Name: an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-12-16T12:00:00
Duration: 4 min 37 s
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लेखकों को कोई पावती नहीं है

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	<li>Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal/stem+cells+in+drug+therapy:+New+perspective.">Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective.</a> Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).</li><li>Conde-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+Mechanical+Isolation+of+Adipose-derived+Stromal+Vascular+Fraction:+Review+of+Upcoming+Techniques.">Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Hendijani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+An+advantageous+method+for+isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+tissues.">Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues.</a> Cell Proliferation. 50 (2), (2017).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells.">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+a+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+different+methods+of+handling+human+liposuction+aspirate+and+their+effect+on+adipocytes+and+adipose+derived+stem+cells.">In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-Free+Isolation+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).</li><li>Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+effective+strategy+for+the+isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+minimally+manipulated+adipose-derived+stem+cells+for+more+rapid+and+safe+stem+cell+therapy.">A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy.</a> Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discussion+on+adult+mesenchymal+stem+cells+for+drug+delivery:+pros+and+cons.">A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons.</a> Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Barlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+placenta-+and+bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).</li><li>Munoz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feline+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+show+similar+phenotype+and+functions+with+regards+to+neuronal+differentiation+as+human+MSCs.">Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs.</a> Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).</li><li>Amati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+cord+blood:+evaluation+of+in+vitro+quality+parameters+prior+to+clinical+use.">Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14 (2017).</li><li>Bajek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+liposuction+method+influence+the+phenotypic+characteristic+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells.</a> Bioscience Reports. 35 (3), (2015).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Isolation,+Characterization+and+Expansion+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+(ASCs):+An+Overview.">Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).</li><li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal/stem+cells:+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+(IFATS)+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+(ISCT).">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li><li>Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+without+tissue+destruction:+a+non-enzymatic+method.">Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method.</a> Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).</li><li>Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+"Bench+to+Bedside":+Current+Advancement+on+Large-Scale+Production+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">From "Bench to Bedside": Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

