Name: an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-12-16T12:00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

למחברים אין תודות

השימוש בדגימות ניתוח מתיחת בטן ובניתוח שטרם אושרה על-ידי לוח הסקירה המוסדי (IRB) של אוניברסיטת רטגרס-קמפוס ניוארק.
1. הכנת מדיה לתרבות רקמות
<ol><li>Sterilely להכין 500 mL של מדיה תרבות רקמות לפני בידוד ASCs. כדי להכין את התקשורת התרבותית, להוסיף 10% סרום עגל העוברי (FCS) ו-פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/100 mL) למדיה חיוניים מינימלית של Dulbecco (DMEM) עם גלוקוז גבוה 2 מ"מ L-גלוטמין. התקשורת יכולה להיות מאוחסנת ב-4 ° צ' עד 3 שבועות, ויש להשתמש בה תמיד חם (בין טמפרטורת החדר עד 37 ° c).<ol>
<li>אם מדיה אחרת מועדפת לתרבות של תאי הגזע, הכינו במקום זאת את המדיה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. בידוד של הפקולטה לרקמה מאדיפוז
<ol><li>השג ליפופה או דגימת מתיחת בטן. לאחר אישור IRB, לקבל דגימות כאלה כמו למחוק רקמות בעקבות הליכים כירורגיים שונים. העברת הליחות למעבדה בכלי הניתוח שהמנתח הסיר את הרקמה; מתיחת בטן בחדר ניתוח או במיכל.</li>
	<li>אחסן את המדגם (ים) בטמפרטורת החדר עבור עד 6 מעלות צלזיוס או ב-4 ° צ' עד 24 שעות אם לא מעבדים באופן מיידי. דגימות רקמות מעובדות מעבר למועדים הנ ל צפוי להיות התשואה התאים פחתה. שמרו דגימות מתיחת בטן לחות על-ידי תוספת תמיסת מלח באגירה סטרילית מבית 1x.</li>
	<li>מנקודה זו ואילך, המשך את כל הצעדים בתוך כיסוי הזרימה המבינארי בתנאים אספטי. לבש כפפות להגנה אישית. לשמור על 10% אקונומיקה, 70% אתנול, ומגבות נייר סמוך כדי לנקות במהירות כל דליפת ביולוגי. נפטר מרקמה עודפת. כפסולת ביו-רפואית</li>
	<li>האוהב את הדגימות לתוך < חתיכות 1 מ"מ. אם בלוק ניתוח הבטן גדול מכדי לעבוד עם, לחתוך גודל של רקמות להיות מחוץ לבלוק לפני המינסינג. העבר את רקמת מתיחת הבטן למכסה של צלחת 100 מ"מ סטרילית. השתמש מחט סטרילית להחזיק פיסת הרקמה במקום ולהשתמש אזמל סטרילי כדי לחזק את החלקים על ידי חיתוך או בעדינות גריסה של רקמות בצובר.<ol>
<li>שלב זה אינו נדרש בדרך כלל עבור ליפופי. עם זאת, אם נתחי רקמות גדולים הם נצפו בתוך ליפוף, להסיר חתיכות כאלה עם מלקחיים סטרילי תהליך כמו לעיל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את הרקמה לצינור טרי להפוך או לנער את המדגם 5 – 6 פעמים כדי להבטיח ערבוב של כל השכבות. אופציונלי: אם ליפוף התיישבו במלואו, להסיר ולמחוק את שכבת הנפט לפני ערבוב.</li>
	<li>העברה 2.5 – 5 מ ל של רקמות לצלחת העיבוד פלזמה של 100 mm גז ואקום (טבלת חומרים). למדוד את נפח המדגם על ידי לשפוך לתוך צינור צנטריפוגה טרי. אם יש צורך, השתמשו במרית סטרילית כדי לסייע בהעברת הרקמה.</li>
	<li>הוסף נפח שווה ערך של מדיית תרבות הרקמה לצלחת. מערבולת בעדינות את הצלחת לערבב את התוכן.</li>
	<li>מודקת את פאטה ב 37 ° צ' ב 5% CO2 עד מספר מספיק של תאים נראים על בסיס הצלחת. עם הזמן, התאים יועברו מתוך הרקמה על פני השטח צלחת, ובנקודה זו הם לדבוק פלסטיק. כאשר הם יוצאים הרקמה, התאים יופיעו כאשכולות קטנים סביב חתיכות הרקמה.</li>
	<li>כל 24 שעות, להסיר כמה שיותר נוזלי ולהחליף עם כמות דומה של מדיה. השאירו את פיסות הרקמה במקום, אם אפשר.</li>
	<li>לאחר מספר מספיק של תאים מצוין על הצלחת (> 10 אשכולות של > 15 – 25 תאים על הצלחת) או לאחר 7 ימים, לפי מוקדם יותר, להסיר את כל החלקים הנותרים של רקמות.</li>
	<li>התרבות ASCs במדיה התרבות רקמות עד שהם מגיעים 70% השטף או עד האשכולות להיות צפוף (> 5 אשכולות צפופים של תאים על הלוח, כל אחד עם קוטר של כ > 500 μm), ובשלב זה התאים הם להיות החוצה.</li>
</ol>3 התרבות של ASCs
<ol><li>העבר את ה-ASCs כאשר לוחית ההורה מגיע כ 70% שליטה. שמור על עצמך להימנע משטף של התרבויות עולה.</li>
	<li>שטפו בעדינות את הצלחת עם מלוחים באגירה של 1 x פוספט וטריזיציזציה לתאים החסיד. לטריזיסיזציה של התאים, מוחלק את תמיסת המלח באגירה ומוסיפה 1 מ ל טריפסין עם 0.25% EDTA לכל צלחת ו מודרת ב 37 ° c עבור 5 דקות. לאחר 5 דקות, אשרו הדבקות במיקרוסקופיה. אם התאים עדיין מחסיד, להחזיר את התאים לחממה עבור 5 דקות נוספות.</li>
