Name: an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-12-16T12:00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Författarna har inga erkännanden

Användningen av lipoaspirate och bukplastik prover har godkänts av den institutionella Review Board (IRB) i Rutgers University-Newark campus.
1. beredning av vävnads odlingsmedier
<ol><li>Sterilely förbereder 500 mL vävnads odlingsmaterial före isolering av ASCs. För att förbereda kulturen media, tillsätt 10% definierade fetalt kalv serum (FCS) och penicillin-streptomycin (10 000 U/100 mL) till Dulbecco ' s minimal Essential Media (DMEM) med hög glukos och 2 mM L-glutamin. Mediet kan förvaras vid 4 ° c i upp till 3 veckor och ska alltid användas varmt (mellan rumstemperatur till 37 ° c).<ol>
<li>Om en annan media är att föredra för kulturen i stamcellerna, förbereda det mediet istället.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolering av ASCs från fettvävnad
<ol><li>Få lipoaspirates eller bukplastik prov (s). Efter IRB-godkännande, skaffa sådana prover som kassera vävnad efter olika kirurgiska ingrepp. Transportera lipoaspirates till laboratoriet i vilket kärl kirurgen bort vävnaden; transportera bukplastik prover i en Operations väska eller behållare.</li>
	<li>Förvara provet (-erna) i rumstemperatur i upp till 6 timmar eller vid 4 ° c i upp till 24 timmar om det inte bearbetas omedelbart. Vävnadsprover bearbetas bortom ovan nämnda tider kommer sannolikt att ha en minskad cell avkastning. Håll bukplastik prover fuktiga genom tillsats av 1x steril fosfatbuffrad saltlösning.</li>
	<li>Från denna punkt och framåt, utföra alla steg i ett laminärt flöde huva under aseptiska förhållanden. Använd handskar för personligt skydd. Håll 10% blekmedel, 70% etanol och pappershanddukar i närheten för att snabbt rensa upp alla biologiska spill. Bortskaffas eventuellt överskott av vävnad som Biomedicinskt avfall.</li>
	<li>Finhacka proverna i < 1 mm bitar. Om bukplastik blocket är för stort för att arbeta med, skär en hanterbar storlek av vävnad bort av blocket före mincing. Överför bukplastik vävnaden till locket på en steril 100 mm plåt. Använd en steril nål för att hålla en bit vävnad på plats och använda en steril skalpell att finhacka bitarna av antingen skära eller försiktigt fragmentering bort av bulk vävnad.<ol>
<li>Detta steg är i allmänhet inte behövs för lipoaspirates. Emellertid, om stora vävnad bitar observeras i lipoaspirate, ta bort sådana bitar med sterila Pink och process som ovan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Överför vävnaden till ett nytt rör och Invertera eller skaka provet 5 – 6 gånger för att säkerställa att alla skikt blandas. Valfritt: om lipoaspirate har helt fast, ta bort och kassera olje lagret före blandning.</li>
	<li>Överför 2,5 – 5 mL vävnad till en 100 mm vakuum-gasplasma behandlad vävnads odlings platta (tabell över material). Mät provets volym genom att hälla i ett nytt centrifugerör. Om det behövs, Använd en steril spatel för att hjälpa till med att överföra vävnaden.</li>
	<li>Tillsätt en ekvivalent volym av vävnads odlingsmedier till plattan. Snurra försiktigt plattan för att blanda innehållet.</li>
	<li>Inkubera de pastejer vid 37 ° c i 5% Co2 tills ett tillräckligt antal celler ses på botten av plattan. Över tid, cellerna kommer att migrera inifrån vävnaden på plattan ytan, varvid de kommer att hålla sig till plasten. När de lämnar vävnaden, kommer cellerna att visas som små kluster runt vävnaden bitar.</li>
	<li>Varje 24 h, ta bort så mycket vätska som möjligt och ersätta med en liknande mängd media. Lämna bitar av vävnad på plats, om möjligt.</li>
	<li>När ett tillräckligt antal celler noteras på plattan (> 10 kluster av > 15 – 25 celler på plattan) eller efter 7 dagar, beroende på vilket som är förr, ta bort alla kvarvarande bitar av vävnad.</li>
	<li>Odla ASCs i vävnads odlingsmedier tills de når 70% confluency eller tills klustren blir täta (> 5 täta kluster av celler på plattan, var och en med en diameter på cirka > 500 μm), varvid cellerna ska vara framtade.</li>
</ol>3 kultur av ASCs
<ol><li>Passage av ASCs när den överordnade plattan når cirka 70% sammanlänkning. Var noga med att undvika över confluency av ASC kulturer.</li>