एएससी ऊतक की आसान पहुंच के कारण एमएससी का एक आकर्षक स्रोत है। दोनों नैदानिक और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए, वैज्ञानिकों को ध्यान में दाता परिवर्तनशीलता सहन करना चाहिए जब अलग और इन कोशिकाओं को सफ़र । कारणों के लिए अभी तक स्पष्ट नहीं किया जाना है, विभिन्न दानदाताओं से MSCs विभिन्न क्षमताओं को दिखाने के लिए विट्रो में पैदा, जो बाद में एडीज एक्सप्लांट और प्रसार क्षमता से बाहर ASC के प्रवास को प्रभावित करेगा । जबकि परिवर्तनशीलता इन एंजाइम मुक्त explants से अलग ASCs के लिए लेता है में देखा जा सकता है संक्षेप तक पहुंचने के लिए, यह एक नमूना के लिए दुर्लभ था विट्रो में पैदा नहीं है ।
दाता परिवर्तनशीलता से परे, कोशिकाओं की विफलता का सबसे अधिक संभावना स्रोत ऊतक से बाहर प्रवास और/या विट्रो में पैदा समय की लंबाई है कि ऊतक प्रसंस्करण से पहले संग्रहीत किया गया था । जब नमूनों को प्रसंस्करण से पहले >12 h के लिए बैठने की अनुमति दी गई थी या कटाई और प्रसंस्करण के बीच नम नहीं रखा गया था, तो गरीब प्रवास और प्रसार दरों को देखा गया था । केवल नमूने जो अक्सर पैदा करने में विफल रहते थे, वे एडोमिनोप्लास्टी नमूने थे जिन्हें खारे समाधान के साथ नम नहीं रखा गया था: इन मामलों में, ऊतक ब्लॉक के केंद्र में ऊतक अक्सर प्रक्रिया करने के लिए पर्याप्त नम था, लेकिन कभी-कभी त्यागने की आवश्यकता होती थी। इस प्रकार प्रसंस्करण के माध्यम से फसल के समय से ऊतक को नम रखना महत्वपूर्ण है।
ऐसे मामलों में जहां एएससी 1 सप्ताह के निशान पर प्लेट पर नहीं देखे जाते हैं, एडिपोज एक्सप्लांट्स को अभी भी ऊतक संस्कृति प्लेटों से हटा दिया जाना चाहिए ऐसा न हो कि ऊतक परिगलन हो। कई बार आसानी से पहचानकरने के लिए बहुत कम कोशिकाएं होती हैं, लेकिन वे कुछ कोशिकाएं संस्कृति प्रणाली के भीतर विस्तार करने में सक्षम होंगी । यदि कोशिकाओं को अभी भी 3 सप्ताह में नहीं मनाया जाता है, तो अलगाव को विफल माना जाना चाहिए।
कुछ मामलों में, विशेष रूप से एडोमिनोप्लास्टी के, शल्य चिकित्सा क्षेत्र के भीतर सीमाओं के कारण वास्तव में असेप्टिक नमूना प्राप्त करना संभव नहीं है। यदि ऑपरेटिंग रूम से ऊतक को लेमिनार प्रवाह हुड तक ले जाने के लिए बाँझ पोत का उपयोग करना संभव नहीं है, तो ऊतक के बाहरी 1 सेमी को हटाना आम तौर पर सूक्ष्मजीव संदूषण को रोकने के लिए पर्याप्त है। यदि एडोमिनोप्लास्टी नमूना त्वचा से जुड़ा हुआ है, तो त्वचा को एडीपोज ऊतक की माँग करने से पहले उस सतह को स्टरलाइज करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ मिटाया जा सकता है।