	<li>הוסיפו כמות קטנה של מדיה (כ -25% מכמות הטריפסין הכוללת) לצלחת לבטל את הטריפסין, ולשטוף בעדינות את בסיס הצלחת באמצעות המדיה/טריפסין. כדי לשטוף את הצלחת, החזיקו את הצלחת בזווית קלה ומצנקת בעדינות את המדיה/טריפסין מראש הלוחית כלפי מטה, ומתרופפות כל תא שבועי מהצלחת. התאים יכולים להיות מצופה מחדש ביחס 1:3 או הנזרע בצפיפות של 120000 – 500000 תאים לכל צלחת.<ol>
<li>אם זריעה מבוסס על ספירת תאים, להעביר את טריפסין/מדיה מן הצלחת לתוך צינור צנטריפוגה חרוט, ואת הגלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 7 דקות. להשעות את התאים במדיה של תרבות רקמות (כ 1 מ"ל לכל לוחית הראשונית) ולספור את התאים לפני זריעה. כדי לספור את התאים, להעביר 10 μL של ההשעיה התא לתוך ה, ולספור את התאים הנמצאים 4 x 4 הרביע בכל פינה של הרשת. ממוצע ערכים אלה יחד והכפל את הערך ב-104 כדי לחשב את מספר התא.</li>
		<li>הוסף מדיה ללוח לפני זריעת התאים. להוסיף את התאים באופן dropwise ולאחר מכן מערבולת את הצלחת כדי להבטיח הפצה אפילו על פני הצלחת. הערה: לאחר 3 מעברים, התאים החסיד אמורים להופיע א-סימטרי וצורת ציר. פנוטיפ עולה והתנהגות ניתן לאשר באמצעות הזרמת cy, לנסות בידול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אישור של פנוטיפ והתנהגות באמצעות הזרמת cy, ובידול מוסר<ol>
<li>ציטומטלי זרימה<ol>
<li>איסוף והגלולה התאים כמתואר לעיל. לשטוף את הפלטד עם מלוחים 1x פוספט באגירה ולתייג את התאים עם מומלץ ליצרן כרכים של נוגדן. פרוטוקול מפורט להזרמת cy, הליך מעבדה נפוץ, ניתן למצוא כאן12,14,15.</li>
			<li>בחר לוחות סמן משטח מתוך הפעולות הבאות כדי לאשר את הפנוטיפ עולה: שלילי עבור CD14, CD31, CD34, CD45 וCD106; וחיובי לCD29, CD36, CD44, CD73, CD90 ו-CD10516,17,18,19. הנוכחות של CD36 והיעדרות של CD106 להבחין ASCs מ מח עצם-נגזר MSCs20.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בידול אספאומר: לאשר בידול רב שושלת באמצעות ערכת בידול MSC. ערכות זמינים מיצרנים מרובים כדי לאשר אדיפוגניים, אוסטגניים, כונדרוגניים קיבולת הבידול. לשנות את ערכת המדיה סיפק כל 3 – 4 ימים לפי הפרוטוקולים של היצרן עבור 3 שבועות או עד מורפולוגית הבידול הוא נצפתה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מתרבות תאים למעברים מרובים; מספר המעברים הדרושים יהיה תלוי ביישום (ים). בכל מעבר, לאשר את מורפולוגיה התא MSC ופנוטיפ באמצעות סמני פני השטח התא הנ ל, ולהבטיח קיבולת בידול רב השושלת לא אבדו. בעוד הפוטנציאל ההתרחבות שונה בין תורמים, רוב הדגימות ניתן להרחיב עד 6-9 מעברים.</li>
	<li>קריופלקס התאים ולאחסן בחנקן נוזלי לשימוש עתידי.</li>
</ol>4 הקריוגנית של ASCs
<ol><li>הכינו 10 מ ל של פתרונות הקפאה A ו-B.<ol>
<li>עבור פתרון הקפאה A, להוסיף 20% FCS כדי DMEM זיכרון עם גלוקוז גבוה.</li>
		<li>עבור פתרון הקפאה B, להוסיף 20% FCS ו 20% diמתיל גופרתי (DMSO) ל-DMEM זיכרון עם גלוקוז גבוה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>גלולה התאים על ידי תפרידו ב 300 x g עבור 5 דקות. השהה מחדש את התאים בנפח קטן של פתרון הקפאה a ולספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר כמו בשלב 3.3.1.</li>
	<li>חשב את אמצעי האחסון הסופי שבהם התאים יהיו מושעים מחדש כדי להגיע לריכוז התא הסופי של 500000 – 1000000 תאים/mL. השתמש בפתרון הקפאה A כדי להשעות מחדש את הגלולה ב 50% של הכרך הסופי. הוסיפו באיטיות את הנפח השווה של פתרון ההקפאה B בזמן שהוא מתחשל בצינור כדי להגיע לריכוז התא הסופי.</li>