	<li>Skölj plattan försiktigt med 1x fosfatbuffrad saltlösning och trypsinize de sittande cellerna. För att trypsinize cellerna, aspirera fosfatbuffrad saltlösning och tillsätt 1 mL trypsin med 0,25% EDTA till varje tallrik och inkubera vid 37 ° c i 5 min. Efter 5 min, bekräfta de-vidhäftning av mikroskopi. Om cellerna fortfarande är anhängare, returnera cellerna till inkubatorn i ytterligare 5 min.</li>
	<li>Lägg till en liten mängd media (cirka 25% av den totala trypsin volym) till plattan för att avaktivera trypsin, och försiktigt tvätta basen av plattan med hjälp av media/trypsin. För att tvätta plattan, håll plattan i en liten vinkel och försiktigt Pipettera Media/trypsin från toppen av plattan nedåt, lossande varje vecka bifogade celler från plattan. Cellerna kan ompläteras på en 1:3 förhållande eller seedade med en densitet på 120000-500000 celler per tallrik.<ol>
<li>Om sådd baserat på cellantal, överför trypsin/media från plattan till ett koniskt centrifugrör, och pelleten cellerna genom centrifugering vid 300 x g för 7 min. Omsuspendera cellerna i vävnads odlingsmedier (cirka 1 ml per initial platta) och räkna cellerna före sådd. För att räkna cellerna, överför 10 μL av cellsuspensionen till hemocytometern och räkna cellerna som finns i 4 x 4 kvadranten i varje hörn av rutnätet. Genomsnittliga dessa värden tillsammans och multiplicera värdet med 104 för att beräkna cellnumret.</li>
		<li>Lägg till media på plattan innan du sådd cellerna. Tillsätt cellerna på ett droppvis sätt och snurra sedan plattan för att säkerställa jämn fördelning över plattan. Anmärkning: efter 3 passager, de anhängare celler bör visas asymmetriska och spindel formad. ASC fenotyp och beteende kan bekräftas med flödescytometri och differentiering analyser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bekräftelse av ASC fenotyp och beteende med flödescytometri och differentierings analyser<ol>
<li>Flödescytometri<ol>
<li>Samla och pelletera cellerna enligt beskrivningen ovan. Tvätta pelleterat med 1x fosfatbuffrad saltlösning och märk cellerna med tillverkarens rekommenderade volymer av antikroppar. Ett detaljerat protokoll för flödescytometri, ett vanligt laboratorieförfarande, finns här12,14,15.</li>
			<li>Välj ytan markör paneler från följande för att bekräfta ASC fenotyp: negativ för CD14, CD31, CD34, CD45 och CD106; och positivt för CD29, CD36, CD44, CD73, CD90, och CD10516,17,18,19. Närvaron av CD36 och frånvaro av CD106 urskilja ASCs från benmärg-derived MSCs20.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Differentiering analyser: bekräfta Multilinjärt differentiering med hjälp av en msc differentiering kit. Kit finns tillgängliga från flera tillverkare för att bekräfta adipogenic, osteogenic, och chondrogenic differentiering kapacitet. Ändra Kit-tillhandahållna Media var 3 – 4 dagar enligt tillverkarens protokoll för 3 veckor eller tills morfologisk differentiering observeras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Odla cellerna för flera passager; antalet passager som behövs beror på ansökan (s). Vid varje passage, bekräfta MSC cell morfologi och fenotyp med hjälp av ovan nämnda cell ytan markörer, och säkerställa Multilinjärt differentiering kapacitet inte har förlorats. Medan expansionspotentialen skiljer sig mellan givarna kan de flesta exemplen utökas med upp till 6-9 passager.</li>
	<li>Cryopreserve cellerna och förvara i flytande kväve för framtida bruk.</li>
</ol>4 kryopreservering av ASCs
<ol><li>Bered 10 mL frys lösning A och B.<ol>
<li>För frysning lösning A, tillsätt 20% FCS till DMEM med hög glukos.</li>
		<li>För frysning lösning B, tillsätt 20% FCS och 20% Dimetylsulfid (DMSO) till DMEM med hög glukos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pelleten cellerna genom centrifugering vid 300 x g för 5 min. Omsuspendera cellerna i en liten volym av frysning lösning a och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometern som i steg 3.3.1.</li>
	<li>Beräkna den slutliga volymen som cellerna kommer att återsuspenderas i för att nå en slutlig cell koncentration av 500000 – 1000000 celler/mL. Använd frys lösning A för att Omsuspendera pelleten i 50% av den slutliga volymen. Tillsätt långsamt en lika mängd frys lösning B droppvis samtidigt som du agitera röret för att nå den slutliga cellkoncentrationen.</li>
