Name: an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-12-16T12:00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Forfatterne har ingen bekreftelser

Bruken av liposaspiratet og mageplastikk prøver er godkjent av den institusjonelle Review Board (IRB) av Rutgers University-Newark campus.
1. utarbeidelse av tissue kultur Media
<ol><li>Sterilely forberede 500 mL vev kultur medier før isolere ASCs. For å forberede kulturen Media, tilsett 10% definert fosterets kalv serum (FCS) og penicillin-Streptomycin (10 000 U/100 mL) til Dulbecco ' s minimal essensielle medier (DMEM) med høy glukose og 2 mM L-glutamin. Mediene kan oppbevares ved 4 ° c i inntil 3 uker og skal alltid brukes varm (mellom romtemperatur til 37 ° c).<ol>
<li>Hvis et annet medium er foretrukket for kulturen i stamceller, forberede at Media i stedet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolering av ASCs fra fettvev
<ol><li>Skaff lipoaspirates eller mageplastikk prøve (r). Etter IRB godkjenning, få slike prøver som kastes vev etter ulike kirurgiske prosedyrer. Transporter lipoaspirates til laboratoriet i hvilket fartøy kirurgen fjernet vevet; transport mageplastikk prøver i en bæreveske eller container i operasjonsrommet.</li>
	<li>Oppbevar prøven (e) ved romtemperatur i opptil 6 timer eller ved 4 ° c i opptil 24 timer hvis den ikke behandles umiddelbart. Vevsprøver som behandles utover de ovennevnte tidspunktene, vil sannsynligvis ha en redusert celle kapasitet. Hold mageplastikk prøver fuktig ved tilsetning av 1x sterilt fosfat bufret saltvann.</li>
	<li>Fra dette punktet og framover, utføre alle trinnene i en laminær Flow Hood under aseptisk forhold. Bruk hansker for personlig beskyttelse. Behold 10% blekemiddel, 70% etanol, og papirhåndklær i nærheten for raskt å rydde opp i eventuelle biologiske søl. Avhendes overflødig vev som biomedisinsk avfall.</li>
	<li>Hakke prøvene i < 1 mm stykker. Hvis mageplastikk blokken er for stor til å arbeide med, kutt en håndterlig størrelse på vev ut av blokken før hakking. Overfør det mageplastikk vevet til lokket på en steril 100 mm plate. Bruk en steril nål til å holde et stykke vev på plass og bruk en steril skalpell å hakke bitene av ved enten å skjære eller forsiktig shredding ut av bulk vevet.<ol>
<li>Dette trinnet er vanligvis ikke nødvendig for lipoaspirates. Men hvis store vev biter er observert i liposaspiratet, fjerne slike biter med steril tang og prosess som ovenfor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overfør vevet til et friskt rør og Vend eller rist prøven 5 – 6 ganger for å sikre blanding av alle lag. Valgfritt: Hvis liposaspiratet er helt utlignet, fjern og kast olje laget før miksing.</li>
	<li>Overfør 2,5 – 5 mL vev til en 100 mm vakuum-gass-behandlet vevs kultur plate (tabell med materialer). Målvolumet av prøven ved å strømme inn i et friskt sentrifugerør. Om nødvendig, bruk en steril slikkepott for å bistå med overføring av vevet.</li>
	<li>Legg til et tilsvarende volum av vev kultur medier til platen. Roter platen forsiktig for å blande innholdet.</li>
	<li>Ruge Pates ved 37 ° c i 5% CO2 til et tilstrekkelig antall celler blir sett på undersiden av platen. Over tid vil cellene migrere fra innsiden av vevet på plateoverflaten, noe som peker de vil følge plast. Som de gå ut av vevet, vil cellene vises som små klynger rundt vevet stykker.</li>
	<li>Hver 24 h, fjerne så mye væske som mulig og erstatte med en lignende mengde medier. La bitene av vev på plass, hvis mulig.</li>
	<li>Når et tilstrekkelig antall celler er notert på tallerkenen (> 10 klynger av > 15-25 celler på tallerkenen) eller etter 7 dager, avhengig av hva som er før, fjerne alle gjenværende stykker av vev.</li>
	<li>Kultur ASCs i vev kultur Media før de når 70% confluency eller til klynger blir tette (> 5 tette klynger av celler på tallerkenen, hver med en diameter på ca > 500 μm), noe som peker cellene skal passert.</li>
</ol>3 kultur ASCs
<ol><li>Passage ASCs når den overordnede platen når ca 70% confluency. Pass på å unngå over confluency av ASC kulturer.</li>
