Name: an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-12-16T12:00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Авторы не имеют подтверждений

Использование образцов липоаспиратии и абдоминопластики было одобрено Институциональным наблюдательным советом (IRB) Ратгерского университета - Кампус Ньюарк.
1. Подготовка Ткань культуры СМИ
<ol><li>Стерильно подготовить 500 мл тканевой культуры средств массовой информации до изоляции ASCs. Чтобы подготовить средства массовой информации культуры, добавить 10% определены плода икроножной сыворотки (FCS) и пенициллина-стрептомицина (10000 U/100 мл) к dulbecco минимальные основные средства массовой информации (DMEM) с высоким содержанием глюкозы и 2 мм L-глутамамин. Носители могут храниться при температуре 4 градусов по Цельсию в течение 3 недель и всегда должны использоваться в тепле (от комнатной температуры до 37 градусов По Цельсию).<ol>
<li>Если различные средства массовой информации предпочтительнее для культуры стволовых клеток, подготовить, что средства массовой информации, а не.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Изоляция АСК от жировой ткани
<ol><li>Получить липоаспираты или абдоминопластика образца (ы). После одобрения IRB, получить такие образцы, как отбросить ткани после различных хирургических процедур. Транспорт липоаспираты в лабораторию в каком сосуде хирург удалил ткани; транспортировать образцы абдоминопластики в сумке или контейнере операционной.</li>
	<li>Храните образец (ы) при комнатной температуре до 6 ч или при температуре 4 градусов по Цельсию на срок до 24 ч, если не обрабатывать немедленно. Образцы тканей, обработанные за пределами вышеупомянутого времени, скорее всего, будут иметь пониженный выход клеток. Держите образцы абдоминопластики влажными путем добавления 1x стерильных фосфатов буферного солей.</li>
	<li>С этого момента, проводить все шаги в ламинарный поток капот в асептических условиях. Носите перчатки для личной защиты. Держите 10% отбеливатель, 70% этанола, и бумажные полотенца поблизости, чтобы быстро очистить любые биологические разливы. Утилизировать любые избыточные ткани в качестве биомедицинских отходов.</li>
	<li>Фарш образцы в Злт; 1 мм штук. Если блок абдоминопластики слишком велик, чтобы работать с, вырежьте управляемый размер ткани от блока до измельчения. Перенесите ткань абдоминопластики на крышку стерильной 100-мм пластины. Используйте стерильную иглу, чтобы держать кусок ткани на месте и использовать стерильный скальпель, чтобы фарш куски покинуть либо резки или мягко измельчения от объемной ткани.<ol>
<li>Этот шаг, как правило, не требуется для липоаспират. Однако, если большие куски ткани наблюдаются в липоаспирати, удалить такие куски с стерильными щипцы и процесс, как указано выше.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Перенесите ткань в свежую трубку и инвертировать или встряхнуть образец 5-6 раз, чтобы обеспечить смешивание всех слоев. Дополнительно: если липоаспират и полностью оседлал, удалите и отбросьте слой масла перед смешиванием.</li>
	<li>Передача 2,5-5 мл ткани в 100 мм вакуумно-газовой плазмы обработанной ткани культурной пластины(Таблица материалов). Измерьте объем образца, наливая в свежую центрифужную трубку. При необходимости используйте стерильный шпатель для передачи ткани.</li>
	<li>Добавьте в тарелку эквивалентный объем тканевой культуры. Аккуратно закружайте тарелку, чтобы смешать содержимое.</li>
	<li>Инкубировать паштеты при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 до тех пор, пока достаточное количество клеток не будет видно на основании пластины. Со временем клетки будут мигрировать из ткани на поверхность пластины, после чего они будут придерживаться пластика. Когда они выходят из ткани, клетки будут появляться как небольшие скопления вокруг частей ткани.</li>
	<li>Каждые 24 ч, удалить как можно больше жидкости, как это возможно, и заменить с аналогичным количеством носителей. Оставьте части ткани на месте, если это возможно.</li>
	<li>После того, как достаточное количество клеток отмечены на пластине (No gt;10 кластеров из 15-25 клеток на пластине) или после 7 дней, в зависимости от того, что раньше, удалить все оставшиеся части ткани.</li>
	<li>Культура ASCs в средствах культуры ткани до тех пор пока они не достигнуть 70% confluency или до тех пор пока кластеры не стать плотными (nogt;5 плотные скопления клеток на плите, каждое с диаметром приблизительно йgt; 500 мкм), на котором этап клетки должны быть проходимы.</li>