	<li>Omedelbart frysa cellerna i 1 – 2 mL cryovials. Frys kryovialerna i en kontrollerad hastighet frys eller i en frys behållare placerad vid-80 ° c, vilket minskar temperaturen med 1 ° c/min. Efter den kontrollerade frysningen (över natten för en frys behållare), överför cellerna till flytande kväve för långtidslagring.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal/stem+cells+in+drug+therapy:+New+perspective.">Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective.</a> Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).</li><li>Conde-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+Mechanical+Isolation+of+Adipose-derived+Stromal+Vascular+Fraction:+Review+of+Upcoming+Techniques.">Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Hendijani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+An+advantageous+method+for+isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+tissues.">Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues.</a> Cell Proliferation. 50 (2), (2017).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells.">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+a+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+different+methods+of+handling+human+liposuction+aspirate+and+their+effect+on+adipocytes+and+adipose+derived+stem+cells.">In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-Free+Isolation+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).</li><li>Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+effective+strategy+for+the+isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+minimally+manipulated+adipose-derived+stem+cells+for+more+rapid+and+safe+stem+cell+therapy.">A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy.</a> Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discussion+on+adult+mesenchymal+stem+cells+for+drug+delivery:+pros+and+cons.">A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons.</a> Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Barlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+placenta-+and+bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).</li><li>Munoz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feline+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+show+similar+phenotype+and+functions+with+regards+to+neuronal+differentiation+as+human+MSCs.">Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs.</a> Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).</li><li>Amati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+cord+blood:+evaluation+of+in+vitro+quality+parameters+prior+to+clinical+use.">Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14 (2017).</li><li>Bajek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+liposuction+method+influence+the+phenotypic+characteristic+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells.</a> Bioscience Reports. 35 (3), (2015).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Isolation,+Characterization+and+Expansion+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+(ASCs):+An+Overview.">Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).</li><li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal/stem+cells:+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+(IFATS)+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+(ISCT).">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li><li>Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+without+tissue+destruction:+a+non-enzymatic+method.">Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method.</a> Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).</li><li>Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+"Bench+to+Bedside":+Current+Advancement+on+Large-Scale+Production+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">From "Bench to Bedside": Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja

ASCs är en attraktiv källa till MSCs på grund av enkel åtkomst av vävnaden. För både kliniska och forskningsändamål måste forskarna tänka på givarens variationer när de isolerar och odlade dessa celler. Av skäl som ännu inte är klarlagda, MSCs från olika givare visar olika kapacitet att förökar in vitro, som senare kommer att påverka ASC: s migration ut ur fett explantat och spridning kapacitet. Medan variabilitet kan observeras under den tid det tar för ASCs isolerade från dessa enzym-fria djur att nå sammanväxningar, det var sällsynt för ett prov att inte förgöra in vitro-.