	<li>Skyll forsiktig platen med 1x fosfat bufret saltvann og trypsinize de tilhenger cellene. For å trypsinize cellene, aspirer det fosfat bufrede saltvann og tilsett 1 mL Trypsin med 0,25% EDTA til hver plate og ruge ved 37 ° c i 5 min. Etter 5 minutter, Bekreft de-overholdelse av mikroskopi. Hvis cellene er fortsatt tilhenger, returnere cellene til inkubator for ytterligere 5 min.</li>
	<li>Legg til en liten mengde medier (ca. 25% av det totale Trypsin volumet) på platen for å deaktivere Trypsin, og vask forsiktig sokkelen på platen ved hjelp av medie-Trypsin. Å vaske platen, holder platen i en liten vinkel og forsiktig pipette Media/Trypsin fra toppen av platen nedover, løsne eventuelle ukentlige vedlagte celler fra platen. Cellene kan bli re-belagt på et 1:3 ratio eller seeded i en tetthet på 120000-500000 celler per plate.<ol>
<li>Hvis seeding basert på celle telling, overføre Trypsin/Media fra platen til en konisk sentrifugerør, og pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g for 7 min. Resuspend cellene i vev kultur medier (ca 1 ml per første plate) og telle cellene før seeding. Hvis du vil telle cellene, overfører du 10 μL av celle fjæringen i hemocytometer og teller cellene som finnes i 4 x 4-kvadrant i hvert hjørne av rutenettet. Gjennomsnittlig disse verdiene sammen og multiplisere verdien med 104 for å beregne celle nummeret.</li>
		<li>Legg Media til platen før seeding cellene. Legg til cellene i en dråpevis måte og deretter virvel platen for å sikre jevn fordeling over platen. Merk: etter 3 passasjer, bør de tilhenger cellene vises asymmetrisk og spindel formet. ASC fenotype og atferd kan bekreftes ved hjelp av Flow flowcytometri og differensiering analyser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bekreftelse av ASC-fenotype og-atferd ved hjelp av flyt flowcytometri og differensiering av analyser<ol>
<li>Flow-flowcytometri<ol>
<li>Samle og pellet cellene som beskrevet ovenfor. Vask pelleted med 1x fosfat bufret saltvann og Merk cellene med produsenten anbefalte mengder antistoff. En detaljert protokoll for Flow flowcytometri, en vanlig laboratorie prosedyre, finner du her12,14,15.</li>
			<li>Velg overflate markør paneler fra følgende for å bekrefte ASC-fenotype: negativt for CD14, CD31, CD34, CD45 og CD106; og positiv for CD29, CD36, CD44, CD73, CD90, og CD10516,17,18,19. Tilstedeværelsen av CD36 og fravær av CD106 skjelne ASCs fra benmarg-avledet MSCs20.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Differensiering analyser: Bekreft multilinageceller differensiering ved hjelp av en MSC differensiering Kit. Settene er tilgjengelige fra flere produsenter for å bekrefte adipogenic, osteogen og chondrogenic differensiering kapasitet. Endre Kit-levert Media hver 3-4 dager i henhold til produsentens protokoller for 3 uker eller til morfologiske differensiering er observert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kultur cellene for flere passasjer; antall passasjer som trengs vil avhenge av programmet (e). På hvert avsnitt, bekrefter MSC celle morfologi og fenotype ved hjelp av de nevnte celleoverflaten markører, og sikre multilinageceller differensiering kapasitet har ikke gått tapt. Mens ekspansjons potensialet er forskjellig blant donorer, kan de fleste prøvene utvides for opptil 6-9 passasjer.</li>
	<li>Lagre nedfryste cellene og oppbevar i flytende nitrogen for fremtidig bruk.</li>
</ol>4 kryonisk bevaring av ASCs
<ol><li>Klargjør 10 mL fryse løsninger A og B.<ol>
<li>For frysing løsning A, tilsett 20% FCS til DMEM med høy glukose.</li>
		<li>For frysing løsning B, tilsett 20% FCS og 20% dimethyl sulfid (DMSO) til DMEM med høy glukose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 5 min. Resuspend cellene i et lite volum av frysing løsning a og telle cellene ved hjelp av en hemocytometer som i trinn 3.3.1.</li>
	<li>Beregn det endelige volumet som cellene skal resuspendert inn for å nå en endelig celle konsentrasjon på 500000 – 1000000 celler/mL. Bruk fryse løsning A for å resuspend pellet i 50% av det endelige volumet. Sakte legge til et likt volum av frysing løsning B dråpevis mens agitating røret for å nå den endelige celle konsentrasjonen.</li>