कीमा बनाने की प्रक्रिया के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि ऊतक छोटे, ठीक टुकड़ों में कीमा बनाया हुआ है। यदि एक्सप्लांट बहुत बड़े हैं, तो एएससी के लिए ऊतक से बाहर और प्लेट पर माइग्रेट करने के लिए अपर्याप्त सतह क्षेत्र होगा। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि ऊतक प्लेट में आवश्यक से अधिक समय तक नहीं रहता है ऐसा न हो कि ऊतक परिगलित हो जाएं।
इस विधि की एक सीमा ऊतक संस्कृति प्रक्रिया के दौरान एएससी को अलग करने के लिए एंजाइम (वर्णित प्रोटोकॉल, ट्रिप्सिन में) का उपयोग है। पशु व्युत्पन्न उत्पादों की आवश्यकता को दूर करने के लिए अन्य गैर-पशु व्युत्पन्न एंजाइमों, जैसे कि एक्यूटेस को प्रतिस्थापित किया जा सकता है, हालांकि, इससे ऊतक संस्कृति की लागत में वृद्धि होगी। इस कारण से, दूसरों के अलावा, कई समूह एमएससी विकास क्षमता बढ़ाने के लिए गैर-दो आयामी ऊतक संस्कृति विधियों की जांच कर रहे हैं, जबकि कोशिकाओं को उनके सब्सट्रेट22से अलग करने की आवश्यकता को कम कर रहे हैं।
जब क्लिनिक के लिए ASCs चलती है, एक्सप्लांट अलगाव विधि की एक प्रमुख सीमा एक अच्छा विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) स्तर ऊतक संस्कृति सुविधा है, जो कई चिकित्सा केंद्रों की कमी पर निर्भरता है । इन मामलों में, किसी भी स्व-संलग्न वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एंजाइम-या केंद्रीकरण आधारित तरीकों को नियोजित करने की आवश्यकता होगी । हालांकि, जीएमपी सुविधाएं अधिक प्रचलित हो जाती हैं, इसलिए यह प्रभाव सीमित होने की उम्मीद है। इस बीच, जीएमपी ऊतक संस्कृति सुविधाओं की कमी वाली ऐसी सुविधाएं भी विट्रो में एएससी का अध्ययन करने के लिए एक्सप्लांट विधि का उपयोग करने पर विचार कर सकती हैं: कम हेरफेर, इन कोशिकाओं के समान उनके वीवो समकक्षों11में हैं।
कठोर एंजाइमों या केंद्रीकरण चरणों के अभाव में यह विधि एएससी को एडीपोस ऊतक से अलग करने का एक सरल तरीका प्रदान करती है - लिपोएपाइरेट्स और एडोमिनोप्लास्टी दोनों। जबकि एएससी की प्रारंभिक उपज अन्य तरीकों की तुलना में कम है, एएससी विट्रो में पैदा होगी, जिससे कम प्रारंभिक उपज के प्रभाव को कम किया जा सकेगा। अत्यधिक या सशक्त हेरफेर की कमी ASCs इस तरह के एक तरह से विशेष रूप से प्रासंगिक में अलग बनाता है, क्योंकि वहां कम सवाल कर रहे है (यानी, कि क्या मनाया प्रभाव कोशिकाओं को खुद को या अलगाव की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं के हेरफेर के कारण कर रहे है ).