</ol>3 Культура АСК
<ol><li>Прохождение ASCs, когда родительская пластина достигает примерно 70% выпуклости. Позаботьтесь о том, чтобы избежать чрезмерной слоячины культур ASC.</li>
	<li>Аккуратно промыть пластину 1x фосфат буферизированных сольников и trypsinize адептов клеток. Чтобы попробовать клетки, аспирировать фосфат буферного солина и добавить 1 мл трипсина с 0,25% EDTA к каждой пластине и инкубировать при 37 кс в течение 5 мин. После 5 минут, подтвердить де-присоединения с помощью микроскопии. Если клетки все еще придерживаются, верните клетки в инкубатор еще на 5 мин.</li>
	<li>Добавьте небольшое количество носителей (примерно 25% от общего объема трипсина) к пластине, чтобы отключить трипсин, и осторожно промыть основание пластины с помощью носителя / трипсина. Чтобы вымыть тарелку, держите пластину под небольшим углом и аккуратно пипетка сми / трипсин из верхней части пластины вниз, ослабление любых еженедельных прикрепленных клеток из пластины. Клетки могут быть повторно покрыты в соотношении 1:3 или посеяны при плотности 120 000-500 000 клеток на тарелку.<ol>
<li>Если посев на основе количества клеток, передача трипсина / медиа из пластины в конической центрифуги трубки, и гранулы клетки центрифугирования на 300 х г в течение 7 мин. Resuspend клетки в ткани культуры средств (примерно 1 мл на начальную пластину) и рассчитывать клетки до посева. Чтобы подсчитать клетки, перенесите 10 qL суспензии клетки в гемоцитометр и посчитайте клетки, присутствующие в 4 х 4 квадранте в каждом углу сетки. Усреднение этих значений вместе и умножить значение на 104 для расчета числа ячеек.</li>
		<li>Добавить носители в тарелку до посева клеток. Добавить клетки в dropwise образом, а затем закружить пластины для обеспечения равномерного распределения по всей пластине. ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 проходов, клетки адепта должны казаться асимметричными и шпинделями формы. ASC фенотип и поведение может быть подтверждено с помощью цитометрии потока и дифференциации анализов.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подтверждение фенотипа и поведения ASC с использованием цитометрии потока и анализа дифференциации<ol>
<li>Цитометрия потока<ol>
<li>Соберите и гранулы клетки, как описано выше. Вымойте гранулы с 1x фосфат буферных сольник и этикетки клеток с производителем рекомендуемых объемов антител. Подробный протокол для потока цитометрии, общая лабораторная процедура, можно найти здесь12,14,15.</li>
			<li>Выберите поверхностные маркерные панели из следующих, чтобы подтвердить фенотип ASC: отрицательный для CD14, CD31, CD34, CD45 и CD106; и положительный для CD29, CD36, CD44, CD73, CD90, и CD10516,17,18,19. Наличие CD36 и отсутствие CD106 различить ASCs от костного мозга полученных MSCs20.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Анализы дифференциации: Подтвердите дифференциацию многолинейного возраста с помощью набора дифференциации MSC. Комплекты доступны от нескольких производителей для подтверждения адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференциации потенциала. Изменяйте комплектное средства массовой информации каждые 3–4 дня в рамках протоколов производителя в течение 3 недель или до тех пор, пока не будет наблюдаться морфологическая дифференциация.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Культура клеток для нескольких проходов; количество необходимых проходов будет зависеть от приложения(ы). При каждом прохождении подтверждайте морфологию и фенотип клеток MSC с помощью вышеупомянутых маркеров поверхности клеток и убедитесь, что способность дифференциации многолинейного не утеряна. Хотя потенциал расширения отличается между донорами, большинство образцов может быть расширено до 6-9 проходов.</li>
	<li>Криоконсервайте клетки и храните в жидком азоте для использования в будущем.</li>
</ol>4 Криоконсервация АСК
<ol><li>Приготовьте 10 мл замораживающих растворов А и В.<ol>
<li>Для замораживания раствора А добавьте 20% FCS в DMEM с высоким содержанием глюкозы.</li>
		<li>Для замораживания раствора B добавьте 20% FCS и 20% диметилсульфид (DMSO) в DMEM с высоким содержанием глюкозы.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Пелле клетки центрифугирование на 300 х г в течение 5 мин. Resuspend клеток в небольшом объеме замораживания раствора А и рассчитывать клетки с помощью гемоцитометра, как в шаге 3.3.1.</li>