	<li>Umiddelbart fryse cellene i 1-2 mL cryovials. Frys cryovials i en kontrollert fryseboks eller i en fryse beholder plassert ved-80 ° c, noe som senker temperaturen med 1 ° c/min. Etter kontrollert fryse (over natten for en fryseboks), overføre cellene til flytende nitrogen for langtidslagring.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal/stem+cells+in+drug+therapy:+New+perspective.">Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective.</a> Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).</li><li>Conde-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+Mechanical+Isolation+of+Adipose-derived+Stromal+Vascular+Fraction:+Review+of+Upcoming+Techniques.">Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Hendijani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+An+advantageous+method+for+isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+tissues.">Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues.</a> Cell Proliferation. 50 (2), (2017).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells.">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+a+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+different+methods+of+handling+human+liposuction+aspirate+and+their+effect+on+adipocytes+and+adipose+derived+stem+cells.">In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-Free+Isolation+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).</li><li>Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+effective+strategy+for+the+isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+minimally+manipulated+adipose-derived+stem+cells+for+more+rapid+and+safe+stem+cell+therapy.">A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy.</a> Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discussion+on+adult+mesenchymal+stem+cells+for+drug+delivery:+pros+and+cons.">A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons.</a> Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Barlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+placenta-+and+bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).</li><li>Munoz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feline+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+show+similar+phenotype+and+functions+with+regards+to+neuronal+differentiation+as+human+MSCs.">Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs.</a> Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).</li><li>Amati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+cord+blood:+evaluation+of+in+vitro+quality+parameters+prior+to+clinical+use.">Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14 (2017).</li><li>Bajek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+liposuction+method+influence+the+phenotypic+characteristic+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells.</a> Bioscience Reports. 35 (3), (2015).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Isolation,+Characterization+and+Expansion+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+(ASCs):+An+Overview.">Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).</li><li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal/stem+cells:+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+(IFATS)+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+(ISCT).">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li><li>Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+without+tissue+destruction:+a+non-enzymatic+method.">Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method.</a> Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).</li><li>Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+"Bench+to+Bedside":+Current+Advancement+on+Large-Scale+Production+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">From "Bench to Bedside": Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre

ASCs er en attraktiv kilde til MSCs på grunn av enkel tilgang til vevet. For både kliniske og forskningsprogrammer må forskerne huske donor variasjon når de isolerer og dyrking disse cellene. Av grunner ennå ikke belyst, MSCs fra ulike givere viser ulike kapasiteter til å spre in vitro, som senere vil påvirke ASC ' s migrasjon ut av fett explant og spredning kapasitet. Mens variasjon kan observeres i den tiden det tar for ASCs isolert fra disse enzymet-fri explants å nå confluency, det var sjelden for en prøve ikke å spre in vitro.
