このプロトコルは、粗い酵素や遠心分離ステップを使用せずにASCを分離するための簡単な費用対効果の高い方法を提供し、細胞の表現型や挙動を変化させる可能性があります。過酷なステップの欠如は、酵素と遠心分離を使用して単離されたものよりも操作された細胞を少なくし、実験的観察が単離法のアーティファクトであるかどうかについての質問を最小限に抑えます。この外植法は、様々な疾患を治療したり、研究用途を提供する生活の中で拡大するために患者に導入される臨床関連ASCを生成することができます。
言葉でミンチ法を完全に説明することは困難です。視覚的なデモンストレーションは、他の科学者に組織自体を分解することを学ぶ面倒を提供することができます。同様の外植法は、臍組織から例えば、MSCの他の集団を分離するために使用することができる。
腹腔形成組織サンプルをミンチするには、まず滅菌100ミリメートル板の蓋に組織を移す。その後、滅菌針を使用して組織の一部を所定の位置に保持し、滅菌メスを使用して組織を1ミリメートル未満に切断します。組織を新鮮なチューブに移し、サンプルを5〜6回反転または振って、すべての層の混合を確実にします。
次いで、無菌ヘラを用いて、2.5~5ミリリットルの組織を100ミリ真空ガスプラズマ処理組織培養板に移す。新鮮な遠心管に注いでサンプルの体積を測定します。次に、プレートに相当量の組織培養培地を加え、プレートを軽く旋回して内容物を混合する。
プレートの基部に十分な数の細胞が見られるまで、5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。十分な数の細胞がプレートに記載されるか、または7日後のいずれか早い場合は、残りの組織部分をすべて除去する。次に、組織培養培地中のASCを70%合流に達するまで、または細胞が通過する時点でクラスターが密になるまで培養する。
1Xリン酸緩衝生理食塩紙でプレートをそっとすすります。接着性細胞をトリプシン化するには、リン酸緩衝生理食塩水を吸引し、各プレートに0.25%EDTAを加えたトリプシンを1ミリリットル加え、摂氏37度で5分間インキュベートする。プレートに少量のメディアを追加して、トリプシンを無効にします。
その後、プレートの上から下にメディアトリプシンをそっとピペットし、プレートから弱く取り付けられた細胞を失います。細胞をシードするには、まずプレートにメディアを追加します。次に、ドロップワイズで細胞を追加し、プレート全体に均等に分布を確保するためにプレートを旋回します。
3つの通路の後、サイトメトリーおよび分化アッセイを流すに進む。3回の通過の後、リポアストロシンおよび腹部形成術サンプルからの単離されたASCは、酵素消化後の単離されたASCと同様に、MSC形態および表現型を有することが判明した。他の MSC と同様に、外植分離 ASC は CD45 では負数、CD73、CD90、および CD105 では正になります。
組織を細かく切り取るとき、各部分の表面積は、ASCが組織から移行するのに十分な大きさでなければならない。これらは、幅広い用途に使用できる基本的な幹細胞です。分離されたASCは、インビボまたはインビトロの任意のダウンストリームアプリケーションに使用できます。