मेसेनचिमल स्टेम सेल (एमएससी) बहुशक्तिशाली वयस्क स्टेम कोशिकाओं का एक वर्ग है जिसे विभिन्न वयस्क और भ्रूण ऊतकों से अलग किया जा सकता है, जिसमें एडीपोस ऊतक शामिल हैं। ये कोशिकाएं दोनों बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक आकर्षक सेल प्रकार के लिए अपनी प्लास्टिसिटी के कारण विट्रो में सभी रोगाणु परतों की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए, एलोजेनिक बाधाओं को पार, सूजन के क्षेत्रों के लिए घर, और सूजन को दबाने (शेरमेन, एट अल1में समीक्षा की) । एडीपोज-व्युत्पन्न एमएससी (एएससी) विशेष रूप से प्राप्त करने में आसानी के कारण अपील कर रहे हैं, क्योंकि एडीपोस ऊतक को आम तौर पर नियमित लिपोसक्शन और एडोमिनोप्लास्टी प्रक्रियाओं के बाद ऊतक को त्यागने माना जाता है। हालांकि, एक बार प्राप्त होने के बाद, नमूनों को आम तौर पर कठोर परिस्थितियों के अधीन किया जाता है - या तो एंजाइमैटिक स्थिति या केंद्रीकरण - एएससी2,3को अलग करने के लिए। यह विधि कठोर एंजाइमैटिक या सेंट्रलाइज्ड चरणों की अनुपस्थिति में एक्सप्लांट विधि का उपयोग करके एएससी को अलग करने के लिए एक सरल प्रक्रिया दिखाती है।
एएससी को अलग-थलग करने की सबसे आम विधि में एक एडिपोस नमूना धोना, नमूना कोलेजेनेस के साथ नमूना को पचाने, नमूने को केंद्रित करना, और अंत में एएससी4को अलग करने से पहले लाल रक्त कोशिकाओं को लाइजन करना शामिल है। जबकि ASCs की एक उच्च उपज को अलग करने में कुशल, विद्वेष घटकों के उपयोग (जैसे, कोलेजेनेज़ के साथ एंजाइमैमेटिक पाचन) से अधिक माना जाता है "ंयूनतम हेरफेर" अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा, और इस तरह के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में जोखिम पैदा कर सकते हैं, क्लिनिक5,6में कोशिकाओं के उपयोग पर रोक । ज़ेनोजेनिक घटकों के जोखिमों को कम करने के लिए, कई समूहों ने गैर-पशु व्युत्पन्न, निर्मित एंजाइमों को एडीपोस ऊतक को पचाने का सुझाव दिया है। हालांकि, ये एंजाइम अभी भी कठोर हैं, और सेल फेनोटाइप7को बदल सकते हैं।
एएससी को अलग-थलग करने के अन्य तरीकों में उच्च गति से केंद्रीकरण, 1,200 x ग्रामके रूप में उच्च बलों का उपयोग करना और एएससी8को अलग-थलग करने के लिए भंवर शामिल है। यहां तक कि 400 x ग्राम के रूप में कम के रूप में बलों व्यवहार्य ASCs9अलग करने में पर्याप्त थे । हालांकि ये कोशिकाएं बड़ी मात्रा में व्यवहार्य कोशिकाओं का उत्पादन करती हैं, लेकिन कई प्रोटोकॉल 14 दिनों8से अधिक पैदा करने में विफल रहे । इसके अलावा, यांत्रिक अलगाव एंजाइमैटिक पाचन की तुलना में कम बरामद कोशिकाओं की पैदावार करता है, लेकिन अलग-थलग कोशिकाओं का एक उच्च अनुपात एएससी था, जबकि अन्य कोशिकाएं 010के मार्ग पर ऊतक को कम करने के लिए एंडोजेनियस थीं।
कम समय में एएससी की एक शुद्ध, अधिक व्यवहार्य आबादी का अलगाव, ज़ेनोजेनिक घटकों की लागत और जोखिमों के साथ मिलकर, एंजाइमैटिक पाचन को कम और क्लिनिक में अनुवाद के लिए कम आकर्षक बनाता है। जबकि यांत्रिक अलगाव शुरू में एक अनुकूल दृष्टिकोण है, उपयोग किए जाने वाले तरीकों में महत्वपूर्ण असमानता है, और संसाधित ऊतक की मात्रा विशेष अपकेंद्रित्र इकाइयों के आकार तक सीमित है, और ऑपरेटर स्थिरता2पर निर्भर हो सकती है।
जबकि एंजाइमैटिक पाचन और केंद्रीकरण दोनों जल्दी से एएससी की उच्च मात्रा देते हैं, ये अलग-थलग कोशिकाएं फेनोटाइपिक परिवर्तन दिखाती हैं, जब एक रोगी2में लौटने पर उनके व्यवहार के बारे में सवाल उठते हैं। एएससी अलगाव की एक एक्सप्लांट-आधारित विधि, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, इस प्रकार कुछ समूहों द्वारा नियोजित किया जा रहा है, जिससे एएससी ठोस एडीपोस ऊतक3,11,12के छोटे टुकड़ों से बाहर निकल ते हैं। इस प्रवास की संभावना कोशिकाओं का एक प्रभाव है पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया के लिए तैयार किया जा रहा है । एमएससी की अन्य आबादी की तरह, एएससी प्लास्टिक का पालन करते हैं, और उपयोग किए गए ऊतक संस्कृति मीडिया (नीचे घटकों) में जीवित और पैदा होते हैं, जो एडीपोस ऊतक से अन्य कोशिका प्रकारों से उनके अलगाव की अनुमति देते हैं। जबकि शुरू में कम कोशिकाएं बरामद की जाती हैं - अक्सर ऊतक संस्कृति प्लेट पर कोशिकाएं दिखाई न दें - ये अनछेड़छाड़ एएससी विट्रो में पैदा होंगे, कोशिकाओं को चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मात्रा में विस्तारित करने की अनुमति देंगे11,12,13।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3003 tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>serum is batch tested to ensure it supports MSC growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells

मेसेनचिमल स्टेम सेल (एमएससी) बहुशक्तिशाली कोशिकाओं की आबादी है जिसे विभिन्न वयस्क और भ्रूण ऊतकों से अलग किया जा सकता है, जिसमें एडीपोस ऊतक शामिल हैं। एक चिकित्सकीय प्रासंगिक सेल प्रकार के रूप में, इन कोशिकाओं को विट्रो में अलग-थलग और विस्तारित करने के लिए इष्टतम तरीकों की आवश्यकता होती है। एडीपोज-व्युत्पन्न एमएससी (एडीएससी) को अलग करने के अधिकांश तरीके एडीपोज ऊतक को पचाने के लिए कोलेजेनेस जैसे कठोर एंजाइमों पर भरोसा करते हैं। हालांकि, जबकि नीचे एडीपोज ऊतक को तोड़ने और एक उच्च ADSC वसूली उपज पर प्रभावी, इन एंजाइमों महंगे है और एडीएससी पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है-नैदानिक अनुप्रयोगों में xenogeneic घटकों का उपयोग करने के जोखिम भी शामिल है । यह प्रोटोकॉल एंजाइमों के बिना ताजा लिपोएस्पिरेट और एडोमिनोप्लास्टी नमूनों से एडीएससी को अलग करने की विधि का विवरण देता है। संक्षेप में, यह विधि किसी भी थोक ऊतक के यांत्रिक असंबद्धता पर निर्भर करती है जिसके बाद एक एक्सप्लांट-प्रकार की संस्कृति प्रणाली होती है। एडीएससी को ऊतक से बाहर और ऊतक संस्कृति प्लेट पर स्थानांतरित करने की अनुमति है, जिसके बाद एडीएससी को अनुसंधान और/या नैदानिक अनुप्रयोगों की संख्या के लिए विट्रो में सुसंस्कृत और विस्तारित किया जा सकता है ।