Utover donor variasjon, den mest sannsynlige kilden til svikt i cellene til å migrere ut av vevet og/eller spre in vitro er hvor lenge vevet ble lagret før behandling. Da prøvene fikk lov til å sitte i > 12 timer før behandling eller ikke ble holdt fuktig mellom høsting og foredling, ble det observert dårligere migrasjon og sprednings rater. De eneste prøvene som ofte ikke klarte å spre var mageplastikk prøver som ikke ble holdt fuktig med en saltoppløsning: i disse tilfellene, vevet i midten av vevet blokken var ofte fuktig nok til å behandle, men noen ganger nødvendig å bli forkastet. Det er derfor avgjørende å holde vevet fuktig fra tid til innhøsting gjennom behandling.
I tilfeller der ASCs ikke er observert på tallerkenen på 1 uke merke, fett explants bør likevel fjernes fra vevet kultur platene for at vevs nekrose oppstår. Noen ganger er det for få celler til å identifisere enkelt, men de få cellene vil være i stand til å utvide i kultur systemet. Hvis cellene er fortsatt ikke observert på 3 uker, bør isolasjonen vurderes mislyktes.
I noen tilfeller, spesielt av mageplastikk, er det ikke mulig å få en virkelig aseptisk prøve på grunn av begrensningene i operasjons arenaen. Hvis det ikke er mulig å bruke et sterilt fartøy til å transportere vevet fra operasjonsstuen til en laminær strømnings hette, er det vanligvis tilstrekkelig å fjerne den ytre 1 cm av vevet for å hindre mikroorganismen forurensning. Hvis mageplastikk prøven er festet til huden, kan huden tørkes med 70% etanol å sterilisere at overflaten før hakking fettvev.
Under hakking prosessen, er det viktig at vevet er hakket i små, fine stykker. Hvis explants er for store, vil det være utilstrekkelig overflateareal for ASCs å migrere ut av vevet og på tallerkenen. Videre er det viktig at vevet ikke forblir i platen lenger enn nødvendig for at vevet blir nekrotisk.
En begrensning av denne metoden er bruk av et enzym (i den beskrevne protokollen, Trypsin) til å løsne ASCs under vevs kultur prosessen. Annet ingen-dyr avledet enzym, som Accutase, kan erstattet å fjerne behovet for dyr avledet produktene, imidlertid, denne ville forhøye prisen av vevet kulturen. Av denne grunn, blant annet, er mange grupper gransker ikke-to-dimensjonale vev kultur metoder som bioreaktorer og stillas-baserte systemer for å øke MSC vekstpotensial samtidig minimere behovet for å løsne cellene fra underlaget22.
Når du flytter ASCs til klinikken, en stor begrensning av explant isolasjon metoden er avhengigheten av en god produksjon praksis (GMP) nivå vev kultur anlegget, som mange medisinske sentre mangler. I disse tilfellene, noen av de selv-lukkede kommersielt tilgjengelige enzym-eller sentrifugering metoder vil trenge å bli ansatt. Men som GMP-anlegg blir mer utbredt, er denne effekten forventes å være begrenset. I mellomtiden, selv slike anlegg mangler GMP vev kultur fasiliteter kan vurdere å bruke explant metode for å studere ASCs in vitro: jo mindre manipulasjon, jo mer beslektet disse cellene er til sine in vivo kolleger11.
Denne metoden gir en enkel måte å isolere ASCs fra fettvev-både lipoaspirates og abdominoplasties-i fravær av harde enzymer eller sentrifugering trinn. Mens den første avkastningen av ASCs er lavere enn for andre metoder, vil ASCs sprer in vitro, minimere effekten av lavere innledende avkastning. Mangelen på overdreven eller kraftig manipulasjon gjør ASCs isolert på en slik måte spesielt relevant, siden det er færre spørsmål (dvs. om de observerte effektene er på grunn av cellene selv eller til cellenes manipulasjon under isolasjons prosessen ).