Bortom givarens variation, den mest sannolika källan till fel i cellerna för att migrera ut ur vävnaden och/eller föröka sig in vitro är den tid som vävnaden lagrades före bearbetningen. När proverna tilläts sitta i > 12 timmar före bearbetningen eller inte hölls fuktiga mellan skörd och bearbetning, observerades sämre migrations-och spridnings frekvens. De enda prover som ofta misslyckats med att förgöra var bukplastik prover som inte hölls fuktig med en saltlösning: i dessa fall var vävnaden i mitten av vävnads blocket ofta fuktig nog att bearbeta, men ibland behövde kasseras. Det är därför viktigt att hålla vävnaden fuktig från tiden för skörd genom bearbetning.
I de fall där ASCs inte observeras på plattan vid 1 veckors märket, bör fett djur fortfarande avlägsnas från vävnadsodling plattorna så att vävnads nekros uppstår. Ibland finns det för få celler att enkelt identifiera, men dessa få celler kommer att kunna expandera inom kultur systemet. Om cellerna fortfarande inte observeras vid 3 veckor, bör isoleringen betraktas som misslyckad.
I vissa fall, särskilt av bukplastik, är det inte möjligt att få ett verkligt aseptiskt prov på grund av begränsningarna inom den kirurgiska arenan. Om det inte är möjligt att använda ett sterilt kärl för att transportera vävnaden från operationssalen till ett laminärt flödes skydd, är det i allmänhet tillräckligt att avlägsna den yttre 1 cm av vävnaden för att förhindra kontaminering av mikroorganismer. Om bukplastik provet är fäst vid huden, kan huden torkas av med 70% etanol för att sterilisera den ytan innan du malning fettvävnad.
Under malning processen är det viktigt att vävnaden mals i små, fina bitar. Om djur är för stora, kommer det att finnas otillräcklig yta för ASCs att migrera ut ur vävnaden och på plattan. Vidare är det viktigt att vävnaden inte kvar i plattan längre än nödvändigt så att vävnaden blir nekrotisk.
En begränsning av denna metod är användningen av ett enzym (i det beskrivna protokollet, trypsin) för att lossa ASCs under vävnadskultur processen. Andra icke-animaliska härledda enzymer, såsom Accutase, kan bytas ut för att avlägsna behovet av animaliska produkter, men detta kommer att öka kostnaderna för vävnads kulturen. Av denna anledning, bland annat, många grupper undersöker icke-tvådimensionell vävnad kultur metoder såsom bioreaktorer och byggnadsställning-baserade system för att öka MSC tillväxtpotential samtidigt minimera behovet av att lossa cellerna från deras substrat22.
När du flyttar ASCs till kliniken, är en stor begränsning av explantat isoleringsmetod beroendet av en god tillverkningssed (GMP) nivå vävnad kultur anläggning, som många medicinska centra saknar. I dessa fall skulle någon av de självslutna kommersiellt tillgängliga enzym-eller centrifugeringsbaserade metoderna behöva användas. Men eftersom GMP-anläggningar blir vanligare, förväntas denna effekt vara begränsad. Under tiden, även sådana anläggningar som saknar GMP vävnad kulturanläggningar kan överväga att använda explantat metod för att studera ASCs in vitro-: ju mindre manipulation, desto mer besläktad dessa celler är att deras in vivo motsvarigheter11.
Denna metod ger ett enkelt sätt att isolera ASCs från fettvävnad-både lipoaspirates och abdominoplasties-i avsaknad av hårda enzymer eller centrifugering steg. Medan den initiala avkastningen av ASCs är lägre än för andra metoder, kommer ASCs föröka sig in vitro, vilket minimerar effekten av den lägre initiala avkastningen. Avsaknaden av överdriven eller kraftfull manipulation gör att ASCs isoleras på ett sådant sätt som är särskilt relevant, eftersom det finns färre frågor (dvs. om de observerade effekterna beror på cellerna själva eller på cellernas manipulation under isolerings processen ).