यहां विस्तृत विधि का उपयोग करते हुए, एएससी को सफलतापूर्वक लिपोएस्पिरेट और एडोमिनोप्लास्टी नमूनों(चित्रा 1)से अलग किया गया था। तीन मार्गों के बाद, अलग कोशिकाओं में एमएससी आकृति विज्ञान (विषम, धुरी आकार) और फेनोटाइप पाया गया, जो एंजाइमैटिक पाचन(चित्रा 2)के बाद एएससी के समान है। हमारे समूह और अन्य लोगों के पूर्व अध्ययनों ने इन एएससी को अन्यसाधनों 11,21द्वारा अलग एएससी सहित अन्य एमएससी जैसे आदिपोसाइट्स, ऑस्टियोसाइट्स और न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए दिखाया है।
ज्यादातर मामलों में, ऊतक संस्कृति प्लेट पर एएससी माइग्रेशन उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा 3-5 दिनों के भीतर कल्पना की जा सकती है। हालांकि, कुछ मामलों में, 7 दिनों के बाद केवल विरल कोशिकाएं दिखाई देंगी। दुर्लभ मामलों में, कोशिकाओं को थाली पर प्रवास नहीं होगा और/ यह परिणाम आम तौर पर ऊतक नमूने को संसाधित करने में देरी के साथ संबंधित होता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig1.jpg"> चित्रा 1: एएससी अलगाव का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एडोमिनोप्लास्टी और लिपोएस्पिरेट नमूनों से। नियमित शल्य प्रक्रियाओं के बाद त्यागऊतक ऊतक के रूप में एब्डोमिनोप्लास्टी और लिपोएस्पिरेट नमूने प्राप्त किए गए थे। एडोमिनोप्लास्टी के नमूनों को कटा हुआ था, जिसके बाद या तो एब्डोमिनोप्लास्टी या लिपोएस्पिरेट नमूने ऊतक संस्कृति मीडिया में एक्सप्लांट के रूप में चढ़ाया गया था। एएससी ऊतक से बाहर चले गए, पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया की ओर । 1 सप्ताह के बाद, एक्सप्लांट्स को हटा दिया गया और एएससी को डाउनस्ट्रीम प्रयोग और/या नैदानिक आवेदन के लिए सुसंस्कृत किया गया । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig1alarge.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig2.jpg"> चित्रा 2: एमएससी आकृति विज्ञान और फेनोटाइप के साथ अलग एएससी। एंजाइम मुक्त, एक्सप्लांट विधि से अलग एएससी में एक एमएससी आकृति विज्ञान और मार्ग 3 पर फेनोटाइप होता है। (क)अन्य एमएससी की तरह, इन एएससी में एक विषम, धुरी आकार होता है, चाहे वह एक्सप्लांट या एंजाइमेटिक विधि (जैसे, कोलेजेनेज) से अलग हो। एंजाइम विधि का उपयोग करअलग एएससी एक्सप्लांट अलग एएससी की तुलना में एक लंबी, संकरी आकृति विज्ञान उपज; बाद के करीब अन्य एंजाइम मुक्त अलगाव विधियों से प्राप्त एमएससी के समान है, जैसे बोन मैरो व्युत्पन्न-MSCs ।(B)अन्य एमएससी की तरह, एक्सप्लांट अलग एएससी CD45 के लिए नकारात्मक और CD73, CD90 और CD105 के लिए सकारात्मक हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig2alarge.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