	<li>הקפא מיד את התאים ב-1-2 מ ל קריובקבוקונים. הקפא את הקריובקבוקונים במקפיא בקצב מבוקר או במיכל קפוא הממוקם ב-80 ° c, המקטין את הטמפרטורה ב-1 ° c/min. בעקבות ההקפאה מבוקרת (לילה עבור מכולה קופא), להעביר את התאים חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal/stem+cells+in+drug+therapy:+New+perspective.">Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective.</a> Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).</li><li>Conde-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+Mechanical+Isolation+of+Adipose-derived+Stromal+Vascular+Fraction:+Review+of+Upcoming+Techniques.">Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Hendijani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+An+advantageous+method+for+isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+tissues.">Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues.</a> Cell Proliferation. 50 (2), (2017).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells.">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+a+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+different+methods+of+handling+human+liposuction+aspirate+and+their+effect+on+adipocytes+and+adipose+derived+stem+cells.">In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-Free+Isolation+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).</li><li>Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+effective+strategy+for+the+isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+minimally+manipulated+adipose-derived+stem+cells+for+more+rapid+and+safe+stem+cell+therapy.">A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy.</a> Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discussion+on+adult+mesenchymal+stem+cells+for+drug+delivery:+pros+and+cons.">A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons.</a> Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Barlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+placenta-+and+bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).</li><li>Munoz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feline+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+show+similar+phenotype+and+functions+with+regards+to+neuronal+differentiation+as+human+MSCs.">Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs.</a> Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).</li><li>Amati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+cord+blood:+evaluation+of+in+vitro+quality+parameters+prior+to+clinical+use.">Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14 (2017).</li><li>Bajek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+liposuction+method+influence+the+phenotypic+characteristic+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells.</a> Bioscience Reports. 35 (3), (2015).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Isolation,+Characterization+and+Expansion+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+(ASCs):+An+Overview.">Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).</li><li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal/stem+cells:+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+(IFATS)+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+(ISCT).">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li><li>Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+without+tissue+destruction:+a+non-enzymatic+method.">Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method.</a> Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).</li><li>Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+"Bench+to+Bedside":+Current+Advancement+on+Large-Scale+Production+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">From "Bench to Bedside": Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף

ASCs הם מקור אטרקטיבי של MSCs בשל גישה קלה של הרקמה. עבור יישומים קליניים ומחקר הן, מדענים חייבים לשאת השתנות תורמים המוח כאשר בידוד ו culturing תאים אלה. מטעמים שטרם הובהר, MSCs מתורמים שונים מציגים יכולות שונות להתרבות בתוך מבחנה, אשר ישפיעו לאחר מכן על הגירה של עולה מתוך היכולת לחקור ולהפצה. בעוד השונות יכולה להיות נצפתה בזמן שלוקח את ה-ASCs מבודדים מן האלה האנזים נטול אנזימים כדי להגיע לשטף, זה היה נדיר למדגם לא להתרבות בתוך מבחנה.
מעבר לשונות התורמים, המקור הסביר ביותר של כישלון התאים לנדוד מתוך הרקמה ו/או ההתרבות בתוך מבחנה הוא משך הזמן שבו הרקמה היתה מאוחסנת לפני העיבוד. כאשר הורשו לשבת במשך > 12 שנים לפני העיבוד או לא הוחזקו לחות בין קציר ועיבוד, הגירה עניים ושיעורי התפשטות נצפו. הדגימות היחידות, כי לעתים קרובות נכשל להתרבות היו מתיחת בטן דגימות שלא נשמרו לח עם פתרון מלוחים: במקרים אלה, הרקמה במרכז בלוק הרקמה היה לעתים קרובות לח מספיק כדי לעבד, אבל היה צורך להיפטר מדי פעם. זה קריטי ולכן כדי לשמור על הרקמה לחות מזמן הקציר באמצעות עיבוד.
במקרים שבהם החברה לא נצפתה על הצלחת בסימן השבוע 1, הצמחים האדיפוז עדיין צריכים להיות מוסרים מלוחות התרבית של הרקמה שמא נמק ברקמות. לפעמים יש מעט מדי תאים כדי לזהות בקלות, אבל אלה תאים מעטים יהיה מסוגל להרחיב בתוך מערכת התרבות. אם התאים עדיין אינם מצופים בשלושה שבועות, יש להחשיב את הבידוד ככשל.
במקרים מסוימים, במיוחד של ניתוח מתיחת בטן, לא ניתן להשיג דגימת אספטי באמת בשל המגבלות בתוך הזירה הכירורגית. אם לא ניתן להשתמש בכלי סטרילי כדי להעביר את הרקמה מחדר הניתוח למכסה זרם למינארי, הסרת החיצוני 1 ס מ של הרקמה הוא בדרך כלל מספיק כדי למנוע זיהום מיקרואורגניזם. אם דגימת ניתוח מתיחת הבטן מחוברת לעור, ניתן לנגב את העור באמצעות 70% אתנול כדי לעקר את פני השטח לפני שהיא מתחמנת את רקמת השומן.
במהלך תהליך מועט, זה קריטי כי הרקמה היא כתוש לחתיכות קטנות, בסדר. אם האקסוצמחים גדולים מדי, לא יהיה שטח המשטח מספיק עבור ASCs לנדוד מתוך הרקמה על הצלחת. יתר על כן, הוא קריטי כי הרקמה אינה נשארת בצלחת יותר מאשר הכרחי שמא הרקמה הופכת נמק.
הגבלה של שיטה זו היא השימוש באנזים (בפרוטוקול המתואר, טריפסין) כדי לנתק את ה-ASCs במהלך תהליך תרבות הרקמה. לעומת זאת, ניתן להחליף את האנזימים שאינם בעלי החיים הנגזרים, כגון האקומאז, כדי להסיר את הצורך במוצרים שמקורם בבעלי חיים, ואולם, זה יגדיל את העלות של תרבות הרקמה. מסיבה זו, בין היתר, קבוצות רבות בודקים שיטות שאינן ממדיות לתרבות הרקמה הדו, כגון ביוריאקטורים ומערכות מבוססות פיגום להגברת פוטנציאל הצמיחה של MSC תוך מזעור הצורך לנתק את התאים מהמצע שלהם22.
בעת העברת ASCs למרפאה, מגבלה מרכזית של שיטת בידוד ההסבר היא ההסתמכות על מתקן הייצור הטוב של הרקמה ברמה (GMP), אשר מרכזים רפואיים רבים חסרים. במקרים אלה, כל אחת מהשיטות הקיימות בתחום המסחרי הזמין באופן מסחרי או צנטריפוגה, תצטרך להיות מועסק. עם זאת, כאשר מתקני GMP נעשים נפוצים יותר, אפקט זה צפוי להיות מוגבל. בינתיים, אפילו מתקנים כאלה חסר מתקני התרבות של רקמת GMP יכול לשקול שימוש בשיטת ההסבר לחקר ASCs ב מבחנה: המניפולציות פחות, יותר תאים אלה הם להיות שלהם vivo עמיתיהם11.
שיטה זו מספקת דרך פשוטה לבידוד של מחשבי ה-i cs מרקמת אדיפוז-הן ליפוחות ומתיחת בטן-בהעדר אנזימים קשים או צעדים צנטריפוגה. בעוד שהתשואה הראשונית של ASCs נמוכה מזו של שיטות אחרות, ה-ASCs מתרבים בתוך מבחנה, מזעור ההשפעה של התשואה הראשונית הנמוכה. העדר מניפולציה מוגזמת או בעלת עוצמה גורמת לבידוד מבודד באופן הרלוונטי במיוחד, שכן יש פחות שאלות (כלומר, האם ההשפעות המובחנות הן בשל התאים עצמם או לטיפול בתאים במהלך תהליך הבידוד ).

