Denne protokollen gir en enkel kostnadseffektiv måte å isolere ASCer uten bruk av harde enzymer eller sentrifugeringstrinn, noe som kan endre cellefenotypen og oppførselen. Mangelen på harde skritt gir mindre manipulerte celler enn de isolerte ved hjelp av enzymer og sentrifugering, og minimerer spørsmål om eksperimentelle observasjoner er en artefakt av isolasjonsmetoden. Denne explant metoden kan generere klinisk relevante ASCer som skal innføres i en pasient for å behandle en rekke sykdommer eller utvide i livet råd til forskningsapplikasjoner.
Det er vanskelig å forklare mincingmetoden fullt ut med ord. Den visuelle demonstrasjonen kan tjene andre forskere bryet med å lære å bryte fra hverandre vevet selv. Lignende explant metoder kan brukes til å isolere andre populasjoner av MSCer, slik som de fra navlestreng vev.
For å hakke mageplastikkvevsprøvene, overfør først vevet til lokket på en steril 100 millimeter plate. Bruk deretter en steril nål for å holde et stykke vev på plass og bruke en steril skalpell til å kutte vevet i mindre enn en millimeter stykker. Overfør vevet til et friskt rør og inverter eller rist prøven fem til seks ganger for å sikre blanding av alle lag.
Deretter, med en steril slikkepott, overføre 2,5 til fem milliliter vev til en 100 millimeter vakuum gassplasma behandlet vev kultur plate. Mål volumet av prøven ved å helle inn i et friskt sentrifugerør. Deretter legger du til et tilsvarende volum av vevskulturmedier til platen og virvler forsiktig platen for å blande innholdet.
Inkuber platen ved 37 grader Celsius i fem prosent karbondioksid til et tilstrekkelig antall celler er sett på bunnen av platen. Når et tilstrekkelig antall celler er notert på platen eller etter syv dager, avhengig av hva som er før, fjern alle gjenværende biter av vev. Deretter kultur ASCs i vev kultur media til de når 70% samløpet eller til klyngene blir tett på hvilket tidspunkt cellene skal passeres.
Skyll platen forsiktig med 1X fosfatbufret saltvann. For å prøvepsinisere de tiltalende cellene, aspirere fosfatbufret saltvann, legg til en milliliter trypsin supplert med 0,25% EDTA til hver plate og inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter. Legg til en liten mengde medier på platen for å deaktivere trypsin.
Deretter pipette mediet trypsin forsiktig fra toppen av platen nedover, og mister eventuelle svakt vedlagte celler fra platen. For å så cellene, legg først til medier på platen. Deretter legger du til cellene på en dropwise måte og deretter virvle platen for å sikre jevn fordeling over platen.
Etter tre passasjer, fortsett å strømme cytometri og differensieringsanalyser. Etter tre passasjer ble det funnet isolerte ASCer fra lipoaspirat- og mageplastikkprøver å ha en MSC morfologi og fenotype, tilsvarende isolerte ASCer etter en enzymatisk fordøyelse. Som andre MSCer er de isolerte ASC-ene negative for CD45 og positive for CD73, CD90 og CD105.
Ved hakking av vevet må overflatearealet på hvert stykke være tilstrekkelig stort for at ASCene skal kunne migrere ut av vevet. Dette er grunnleggende stamceller som kan brukes til et bredt spekter av applikasjoner. De isolerte ASC-ene kan brukes til nedstrømsapplikasjon, in vivo eller in vitro.