Mesenkymala stamceller (MSCs) är en klass av multipotenta adulta stamceller som kan isoleras från olika vuxna och fostervävnader, inklusive från fettvävnad. Dessa celler är en attraktiv celltyp för både grundforskning och kliniska tillämpningar på grund av deras plasticitet att differentiera till celler av alla bakterie skikt in vitro, korsa allogena barriärer, hem till områden av inflammation, och undertrycka inflammation (ses över i Sherman, et al.1). Fett-derived MSCS (ASCs) är särskilt tilltalande på grund av deras lätthet av obtainment, som fettvävnad anses allmänt kassera vävnad efter rutinmässig fettsugning och bukplastik förfaranden. Emellertid, en gång erhållits, proverna är i allmänhet utsätts för hårda förhållanden – antingen enzymatisk tillstånd eller centrifugering – för att isolera ASCs2,3. Denna metod illustrerar ett enkelt tillvägagångssätt för att isolera ASCs med hjälp av en explantmetod, i avsaknad av hårda enzymatiska eller centrifugerande steg.
Den vanligaste metoden för att isolera ASCs består av att tvätta ett fett prov, enzymatiskt smälta provet med kollagenas, centrifugering provet, och slutligen lyseringslösning de röda blodkropparna innan odling av ASCs4. Även effektiv på att isolera en hög avkastning av ASCs, användning av xenogena komponenter (t. ex. enzymatisk matsmältning med kollagenase) anses mer än "minimalt manipulerade" av den amerikanska Food and Drug Administration, och kan innebära risker såsom immunreaktion, förbjuda cellernas användning i kliniken5,6. För att minimera riskerna för xenogena komponenter, många grupper har föreslagit icke-animaliskt framställda, tillverkade enzymer för att smälta fettvävnad. Emellertid, dessa enzymer är fortfarande hårda, och kan förändra cell fenotyp7.
Andra metoder för att isolera ASCs inkluderar höghastighets centrifugering, med krafter så höga som 1 200 x g, och vortexa att isolera ASCs8. Även krafter så låga som 400 x g var tillräckliga för att isolera livskraftiga ASCs9. Medan dessa celler producerar en stor mängd livskraftiga celler, många protokoll misslyckats att förleda efter 14 dagar8. Ytterligare, mekanisk isolering ger färre återvunna celler än enzymatisk matsmältning, men en större andel av isolerade celler var ASCs jämfört med andra celler endogena till fettvävnad vid passage 010.
Isoleringen av en renare, mer livskraftig population av ASCs på kortare tid, tillsammans med kostnader och risker för xenogena komponenter, gör enzymatisk matsmältning mindre och mindre tilltalande för översättning till kliniken. Även mekanisk isolering är initialt en gynnsam metod, det finns betydande skillnader i de metoder som används, och den mängd vävnad bearbetas begränsas till storleken på de specialiserade centrifugalenheter, och kan vara beroende av operatören konsistens2.