	<li>Рассчитайте окончательный объем, в который клетки будут переложены, чтобы достичь конечной концентрации клеток в 500 000–1 000 клеток/мл. Используйте замораживание раствора А, чтобы повторно приостановить гранулы в 50% от этого конечного объема. Медленно добавьте равный объем замораживания раствора B dropwise, а агитации трубки для достижения конечной концентрации клеток.</li>
	<li>Немедленно замораживать клетки в 1-2 мл криовиалов. Заморозить криовиалы в морозильной камере с контролируемой скоростью или в замораживании контейнера, помещенного при -80 градусов по Цельсию, что снижает температуру на 1 градус по Цельсию/мин. После контролируемого замораживания (ночь для замораживания контейнера), передача клеток жидкого азота для длительного хранения.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal/stem+cells+in+drug+therapy:+New+perspective.">Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective.</a> Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).</li><li>Conde-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+Mechanical+Isolation+of+Adipose-derived+Stromal+Vascular+Fraction:+Review+of+Upcoming+Techniques.">Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Hendijani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+An+advantageous+method+for+isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+tissues.">Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues.</a> Cell Proliferation. 50 (2), (2017).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells.">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+a+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+different+methods+of+handling+human+liposuction+aspirate+and+their+effect+on+adipocytes+and+adipose+derived+stem+cells.">In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-Free+Isolation+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).</li><li>Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+effective+strategy+for+the+isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+minimally+manipulated+adipose-derived+stem+cells+for+more+rapid+and+safe+stem+cell+therapy.">A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy.</a> Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discussion+on+adult+mesenchymal+stem+cells+for+drug+delivery:+pros+and+cons.">A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons.</a> Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Barlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+placenta-+and+bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).</li><li>Munoz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feline+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+show+similar+phenotype+and+functions+with+regards+to+neuronal+differentiation+as+human+MSCs.">Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs.</a> Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).</li><li>Amati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+cord+blood:+evaluation+of+in+vitro+quality+parameters+prior+to+clinical+use.">Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14 (2017).</li><li>Bajek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+liposuction+method+influence+the+phenotypic+characteristic+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells.</a> Bioscience Reports. 35 (3), (2015).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Isolation,+Characterization+and+Expansion+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+(ASCs):+An+Overview.">Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).</li><li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal/stem+cells:+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+(IFATS)+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+(ISCT).">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li><li>Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+without+tissue+destruction:+a+non-enzymatic+method.">Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method.</a> Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).</li><li>Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+"Bench+to+Bedside":+Current+Advancement+on+Large-Scale+Production+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">From "Bench to Bedside": Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать

ASCs являются привлекательным источником MSCs из-за легкого доступа ткани. Для клинических и научно-исследовательских приложений, ученые должны иметь в виду изменчивость донора при изоляции и культивирования этих клеток. По причинам, которые еще предстоит выяснить, МСК от различных доноров показывают различные возможности для распространения в пробирке, что впоследствии повлияет на миграцию АСК из жирового explant и распространения потенциала. Хотя изменчивость может наблюдаться в то время, что требуется для ASCs изолированы от этих ферментов свободных экстенсов для достижения выпуклости, это было редко для образца не размножаться в пробирке.
Помимо донорской изменчивости, наиболее вероятным источником отказа клеток мигрировать из ткани и/или размножаться в пробирке является продолжительность времени, в течение которого ткань хранилась до обработки. Когда образцам разрешалось сидеть за 12 ч до обработки или не держали влажным между уборкой и обработкой, наблюдались более низкие показатели миграции и распространения. Единственными образцами, которые часто не размножались, были образцы абдоминопластики, которые не были влажными с сольным раствором: в этих случаях ткани в центре тканевого блока часто были достаточно влажными для обработки, но иногда их нужно было отбросить. Поэтому очень важно сохранить ткань влажной от времени сбора урожая через обработку.
В тех случаях, когда ASCs не наблюдается на пластине на 1 неделе знак, жировые explants должны по-прежнему должны быть удалены из тканевой культуры пластин, чтобы не некроз ткани происходят. Иногда существует слишком мало ячеек, чтобы легко идентифицировать, но эти немногие клетки будут способны расширяться в рамках системы культуры. Если клетки все еще не наблюдаются в течение 3 недель, изоляция должна считаться неудачной.
В некоторых случаях, особенно абдоминопластики, невозможно получить действительно асептический образец из-за ограничений в хирургической арене. Если нет возможности использовать стерильный сосуд для транспортировки ткани из операционной в ламинарный капот потока, удаление внешнего 1 см ткани, как правило, достаточно для предотвращения загрязнения микроорганизмов. Если образец абдоминопластики прикреплен к коже, кожу можно протереть 70% этанолом для стерилизации этой поверхности до сжигания жировой ткани.
В процессе измельчения очень важно, чтобы ткань измельчалась на мелкие мелкие кусочки. Если экспланты слишком большие, будет недостаточно площади поверхности для ASCs мигрировать из ткани и на пластину. Кроме того, очень важно, чтобы ткань не оставалась в пластине дольше, чем это необходимо, чтобы ткань не стала некротической.
Ограничением этого метода является использование фермента (в описанном протоколе, трипсин) для отсоединения АСК в процессе культуры тканей. Другие неживотные производные ферменты, такие как Accutase, могут быть заменены, чтобы удалить потребность в животных производных продуктов, однако, это увеличит стоимость культуры тканей. По этой причине, среди прочего, многочисленные группы изучают не-двухмерных методов культуры тканей, таких как биореакторы и эшафот на основе систем для увеличения потенциала роста MSC при минимизации необходимости отсоединить клетки от их субстрата22.
При перемещении АСК в клинику основным ограничением метода изоляции эксплантатора является опора на хорошую производственную практику (GMP) уровень ткани культуры объекта, который многие медицинские центры не хватает. В этих случаях необходимо использовать любой из самозакрытых коммерчески доступных методов на основе ферментов или центрифугации. Однако по мере того, как объекты GMP становятся все более распространенными, ожидается, что этот эффект будет ограниченным. В то же время, даже такие объекты, не имеющие GMP ткани культуры объектов можно рассмотреть вопрос об использовании explant метод для изучения ASCs in vitro: чем меньше манипуляций, тем больше сродни эти клетки их in vivo коллегам11.
Этот метод обеспечивает простой способ изоляции ASCs от жировой ткани - как липоаспираты и абдоминопластики - в отсутствие суровых ферментов или центрифугации шаги. В то время как начальная доходность АСК ниже, чем у других методов, АСК будут размножаться в пробирке, снижая эффект более низкой начальной урожайности. Отсутствие чрезмерных или силовых манипуляций делает AsCs изолированы таким образом, особенно актуальным, так как Есть меньше вопросов (т.е. является ли наблюдаемые эффекты из-за самих клеток или манипуляции клеток во время процесса изоляции ).

Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) представляют собой класс многопотентных взрослых стволовых клеток, которые могут быть выделены из различных взрослых и тканей плода, в том числе из жировой ткани. Эти клетки являются привлекательным типом клеток для фундаментальных исследований и клинических приложений из-за их пластичности дифференцировать сяопроецить в клетки всех слоев микроба в пробирке, пересекать аллогенные барьеры, дом к зонам воспаления, и подавить воспаление (рассмотрено в Sherman, et al.1). Adipose-derived MSCs (ASCs) определенно апеллируют из-за их легкости получать, по мере того как жировая ткань вообще рассмотрена отбрасывают ткань следуя за обычными процедурами липосакции и абдоминопластики. Однако, как только получено, образцы, как правило, подвергаются суровым условиям - либо ферментативное состояние или центрифугации - для того, чтобы изолировать ASCs2,3. Этот метод иллюстрирует простую процедуру изоляции АСК с помощью эксплантирующего метода, при отсутствии резких ферментативных или центрифугивационных шагов.
Наиболее распространенным методом изоляции ASCs состоит из мытья жировой образец, ферментативно переваривания образца с коллагеназой, центрифугирования образца, и, наконец, лизания красных кровяных телец до культивирования ASCs4. Хотя эффективно изолировать высокую урожайность ASCs, использование ксеногенных компонентов (например, ферментативное пищеварение с коллагеназой) считается более чем "минимально манипулировать" в США пищевых продуктов и медикаментов, и может представлять риски, такие как иммунная реакция, запрещая использование клеток в клинике5,6. Чтобы свести к минимуму риск ксеногенных компонентов, многие группы предложили неживотных полученных, изготовленных ферментов для переваривания жировой ткани. Тем не менее, эти ферменты по-прежнему суровы, и может изменить фенотип клеток7.
Другие методы изоляции ASCs включают высокоскоростной центрифугирования, используя силы выше, чем 1200 х г, и вихрь, чтобы изолировать ASCs8. Даже сил, как низко как 400 х г было достаточно в изоляции жизнеспособных ASCs9. Хотя эти клетки производят большое количество жизнеспособных клеток, многие протоколы не смогли размножаться за 14 дней8. Кроме того, механическая изоляция дает меньше восстановленных клеток, чем ферментативное пищеварение, но более высокая доля изолированных клеток были ASCs по сравнению с другими клетками эндогенных жировой ткани при прохождении 010.
Изоляция более чистой, более жизнеспособной популяции АСК за меньшее время, в сочетании с затратами и рисками ксеногенных компонентов, делает ферментативное пищеварение все менее и менее привлекательным для перевода в клинику. В то время как механическая изоляция изначально является благоприятным подходом, существует значительное неравенство в используемых методах, а объем обрабатываемых тканей ограничен размером специализированных центробежных блоков и может зависеть от консистенции оператора2.
В то время как ферментативное пищеварение и центрифугация быстро дают большой объем ASCs, эти изолированные клетки показывают фенотипические изменения, что дает вопросы об их поведении при возвращении к пациенту2. Explant основе метод изоляции ASC, как описано в этом протоколе, таким образом, используется некоторыми группами, в результате чего ASCs мигрируют из небольших кусочков твердой жировой ткани3,11,12. Эта миграция, вероятно, эффект клеток обращается к питательным богатым средствами массовой информации. Как и другие популяции MSCs, ASCs придерживаться пластика, и выжить и размножаться в используемых тканей культуры средств (компоненты ниже), что позволяет их изоляции от других типов клеток от жировой ткани. В то время как меньше клеток первоначально выздоравливают - часто принимая 1 неделю, пока клетки видны на пластине культуры ткани - эти неманипулируемые ASCs будет размножаться в пробирке, что позволяет расширение клеток до клинически релевантных объемов11,12,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3003 tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>serum is batch tested to ensure it supports MSC growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells

Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) являются популяцией мультипотентных клеток, которые могут быть изолированы от различных тканей взрослых и плодов, включая жировую ткань. Как клинически значимый тип клеток, необходимы оптимальные методы для изоляции и расширения этих клеток in vitro. Большинство методов изолировать жировые msC (ADSCs) полагаются на суровые ферменты, такие как коллагеназ, чтобы переварить жировую ткань. Однако, в то время как эффективным при разрушении жировой ткани и принося высокое восстановление ADSC, эти ферменты являются дорогостоящими и могут иметь пагубное влияние на ADSCs - в том числе риски использования ксеногенных компонентов в клинических приложениях. Этот протокол детализирует метод изолировать ADSCs от свежих образцов липоаспирии и абдоминопластики без ферментов. Короче говоря, этот метод опирается на механическую дисассоциацию любой объемной ткани, за которой следует система культуры типа экспланта. ADSCs позволены мигрировать из ткани и на плиту культуры ткани, after which ADSCs можно культивировать и расширить in vitro для любого количества исследований and/or клинических применений.

Используя метод, описанный здесь, ASCs были успешно изолированы от образцов липоаспирии и абдоминопластики(рисунок 1). После трех проходов, изолированные клетки были найдены, чтобы иметь МОРФологию MSC (асимметричная, шпиндельная форма) и фенотип, похожий на ASCs после ферментативного пищеварения (Рисунок 2). Предыдущие исследования нашей группы и других показали, эти ASCs дифференцировать в адипоциты, остеоциты, и нейроны, как и другие MSCs, в том числе ASCs изолированы другими средствами11,21.
В большинстве случаев миграция АСК на пластину культуры тканей может быть визуализирована в течение 3-5 дней с помощью яркой полевой микроскопии. Однако, в некоторых случаях, только редкие клетки будут видны через 7 дней. В редких случаях клетки не мигрируют на тарелку и/или не размножаются до третьего прохода. Этот результат обычно коррелирует с задержкой в обработке образца ткани.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig1.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление изоляции ASC от образцов абдоминопластики и липоаспирати. Образцы абдоминопластики и липоаспиратии были получены в виде сброса ткани после рутинных хирургических процедур. Образцы абдоминопластики были измельчены, после чего либо абдоминопластика, либо образцы липоаспиратии были покрыты как экспланты в носителях культуры тканей. ASCs мигрировали из ткани, к питательным богатым средствами массовой информации. После 1 недели, explants были удалены и ASCs культивируется для вниз по течению экспериментов и / или клинического применения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig1alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig2.jpg"> Рисунок 2: Изолированные AsCs с морфологией MSC и фенотипом. ASCs изолированы ферментов, свободных, explant метод имеют МОРФология MSC и фенотип при проходе 3. () Каки другие MSCs, эти ASCs имеют асимметричную, шпиндель формы, будь то изолированы explant или ферментативные метод (например, коллагеназы). ASCs изолированы с помощью ферментного метода дают более длинную, более узкую морфологию по сравнению с explant изолированных ASCs; последние ближе напоминают MSCs, полученные из других методов изоляции без ферментов, таких как костный мозг, полученных-MSCs. (B) Как и другие MSCs, explant изолированные ASCs являются отрицательными для CD45 и положительные для CD73, CD90, и CD105. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig2alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Этот протокол обеспечивает без ферментов метод для изоляции мезенхимальных стволовых клеток от абдоминопластики и липоаспиробразцовых образцов с помощью метода explant. Отсутствие суровых ферментов или этапов центрифугации обеспечивает клинически значимые стволовые клетки, которые могут быть использованы для исследований в пробирке или переданы обратно в клинику.

