over de plaat te garanderen.
Na drie passages, ga naar cytometrie en differentiatie testen stromen. Na drie passages bleken geïsoleerde ASC's van lipoaspiraat- en abdominoplastiemonsters een MSC-morfologie en fenotype te hebben, vergelijkbaar met geïsoleerde ASC's na een enzymatische spijsvertering. Net als andere MSCs, de explant geïsoleerde ASC's zijn negatief voor CD45 en positief voor CD73, CD90, en CD105.
Bij het afsgehakt van het weefsel moet de oppervlakte van elk stuk voldoende groot zijn om de ASC's uit het weefsel te laten migreren. Dit zijn fundamentele stamcellen die kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan toepassingen. De geïsoleerde ASC's kunnen worden gebruikt voor elke downstream toepassing, in vivo of in vitro.