Mesenchymal stamceller (MSCs) er en klasse av Multipotent voksne stamceller som kan isoleres fra ulike voksne og Foster vev, inkludert fra fettvev. Disse cellene er en attraktiv celle type for både grunnleggende forskning og kliniske anvendelser på grunn av deres plastisitet å differensiere til celler av alle bakterie lag in vitro, krysser allogene barrierer, hjem til områder av betennelse, og undertrykke betennelse (omtalt i Sherman, et al.1). Fett-avledet MSCs (ASCs) er spesielt tiltalende på grunn av sin enkle obtainment, som fettvev er generelt betraktet forkaste vev etter rutinemessig fettsuging og mageplastikk prosedyrer. Men, når innhentet, prøvene er generelt utsatt for tøffe forhold-enten enzymatisk tilstand eller sentrifugering-for å isolere ASCs2,3. Denne metoden illustrerer en enkel prosedyre for å isolere ASCs ved hjelp av en explant metode, i fravær av harde enzymatisk eller sentrifugering trinn.
Den vanligste metoden for å isolere ASCs består av å vaske en fett prøve, enzymatisk fordøye prøven med kollagenase, sentrifugering prøven, og til slutt lysering de røde blodcellene før dyrking av ASCs4. Mens effektiv på isolere en høy avkastning på ASCs, er bruken av xenogeneic komponenter (f. eks, enzymatisk fordøyelse med kollagenase) anses mer enn "minimal manipulert" av US Food and Drug Administration, og kan utgjøre risikoer som immunreaksjon, forbyr cellenes bruk i klinikken5,6. Å minimere risikoen av xenogeneic komponentene, mange holdene ha foreslo ingen-dyr avledet, fabrikasjon enzym å oversikten det fett tissue. Men disse enzymene er fortsatt harde, og kan endre celle fenotype7.
Andre metoder for å isolere ASCs inkluderer høyhastighets sentrifugering, ved hjelp av styrker så høyt som 1 200 x g, og virvlingen for å isolere ASCs8. Selv styrker så lavt som 400 x g var tilstrekkelig i å isolere levedyktige ASCs9. Selv om disse cellene produserer en stor mengde levedyktige celler, klarte mange protokoller å spre utover 14 dager8. Videre gir mekanisk isolasjon færre gjenopprettede celler enn enzymatisk fordøyelse, men en høyere andel av isolerte celler ble ASCs sammenlignet med andre celler endogene til fettvev i passasje 010.
Isolering av en renere, mer levedyktig befolkning på ASCs på kortere tid, kombinert med kostnader og risiko for xenogeneic komponenter, gjør enzymatisk fordøyelsen mindre og mindre attraktivt for oversettelse til klinikken. Mens mekanisk isolasjon er i utgangspunktet en gunstig tilnærming, det er betydelige ulikheter i metodene som brukes, og volumet av vev behandlet er begrenset til størrelsen på de spesialiserte sentrifugal enheter, og kan være avhengig av operatøren konsistens2.
Mens både enzymatisk fordøyelsen og sentrifugering raskt gi et høyt volum av ASCs, disse isolerte cellene viser fenotypiske endringer, gir spørsmål om deres oppførsel når de returneres til en pasient2. En explant-basert metode for ASC isolasjon, som beskrevet i denne protokollen, er således ansatt av noen grupper, der ASCs migrere ut av små biter av solid fettvev3,11,12. Denne migreringen er sannsynligvis en effekt av cellene som trekkes til det næringsrike mediet. I likhet med andre populasjoner av MSCs, ASCs følge plast, og overleve og sprer seg i den brukte vev kulturen Media (komponenter nedenfor), tillater deres isolasjon fra andre celletyper fra fettvev. Mens færre celler er i utgangspunktet utvinnes-ofte tar > 1 uke til cellene er synlige på vevet kultur plate-disse unmanipulated ASCs vil spre in vitro, tillater utvidelse av cellene til klinisk relevante volumer11,12,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3003 tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>serum is batch tested to ensure it supports MSC growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells

Mesenchymal stamceller (MSCs) er en populasjon av Multipotent celler som kan isoleres fra ulike voksne og Foster vev, inkludert fettvev. Som en klinisk relevant celle type er optimale metoder nødvendig for å isolere og utvide disse cellene in vitro. De fleste metoder for å isolere fett-avledet MSCs (ADSCs) stole på harde enzymer, for eksempel kollagenase, å fordøye fettvev. Men mens effektiv på å bryte ned fettvev og gir en høy ADSC utvinning, disse enzymene er dyre og kan ha skadelig effekt på ADSCs-inkludert risikoen ved å bruke xenogeneic komponenter i kliniske anvendelser. Denne protokollen beskriver en metode for å isolere ADSCs fra ferske liposaspiratet og mageplastikk prøver uten enzymer. Kort, denne metoden er avhengig av mekaniske oppheve Aktivitetstilknytning av noen bulk vev etterfulgt av en explant-type kultur system. ADSCs er tillatt å migrere ut av vev og på vevet kultur plate, hvoretter ADSCs kan bli kultivert og utvidet in vitro for en rekke forskning og/eller kliniske anvendelser.