Även om både enzymatisk matsmältning och centrifugering snabbt ger en hög volym av ASCs, dessa isolerade celler visar fenotypiska förändringar, vilket gav frågor om deras beteende när de återvände till en patient2. En explantbaserad metod för ASC-isolering, som beskrivs i detta protokoll, är således anställd av vissa grupper, varvid ASCs migrerar ut ur små bitar av solid fettvävnad3,11,12. Denna migrering är sannolikt en effekt av de celler som dras till näringsrika medier. Liksom andra populationer av MSCs, ASCs följa plast, och överleva och förökning i den använda vävnaden kultur media (komponenter nedan), tillåter deras isolering från andra celltyper från fettvävnad. Medan färre celler initialt återvinns-ofta tar > 1 vecka tills cellerna är synliga på vävnadsodling plattan-dessa omanipulerade ASCs kommer att förökade in vitro, vilket möjliggör expansion av cellerna till kliniskt relevanta volymer11,12,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3003 tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>serum is batch tested to ensure it supports MSC growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells

Mesenkymala stamceller (MSCs) är en population av multipotenta celler som kan isoleras från olika vuxna och fostervävnader, inklusive fettvävnad. Som en kliniskt relevant celltyp, optimala metoder behövs för att isolera och expandera dessa celler in vitro-. De flesta metoder för att isolera fett-derived MSCS (adscs) förlitar sig på starka enzymer, såsom kollagenase, att smälta fettvävnad. Men samtidigt effektivt på att bryta ner fettvävnad och ger en hög ADSC återhämtning, dessa enzymer är dyra och kan ha skadlig effekt på adscs-inklusive riskerna med att använda xenogena komponenter i kliniska tillämpningar. Detta protokoll specificerar en metod för att isolera adscs från färska lipoaspirate och bukplastik prover utan enzymer. Kortfattat, denna metod bygger på mekanisk avståndstagande av någon bulk vävnad följt av en explant-typ kultur system. De ADSCs är tillåtna att migrera ut ur vävnad och på vävnadsodling plattan, varefter ADSCs kan odlas och utvidgas in vitro för valfritt antal forskning och/eller kliniska tillämpningar.

Med hjälp av den metod som beskrivs här, ASCs var framgångsrikt isolerade från lipoaspirate och bukplastik prover (figur 1). Efter tre passager, de isolerade cellerna konstaterades ha en MSC morfologi (asymmetrisk, spindel form) och fenotyp, liknande ASCs efter enzymatisk nedbrytning (figur 2). Tidigare studier från vår grupp och andra har visat dessa ASCs att differentiera till adipocyter, osteocyter, och nervceller som andra MSCS, inklusive ASCs isolerade med andra medel11,21.
I de flesta fall kan ASCs migration på vävnads odlingsplattan visualiseras inom 3 – 5 dagar av ljus fältmikroskopi. I vissa fall kommer dock endast glesa celler att synas efter 7 dagar. I sällsynta fall kommer cellerna inte att migrera på plattan och/eller kommer inte att förökar sig förrän den tredje passagen. Detta resultat korrelerar i allmänhet med en försening i bearbetningen av vävnadsprovet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig1.jpg"> Figur 1: schematisk representation av ASC isolation från bukplastik och lipoaspirate prover. Bukplastik och lipoaspirate prover erhölls som kassera vävnad efter rutinmässiga kirurgiska ingrepp. Bukplastik prover var strimlad, varefter antingen bukplastik eller lipoaspirate prover var pläterade som djur i vävnad kultur media. ASCs flyttade ut ur vävnaden, mot näringsrika medier. Efter 1 vecka, de djur avlägsnades och ASCs odlade för nedströms experiment och/eller klinisk tillämpning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig1alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig2.jpg"> Figur 2: isolerade ASCs med en msc-morfologi och fenotyp. ASCs isolerade av den enzym fria, explantmetoden har en MSC-morfologi och fenotyp vid passage 3. (A) liksom andra MSCS har dessa ASCs en asymmetrisk, spindel form, oavsett om den isoleras genom explantat eller enzymatisk metod (t. ex. kollagenas). De ASCs som isolerats med enzym metoden ger en längre, smalare morfologi jämfört med de isolerade ASCs som explantat har. den senare liknar MSCs härrör från andra enzym-fria isoleringsmetoder, såsom benmärg härledda-MSCs. (B) liksom andra MSCS är explants isolerade ASCs negativa för CD45 och positiva för CD73, CD90 och CD105. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig2alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Detta protokoll ger en enzymfri metod för att isolera mesenkymala stamceller från bukplastik och lipoaspirate prover med hjälp av en explantmetod. Frånvaron av starka enzymer eller centrifugeringssteg ger kliniskt relevanta stamceller som kan användas för studier in vitro eller överföras tillbaka till kliniken.