תאי גזע של mesenchymal (MSCs) הם מחלקה של תאי גזע בוגרים רב-עוצמה, הניתנים לבידוד מרקמות מבוגרות ועוברי שונות, לרבות מרקמת אדיפוז. תאים אלה הם סוג תא אטרקטיבי הן מחקר בסיסי יישומים קליניים בשל הפלסטיות שלהם כדי להבדיל לתאים של כל שכבות הנבט בתחום החוץ, מחסומים האלוגנאית הצלב, הבית לאזורים של דלקת, ולדכא דלקת (נבדקו בשרמן, ואח '1). אדיפוז-נגזר MSCs (ASCs) הם מושכים במיוחד בשל קלות הבידור שלהם, כמו רקמת האדיפוז נחשב בדרך כלל רקמת המחיקה בעקבות שאיבת שומן שגרתית וניתוח מתיחת בטן. עם זאת, לאחר שהושג, הדגימות הן בדרך כלל בתנאים קשים – או במצב אנזימטי או צנטריפוגה-כדי לבודד את ה-ascs2,3. שיטה זו ממחישה הליך פשוט לבידוד של ASCs באמצעות שיטת הבדיקה, בהיעדר שלבים אנזימטיים או צנטריפוגה קשים.
השיטה השכיחה ביותר לבידוד ASCs כוללת שטיפת מדגם אדיפוז, לעכל את המדגם עם הקולגן, לתפרידו את המדגם, ולבסוף לשיר את תאי הדם האדומים לפני הקריאה של ASCs4. בעוד שהוא יעיל בבידוד תשואה גבוהה של ascs, השימוש ברכיבים xenog (למשל, העיכול האנזימטי עם הקולגן) נחשב ליותר מאשר "מניפולציות מינימלית" על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני, ועלול להוות סיכונים כגון תגובה חיסונית, האוסר על שימוש בתאים במרפאה5,6. כדי למזער את הסיכונים של הרכיבים הקסנוגנניים, קבוצות רבות הציעו שאינן בעלי חיים נגזרות, ומייצרים אנזימים כדי לעכל את הרקמה האדיגית. עם זאת, אנזימים אלה עדיין קשים, והוא יכול לשנות את התא פנוטיפ7.
שיטות אחרות של בידוד ASCs כוללות צנטריפוגה במהירות גבוהה, באמצעות כוחות גבוה כמו 1,200 x g, ו vortexing כדי לבודד את ascs8. אפילו כוחות נמוך כמו 400 x g היו מספיקים בבידוד בעלי קיימא9. בעוד תאים אלה מייצרים כמות גדולה של תאים קיימא, פרוטוקולים רבים לא הצליחו להתרבות מעבר 14 ימים8. עוד, בידוד מכני מניב תאים פחות משוחזרים מאשר עיכול אנזימטי, אך חלק גבוה יותר של תאים מבודדים היו ASCs לעומת תאים אחרים אנדוגניים לרקמת האדיפוז במעבר 010.
בידוד של אוכלוסייה טהורה ומעשית יותר של ASCs בפחות זמן, ביחד עם העלות והסיכונים של רכיבים xenoic, הופך את העיכול האנזימטי פחות ופחות מושך לתרגום למרפאה. בעוד בידוד מכני היא בתחילה גישה חיובית, יש פער משמעותי בשיטות המשמשות, ואת נפח הרקמה מעובד מוגבל לגודל של יחידות צנטריפוגלי המקצועית, והוא יכול להיות תלוי עקביות מפעיל2.
בעוד העיכול האנזימטי והצנטריפוגה מפיקות במהירות נפח גבוה של ASCs, התאים הבודדים האלה מציגים שינויים פנוטיתיים, מניבים שאלות על התנהגותם כאשר הם חוזרים למטופל2. השיטה המבוססת על הדרך לבידוד עולה, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, מועסק על-ידי חלק מהקבוצות, ולפיה הארגון יוצא מפיסות קטנות של רקמת אדיפוז מוצקה3,11,12. הגירה זו עשויה להיות השפעה של התאים הנמשכים למדיה העשירה התזונתיים. כמו אוכלוסיות אחרות של MSCs, ASCs לדבוק פלסטיק, ולשרוד ולהתרבות בתוך מדיה תרבותית רקמה משומשים (רכיבים להלן), המתיר הבידוד שלהם משאר סוגי התא מן הרקמה האדיפוז. בעוד תאים פחות הם התאושש בתחילה-לעתים קרובות לוקח > 1 שבוע עד התאים גלויים על הלוח התרבות רקמה-מניפולציות אלה ascs יהיה להתרבות בתוך מבחנה, המתיר התרחבות של התאים לכרכים רלוונטיים קלינית11,12,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3003 tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>serum is batch tested to ensure it supports MSC growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells

תאי גזע של mesenchymal (MSCs) הם אוכלוסיה של תאים רב-עוצמה שניתן לבודד מרקמות מבוגרים ועוברי שונות, כולל רקמת אדיפוז. כסוג תא רלוונטי קלינית, יש צורך בשיטות אופטימליות כדי לבודד ולהרחיב תאים אלה בתוך מבחנה. רוב השיטות לבידוד MSCs נגזרות (ADSCs) מסתמכות על אנזימים קשים, כגון קולגן, כדי לעכל את הרקמה האדיפוז. עם זאת, בעוד יעיל בפירוק רקמת האדיפוז ומניב שחזור ADSC גבוה, אנזימים אלה הם יקרים יכול להיות השפעה מזיקה על ADSCs-כולל את הסיכונים של שימוש ברכיבים xenoic ביישומים קליניים. פרוטוקול זה מפרט שיטה לבידוד ADSCs מדגימות מחדש ומתיחת בטן ללא אנזימים. בקצרה, שיטה זו נשענת על פירוק מכני של כל רקמת בתפזורת ואחריו מערכת תרבות סוג הסבר. ADSCs מותר לנדוד מתוך הרקמה אל צלחת תרבות הרקמה, לאחר מכן ADSCs יכול להיות תרבותי והתרחב בתחום החוץ עבור כל מספר של מחקר ו/או יישומים קליניים.