Ved hjelp av metoden som er beskrevet her, ble ASCs vellykket isolert fra liposaspiratet og mageplastikk prøver (figur 1). Etter tre passasjer, de isolerte cellene ble funnet å ha en MSC morfologi (asymmetrisk, spindel form) og fenotype, ligner ASCs følgende enzymatisk fordøyelse (figur 2). Tidligere studier fra vår gruppe og andre har vist disse ASCs å differensiere til adipocytter, osteocytter, og neurons som andre MSCs, inkludert ASCs isolert på andre måter11,21.
I de fleste tilfeller kan ASCs migrasjon på vevet kultur platen bli visualisere innen 3-5 dager med lyse feltet mikroskopi. Men i noen tilfeller vil bare spredte celler være synlige etter 7 dager. I sjeldne tilfeller vil cellene ikke migrere til platen og/eller vil ikke spre seg til den tredje passasjen. Dette utfallet samsvarer vanligvis med en forsinkelse i behandlingen av vevsprøven.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk representasjon av ASC-isolering fra mageplastikk og liposaspiratet prøver. Mageplastikk og liposaspiratet prøvene ble oppnådd som kastes vev etter rutinemessig kirurgiske prosedyrer. Mageplastikk prøvene var revet, hvoretter enten mageplastikk eller liposaspiratet prøvene var belagt som explants i vev kultur Media. Den ASCs migrert ut av vevet, mot nærings rikt media. Etter 1 uke ble explants fjernet og ASCs kultivert for nedstrøms eksperimentering og/eller klinisk anvendelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig1alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig2.jpg"> Figur 2: isolert ASCs med MSC morfologi og fenotype. ASCs isolert av enzymet-fri, explant metoden har en MSC morfologi og fenotype ved passasje 3. (A) som andre MSCs, disse ASCs har en asymmetrisk, spindel form, enten isolert av explant eller enzymatisk metode (f. eks, kollagenase). Den ASCs isolert ved hjelp av enzymet metoden gir en lengre, smalere morfologi i forhold til explant isolert ASCs; sistnevnte nærmere ligne MSCs avledet fra andre enzym-fri isolasjon metoder, for eksempel benmarg avledet-MSCs. (B) som andre MSCs, den Explant isolerte ASCs er negative for CD45 og positiv for CD73, CD90, og CD105. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig2alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Denne protokollen gir en enzym fri metode for å isolere Mesenchymal stamceller fra mageplastikk og liposaspiratet prøver ved hjelp av en explant metode. Fraværet av sterke enzymer eller sentrifugering trinn gir for klinisk relevante stamceller som kan brukes til studier in vitro eller overført tilbake til klinikken.