Метод, свободный от ферментов для изоляции и расширения человеческих адипосальных стволовых клеток

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Этот протокол обеспечивает простой экономически эффективный способ изоляции ASCs без использования суровых ферментов или центрифугации шаги, которые могут изменить фенотип клетки и поведение. Отсутствие резких шагов дает меньше манипулируемых клеток, чем те, которые изолированы с помощью ферментов и центрифугации, сводя к минимуму вопросы о том, являются ли экспериментальные наблюдения артефактом метода изоляции. Этот метод explant может генерировать клинические соответствующие ASCs, которые будут введены в пациента для лечения различных заболеваний или расширить в жизни позволить себе научно-исследовательских приложений.Трудно в полной мере объяснить метод заминки на словах. Визуальная демонстрация может служить другим ученым хлопот научиться распадать ткани сами. Подобные методы экспланта могут быть использованы для изоляции других популяций MSCs, таких как из пупочной ткани.Чтобы измельчить образцы абдоминопластики, сначала перенесите ткань на крышку стерильной 100-миллиметровой пластины. Затем используйте стерильную иглу, чтобы держать кусок ткани на месте и использовать стерильный скальпель, чтобы разрезать ткань на менее чем один миллиметр штук. Перенесите ткань в свежую трубку и инвертировать или встряхнуть образец пять-шесть раз, чтобы обеспечить смешивание всех слоев.Затем, с помощью стерильного шпателя, перенесите от 2,5 до 5 миллилитров ткани на 100-миллиметровую вакуумную газовую плазму, обработанную пластиной культуры тканей. Измерьте объем образца, вылив в свежую центрифугу трубку. Затем добавьте эквивалентный объем средств культуры тканей к пластине и аккуратно закружить пластину, чтобы смешать содержимое.Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в пять процентов углекислого газа, пока достаточное количество клеток не будут видны на основании пластины. После того, как достаточное количество клеток отмечается на пластине или через семь дней, в зависимости от того, раньше, удалить все оставшиеся части ткани. Далее, культура ASCs в ткани культуры средств массовой информации, пока они не достигнут 70% слияния или до тех пор, пока кластеры становятся плотными, в какой момент клетки должны быть прохождение.Аккуратно промойте пластину 1X фосфатом буферного солевого раствора. Чтобы трипсинизировать адепт клетки, аспирировать фосфат буфера солевого раствора, добавить один миллилитр трипсина дополняется 0,25%EDTA к каждой пластине и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Добавьте небольшое количество мультимедиа к пластине, чтобы отключить трипсин.Затем аккуратно пипетки средства массовой информации трипсина из верхней части пластины вниз, потеря любых слабо прикрепленных клеток от пластины. Чтобы посеять клетки, сначала добавьте мультимедиа в тарелку. Затем добавьте клетки в dropwise образом, а затем вихрем пластины для обеспечения равномерного распределения по всей тарелке.После трех проходов, приступить к потоку цитометрии и дифференциации анализов. После трех отрывков, изолированные ASCs из липоаспирата и абдоминопластики образцов было установлено, что морфология MSC и фенотип, похожий на изолированных ASCs после энзиматической пищеварения. Как и другие MSCs, эксплант изолированные ASCs являются отрицательными для CD45 и положительным для CD73, CD90 и CD105.При заминки ткани, площадь поверхности каждого куска должна быть достаточно большой для ASCs мигрировать из ткани. Это фундаментальные стволовые клетки, которые могут быть использованы для широкого спектра применений. Изолированные ASCs могут быть использованы для любого приложения вниз по течению, in vivo или in vitro.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Трансплантация стволовых клеток в В пробирке Имитация ишемии / реперфузии модели

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Пациент Производные культуре клеток и выделение CD133<sup&gt; +</sup&gt; Предполагаемые раковых стволовых клеток от меланомы

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Выделение стволовых клеток рака из образцов предстательной железы человека

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Изучение рака поджелудочной железы стволовых клеток Характеристики для разработки новых стратегий лечения

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Выделение и культура Расширение опухоли конкретных эндотелиальных клеток

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Усовершенствованный метод Rapid интубации трахеи у мышей

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Выделение и клеточная Фенотипирование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из синовиальной жидкости и костного мозга карликовых свиней

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Создание и пересадку жировой производные стволовых клеток (ASC) листа в диабетической заживление модели

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Форсколин-индуцированной Отек в кишечном органоидов:<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки ответа на наркотики в больных муковисцидозом

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...