באמצעות השיטה המפורטת כאן, ASCs מבודדים בהצלחה מדגימות ליפוף ומתיחת בטן (איור 1). לאחר שלושה מעברים, נמצאו התאים המבודדים הינם בעלי מורפולוגיה של MSC (א-סימטרי, צורת ציר) ופנוטיפ, בדומה למצב של מעקב אחר העיכול האנזימטי (איור 2). מחקרים קודמים של הקבוצה שלנו ואחרים הראו ascs אלה להבדיל לתוך אדיפוציטים, אוסטאופציטים, ונוירונים כמו MSCs אחרים, כולל ascs מבודדים על ידי אמצעים אחרים11,21.
ברוב המקרים, הגירה ASCs על צלחת תרבות הרקמה יכול להיות דמיינו בתוך 3-5 ימים על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר. עם זאת, במקרים מסוימים, רק תאים דלילים יהיו גלויים לאחר 7 ימים. במקרים נדירים, התאים לא יועברו אל הצלחת ו/או לא להתרבות עד המעבר השלישי. תוצאה זו מהווה בדרך כלל הקשר עם עיכוב בעיבוד דגימת הרקמה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig1.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של בידוד באמצעות מתיחת בטן ודגימת ליפוף. מתיחת בטן ודגימות ליפוחות הושגו כרקמה מחיקת הליכים כירורגיים שגרתיים. ניתוח מתיחת בטן היתה מגורעת, ולאחר מכן או מתיחת בטן או ליפוף הדגימות היו מצופה כאקסוצמחים במדיה של תרבות הרקמה. ה-ASCs היגרו מתוך הרקמה, לכיוון התקשורת העשירה התזונתיים. לאחר 1 שבוע, explants הוסרו ו ASCs תרבותי עבור ניסויים במורד הזרם ו/או יישום קליני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig1alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig2.jpg"> איור 2: ASCs מבודדים עם מורפולוגיה MSC ופנוטיפים. ASCs בודד על ידי שיטת ההסבר ללא אנזים, יש מורפולוגיה ופנוטיפים במעבר 3. (א) כמו MSCs אחרים, בעלי מדעי הבית הללו הינם בעלי צורת ציר א-סימטרית, בין אם מבודדים בשיטת ההסבר או האנזימטית (למשל, קולגנאז). ה-ASCs המבודד באמצעות שיטת האנזים מהניב מורפולוגיה ארוכה וצרה יותר לעומת ה-ASCs המבודד; השני קרוב יותר דומה MSCs נגזר שיטות אחרות בידוד נטול אנזימים, כגון מח עצם נגזר-MSCs. (ב) כמו MSCs אחרים, ascs מבודדים מבודדת הם שליליים עבור CD45 וחיובי עבור CD73, CD90, ו CD105. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig2alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