Et enzym-fri metode for isolering og utvidelse av Human fett-avledet Mesenchymal stamceller

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Denne protokollen gir en enkel kostnadseffektiv måte å isolere ASCer uten bruk av harde enzymer eller sentrifugeringstrinn, noe som kan endre cellefenotypen og oppførselen. Mangelen på harde skritt gir mindre manipulerte celler enn de isolerte ved hjelp av enzymer og sentrifugering, og minimerer spørsmål om eksperimentelle observasjoner er en artefakt av isolasjonsmetoden. Denne explant metoden kan generere klinisk relevante ASCer som skal innføres i en pasient for å behandle en rekke sykdommer eller utvide i livet råd til forskningsapplikasjoner.Det er vanskelig å forklare mincingmetoden fullt ut med ord. Den visuelle demonstrasjonen kan tjene andre forskere bryet med å lære å bryte fra hverandre vevet selv. Lignende explant metoder kan brukes til å isolere andre populasjoner av MSCer, slik som de fra navlestreng vev.For å hakke mageplastikkvevsprøvene, overfør først vevet til lokket på en steril 100 millimeter plate. Bruk deretter en steril nål for å holde et stykke vev på plass og bruke en steril skalpell til å kutte vevet i mindre enn en millimeter stykker. Overfør vevet til et friskt rør og inverter eller rist prøven fem til seks ganger for å sikre blanding av alle lag.Deretter, med en steril slikkepott, overføre 2,5 til fem milliliter vev til en 100 millimeter vakuum gassplasma behandlet vev kultur plate. Mål volumet av prøven ved å helle inn i et friskt sentrifugerør. Deretter legger du til et tilsvarende volum av vevskulturmedier til platen og virvler forsiktig platen for å blande innholdet.Inkuber platen ved 37 grader Celsius i fem prosent karbondioksid til et tilstrekkelig antall celler er sett på bunnen av platen. Når et tilstrekkelig antall celler er notert på platen eller etter syv dager, avhengig av hva som er før, fjern alle gjenværende biter av vev. Deretter kultur ASCs i vev kultur media til de når 70% samløpet eller til klyngene blir tett på hvilket tidspunkt cellene skal passeres.Skyll platen forsiktig med 1X fosfatbufret saltvann. For å prøvepsinisere de tiltalende cellene, aspirere fosfatbufret saltvann, legg til en milliliter trypsin supplert med 0,25% EDTA til hver plate og inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter. Legg til en liten mengde medier på platen for å deaktivere trypsin.Deretter pipette mediet trypsin forsiktig fra toppen av platen nedover, og mister eventuelle svakt vedlagte celler fra platen. For å så cellene, legg først til medier på platen. Deretter legger du til cellene på en dropwise måte og deretter virvle platen for å sikre jevn fordeling over platen.Etter tre passasjer, fortsett å strømme cytometri og differensieringsanalyser. Etter tre passasjer ble det funnet isolerte ASCer fra lipoaspirat- og mageplastikkprøver å ha en MSC morfologi og fenotype, tilsvarende isolerte ASCer etter en enzymatisk fordøyelse. Som andre MSCer er de isolerte ASC-ene negative for CD45 og positive for CD73, CD90 og CD105.Ved hakking av vevet må overflatearealet på hvert stykke være tilstrekkelig stort for at ASCene skal kunne migrere ut av vevet. Dette er grunnleggende stamceller som kan brukes til et bredt spekter av applikasjoner. De isolerte ASC-ene kan brukes til nedstrømsapplikasjon, in vivo eller in vitro.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcelletransplantasjon i en In vitro Simulert ischemia / reperfusjon Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Pasient avledet celle Kultur og Isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Antatte kreft stamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av kreft stamceller fra menneskelige prostata kreft Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolation and Culture Utvidelse av tumor-spesifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

En forbedret fremgangsmåte for Rapid intubering av trakea hos mus

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolasjon og Cellular fenotyping av stamceller Avledet fra leddvæske og benmarg av minigriser

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Opprettelse og transplantasjon av en liggende under Adipose-avledet stilk cellen (ASC) ark i en diabetiker sårhelende modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-indusert Hevelse i tarmen Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyse for å vurdere Drug Response i pasienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...