Detta protokoll ger ett enkelt kostnadseffektivt sätt att isolera ASCs utan användning av hårda enzymer eller centrifugation steg, som kan förändra cellen fenotyp och beteende. Bristen på hårda steg ger mindre manipulerade celler än de isolerade med hjälp av enzymer och centrifugering, vilket minimerar frågor om huruvida experimentella observationer är en artefakt av isoleringsmetoden. Denna explant metod kan generera kliniska relevanta ASCs att införas i en patient för att behandla en mängd olika sjukdomar eller expandera i livet råd forskningsapplikationer.
Det är svårt att fullt förklara malningsmetoden i ord. Den visuella demonstrationen kan tjäna andra forskare besväret med att lära sig att bryta isär vävnaden själva. Liknande explantmetoder kan användas för att isolera andra populationer av MSC, såsom de från navelvävnader.
För att finhacka bukplastikvävnadsproverna, överför först vävnaden till locket på en steril 100 millimeters platta. Använd sedan en steril nål för att hålla en bit vävnad på plats och använda en steril skalpell för att skära vävnaden i mindre än en millimeter bitar. Överför vävnaden till ett nytt rör och invertera eller skaka provet fem till sex gånger för att säkerställa blandning av alla lager.
Sedan, med en steril spatel, överföra 2,5 till fem milliliter vävnad till en 100 millimeter vakuumgas plasmabehandlad vävnadskulturplatta. Mät provets volym genom att hälla i ett nytt centrifugrör. Därefter lägger du till en motsvarande volym av vävnadskulturmedia till plattan och snurrar försiktigt plattan för att blanda innehållet.
Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i fem procent koldioxid tills ett tillräckligt antal celler ses på basen av plattan. När ett tillräckligt antal celler noteras på plattan eller efter sju dagar, beroende på vilket som är förr, ta bort alla återstående bitar av vävnad. Därefter kultur ASCs i vävnad kultur media tills de når 70%konfluency eller tills kluster blir tät vid vilken tidpunkt cellerna ska passaged.
Skölj försiktigt plattan med 1X fosfatbuffrad saltlösning. För att försöka minska de vidhäftande cellerna, aspirera fosfatbuffrad saltlösning, tillsätt en milliliter trypsin kompletterat med 0,25%EDTA till varje platta och inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter. Lägg till en liten mängd media på plattan för att avaktivera trypsin.
Sedan försiktigt pipettera media trypsin från toppen av plattan nedåt, loosing någon svagt bifogade celler från plattan. För att så cellerna, först lägga till media till plattan. Tillsätt sedan cellerna på ett droppsätt och snurra sedan plattan för att säkerställa jämn fördelning över plattan.
Efter tre passager, fortsätt till flöde cytometry och differentiering assays. Efter tre passager, isolerade ASCs från lipoaspirate och bukplastik prover konstaterades ha en MSC morfologi och fenotyp, liknar isolerade ASCs efter en enzymatisk matsmältning. Liksom andra MSC är explant isolerade ASC negativt för CD45 och positivt för CD73, CD90 och CD105.
Vid malning av vävnaden måste ytan på varje bit vara tillräckligt stor för att ASC:erna ska kunna migrera ut ur vävnaden. Dessa är grundläggande stamceller som kan användas för ett brett spektrum av tillämpningar. De isolerade ASC:erna kan användas för alla nedströmsapplikationer, in vivo eller in vitro.