פרוטוקול זה מספק שיטה נטולת אנזימים לבידוד תאי גזע mesenchymal מ מתיחת בטן ודגימות ליפוף באמצעות שיטת החקור. העדר אנזימים קשים או צעדים צנטריפוגה מספק תאי גזע רלוונטיים קלינית שניתן להשתמש בהם למחקרים בתוך מבחנה או להעביר חזרה למרפאה.

שיטה נטולת אנזימים לבידוד והתרחבות של אדיפוז האנושית-תאי גזע נגזרים

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

פרוטוקול זה מספק דרך חסכונית פשוטה לבודד ASCs ללא שימוש באנזימים קשים או שלבי צנטריפוגה, אשר יכול לשנות את פנוטיפ התא והתנהגות. היעדר צעדים קשים מניב תאים פחות מניפולציות מאלה המבודדים באמצעות אנזימים וצנטריפוגות, ומצמצם את השאלות האם תצפיות ניסיוניות הן חפץ בשיטת הבידוד. שיטת explant זו יכולה ליצור ASCs רלוונטיים קליניים להיות הציג לתוך המטופל לטיפול במגוון רחב של מחלות או להרחיב בחיים להרשות לעצמם יישומי מחקר.קשה להסביר את שיטת הטחון במילים. ההדגמה החזותית יכולה לשרת מדענים אחרים את הטרחה של למידה לפרק את הרקמה עצמם. ניתן להשתמש בשיטות הסבר דומות כדי לבודד אוכלוסיות אחרות של MSCs, כגון אלה מרקמות טבור.כדי לטחון את דגימות רקמת abdominoplasty, ראשית להעביר את הרקמה למכסה של צלחת סטרילית 100 מילימטר. לאחר מכן השתמש במחט סטרילית כדי להחזיק חתיכת רקמה במקום ולהשתמש אזמל סטרילי לחתוך את הרקמה לחתיכות פחות ממילימטר אחד. מעבירים את הרקמה לצינור טרי ומנערים או מנערים את הדגימה חמש עד שש פעמים כדי להבטיח ערבוב של כל השכבות.לאחר מכן, עם מרית סטרילית, להעביר 2.5 עד חמישה מיליליטר של רקמה ל 100 מילימטר גז ואקום פלזמה מטופלים צלחת רקמות. למדוד את נפח המדגם על ידי שפיכת לתוך צינור צנטריפוגה טרי. לאחר מכן, להוסיף נפח שווה ערך של מדיה תרבות רקמות לצלחת בעדינות מערבל את הצלחת כדי לערבב את התוכן.הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוזים פחמן דו חמצני עד מספר מספיק של תאים נראים על בסיס הצלחת. לאחר מספר מספיק של תאים הם ציינו על הצלחת או לאחר שבעה ימים, המוקדם מביניהם, להסיר את כל החלקים הנותרים של רקמה. לאחר מכן, תרבו את ה- ASCs במדיה של תרבות הרקמות עד שהם מגיעים ל- 70%confluency או עד שהאשכולות יהפכו צפופים ובנקודה זו יש לעבור בין התאים.יש לשטוף בעדינות את הצלחת עם תמיסת מלח 1X פוספט. כדי לנסות את התאים חסידים, שאפו את מלוחים מאגר פוספט, להוסיף מיליליטר אחד של טריפסין בתוספת 0.25% EDTA לכל צלחת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הוסף כמות קטנה של מדיה לצלחת כדי לבטל את הפעלת טריפסין.ואז בעדינות pipette טריפסין התקשורת מהחלק העליון של הצלחת כלפי מטה, אוותר על כל התאים המחוברים חלש מהצלחת. כדי לזרוע את התאים, הוסף תחילה מדיה לצלחת. לאחר מכן, מוסיפים את התאים בצורה dropwise ולאחר מכן מערבלים את הצלחת כדי להבטיח חלוקה שווה על פני הצלחת.לאחר שלושה קטעים, המשיכו לזרום ציטומטריה ומסיונות התברואה. לאחר שלושה קטעים, ASCs מבודדים מדגימות lipoaspirate ו abdominoplasty נמצאו יש מורפולוגיה MSC פנוטיפ, בדומה ASCs מבודדים בעקבות עיכול אנזימטי. בדומה ל- MSCs אחרים, מחשבי ה- ASCs המבודדים של explant שליליים עבור CD45 וחיוביים עבור CD73, CD90 ו- CD105.בעת טחון הרקמה, שטח הפנים של כל חתיכה חייב להיות גדול מספיק עבור ASCs לנדוד מתוך הרקמה. אלה הם תאי גזע בסיסיים שניתן להשתמש בהם עבור מגוון רחב של יישומים. ניתן להשתמש ב- ASCs המבודדים עבור כל יישום במורד הזרם, ב- vivo או במבחנה.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

שיטה משופרת עבור אינטובציה מהירה של קנה הנשימה של עכברים

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

בידוד נייד phenotyping של בתאי גזע mesenchymal נגזר הסינוביאלי נוזל מח עצם של Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

יצירת והשתלות של גיליון נגזר שומן בתאי גזע (ASC) במודל של ריפוי פצע סוכרתי

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...