यह प्रोटोकॉल एक एक्सप्लांट विधि का उपयोग करके एडोमिनोप्लास्टी और लिपोएस्पिरेट नमूनों से मेसेनचिमल स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक एंजाइम-मुक्त विधि प्रदान करता है। कठोर एंजाइमों या केंद्रीकरण चरणों की अनुपस्थिति चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रदान करती है जिनका उपयोग विट्रो में अध्ययन के लिए किया जा सकता है या क्लिनिक में वापस स्थानांतरित किया जा सकता है।

मानव Adipose-व्युत्पन्न मेसेनचिमल स्टेम सेल के अलगाव और विस्तार के लिए एक एंजाइम मुक्त विधि

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

यह प्रोटोकॉल कठोर एंजाइमों या अपकेंद्रित्र चरणों के उपयोग के बिना एएससी को अलग करने का एक सरल लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है, जो सेल फेनोटाइप और व्यवहार को बदल सकता है। कठोर कदमों की कमी एंजाइमों और अपकेंद्रित्र का उपयोग कर अलग उन लोगों की तुलना में कम हेरफेर कोशिकाओं पैदावार, के रूप में सवालों को कम करने के लिए कि क्या प्रयोगात्मक टिप्पणियों अलगाव विधि का एक विरूपण साक्ष्य हैं । यह एक्सप्लांट विधि विभिन्न प्रकार की बीमारियों के इलाज या जीवन में विस्तार करने के लिए एक रोगी में पेश किए जाने वाले नैदानिक प्रासंगिक एएससी उत्पन्न कर सकती है।शब्दों में कीमा विधि को पूर्ण रूप से समझाना मुश्किल है। दृश्य प्रदर्शन अन्य वैज्ञानिकों को अलग ऊतक खुद को तोड़ने के लिए सीखने की परेशानियों की सेवा कर सकते हैं । इसी तरह के एक्सप्लांट तरीकों का उपयोग एमएससी की अन्य आबादी को अलग करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि गर्भनाल ऊतकों से।एब्डोमिनोप्लास्टी ऊतक नमूनों को कीमा बनाने के लिए, पहले ऊतक को बाँझ 100 मिलीमीटर प्लेट के ढक्कन में स्थानांतरित करें। फिर एक बाँझ सुई का उपयोग करने के लिए जगह में ऊतक का एक टुकड़ा पकड़ और एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करने के लिए एक मिलीमीटर से भी कम टुकड़ों में ऊतक काट । ऊतक को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और उलटा करें या सभी परतों के मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए नमूना पांच से छह बार हिलाएं।फिर, एक बाँझ स्पैटुला के साथ, 2.5 से पांच मिलीलीटर ऊतक को 100 मिलीमीटर वैक्यूम गैस प्लाज्मा उपचारित ऊतक संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें। एक ताजा अपकेंद्रित्र ट्यूब में डालने से नमूने की मात्रा को मापें। इसके बाद, प्लेट में ऊतक संस्कृति मीडिया की एक समकक्ष मात्रा जोड़ें और सामग्री को मिलाने के लिए धीरे-धीरे प्लेट को घूमता है।थाली के आधार पर पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को देखे जाने तक पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड में ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें । एक बार प्लेट पर या सात दिनों के बाद पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को नोट किया जाता है, जो भी जल्दी हो, ऊतक के शेष सभी टुकड़ों को हटा दें। इसके बाद, ऊतक संस्कृति मीडिया में ASCs संस्कृति जब तक वे ७०% उदारता तक पहुंचने या जब तक समूहों घने हो जाते है जिस बिंदु पर कोशिकाओं को पारित किया जाना है ।धीरे-धीरे 1X फॉस्फेट बफर नमकीन के साथ थाली कुल्ला। अनुयायी कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करने के लिए, फॉस्फेट बफर खारा को बढ़ाएं, प्रत्येक प्लेट में 0.25% ईडीटीए के साथ पूरक ट्राइप्सिन का एक मिलीलीटर जोड़ें और पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए प्लेट में थोड़ी मात्रा में मीडिया जोड़ें।फिर धीरे से प्लेट के ऊपर से मीडिया ट्रिपसिन को नीचे की ओर पिपेट करें, प्लेट से किसी भी कमजोर संलग्न कोशिकाओं को खो दें। कोशिकाओं को बीज करने के लिए, पहले प्लेट में मीडिया जोड़ें। फिर, कोशिकाओं को ड्रॉपवाइज तरीके से जोड़ें और फिर प्लेट में वितरण सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को भंवर करें।तीन मार्ग के बाद, साइटोमेट्री और भेदभाव परख प्रवाह के लिए आगे बढ़ें। तीन मार्गों के बाद, लिपोस्पिरेट और एब्डोमिनोप्लास्टी नमूनों से अलग एएससी में एक एंजाइमेटिक पाचन के बाद अलग एएससी के समान एमएससी आकृति विज्ञान और फेनोटाइप पाया गया । अन्य एमएससी की तरह, एक्सप्लांट अलग एएससी सीडी 45 के लिए नकारात्मक और सीडी 73, सीडी 90 और सीडी 105 के लिए सकारात्मक हैं।ऊतक को नख़रे लेते समय, प्रत्येक टुकड़े का सतह क्षेत्र ऊतक से बाहर निकलने के लिए एएससी के लिए पर्याप्त रूप से बड़ा होना चाहिए। ये मौलिक स्टेम सेल हैं जिनका उपयोग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है। अलग एएससी का उपयोग वीवो या इन विट्रो में किसी भी डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

एक में स्टेम सेल प्रत्यारोपण इन विट्रो में नकली मॉडल / Ischemia reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

मानव दंत लुगदी स्टेम सेल के अलगाव विशेषता, और तुलनात्मक भेदभाव दो अलग अलग तरीकों का उपयोग करके स्थायी दांत से व्युत्पन्न

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृति और CD133 का अलगाव<sup&gt; +</sup&gt; मेलेनोमा से ख्यात कैंसर स्टेम सेल

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

मानव प्रोस्टेट कैंसर के नमूनों से कैंसर स्टेम कोशिकाओं के अलगाव

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

अग्नाशय के कैंसर नई उपचार रणनीतियों के विकास के लिए सेल के लक्षण स्टेम का अध्ययन

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

ट्यूमर विशिष्ट endothelial कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के विस्तार

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

चूहे में श्वासनली के रैपिड इंटुबैषेण के लिए एक बेहतर तरीका

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Minipigs की श्लेष द्रव और अस्थि मज्जा से व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल के अलगाव और सेलुलर phenotyping

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

निर्माण और एक मधुमेह घाव मॉडल में एक वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ASC) शीट के ट्रांसप्लांटेशन

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin प्रेरित आंतों में सूजन Organoids: एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों में दवा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए परख

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...