En enzym fri metod för isolering och expansion av humana adipose-härledda mesenkymala stamceller

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Detta protokoll ger ett enkelt kostnadseffektivt sätt att isolera ASCs utan användning av hårda enzymer eller centrifugation steg, som kan förändra cellen fenotyp och beteende. Bristen på hårda steg ger mindre manipulerade celler än de isolerade med hjälp av enzymer och centrifugering, vilket minimerar frågor om huruvida experimentella observationer är en artefakt av isoleringsmetoden. Denna explant metod kan generera kliniska relevanta ASCs att införas i en patient för att behandla en mängd olika sjukdomar eller expandera i livet råd forskningsapplikationer.Det är svårt att fullt förklara malningsmetoden i ord. Den visuella demonstrationen kan tjäna andra forskare besväret med att lära sig att bryta isär vävnaden själva. Liknande explantmetoder kan användas för att isolera andra populationer av MSC, såsom de från navelvävnader.För att finhacka bukplastikvävnadsproverna, överför först vävnaden till locket på en steril 100 millimeters platta. Använd sedan en steril nål för att hålla en bit vävnad på plats och använda en steril skalpell för att skära vävnaden i mindre än en millimeter bitar. Överför vävnaden till ett nytt rör och invertera eller skaka provet fem till sex gånger för att säkerställa blandning av alla lager.Sedan, med en steril spatel, överföra 2,5 till fem milliliter vävnad till en 100 millimeter vakuumgas plasmabehandlad vävnadskulturplatta. Mät provets volym genom att hälla i ett nytt centrifugrör. Därefter lägger du till en motsvarande volym av vävnadskulturmedia till plattan och snurrar försiktigt plattan för att blanda innehållet.Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i fem procent koldioxid tills ett tillräckligt antal celler ses på basen av plattan. När ett tillräckligt antal celler noteras på plattan eller efter sju dagar, beroende på vilket som är förr, ta bort alla återstående bitar av vävnad. Därefter kultur ASCs i vävnad kultur media tills de når 70%konfluency eller tills kluster blir tät vid vilken tidpunkt cellerna ska passaged.Skölj försiktigt plattan med 1X fosfatbuffrad saltlösning. För att försöka minska de vidhäftande cellerna, aspirera fosfatbuffrad saltlösning, tillsätt en milliliter trypsin kompletterat med 0,25%EDTA till varje platta och inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter. Lägg till en liten mängd media på plattan för att avaktivera trypsin.Sedan försiktigt pipettera media trypsin från toppen av plattan nedåt, loosing någon svagt bifogade celler från plattan. För att så cellerna, först lägga till media till plattan. Tillsätt sedan cellerna på ett droppsätt och snurra sedan plattan för att säkerställa jämn fördelning över plattan.Efter tre passager, fortsätt till flöde cytometry och differentiering assays. Efter tre passager, isolerade ASCs från lipoaspirate och bukplastik prover konstaterades ha en MSC morfologi och fenotyp, liknar isolerade ASCs efter en enzymatisk matsmältning. Liksom andra MSC är explant isolerade ASC negativt för CD45 och positivt för CD73, CD90 och CD105.Vid malning av vävnaden måste ytan på varje bit vara tillräckligt stor för att ASC:erna ska kunna migrera ut ur vävnaden. Dessa är grundläggande stamceller som kan användas för ett brett spektrum av tillämpningar. De isolerade ASC:erna kan användas för alla nedströmsapplikationer, in vivo eller in vitro.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcellstransplantation i en In vitro Simulerad ischemi / Reperfusion Modell

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Förmodade Cancer stamceller från melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av cancer stamceller från mänskliga Prostate Cancer Prov

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolering och odling Expansion av Tumörspecifika endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

En förbättrad metod för Rapid Intubation av luftstrupen hos möss

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolering och Cellular fenotypning av mesenkymala stamceller från ledvätska och benmärgen hos minigrisar

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Skapande och Transplantation av en Adipose-derived Stem Cell (ASC) blad i en diabetiker sårläkning modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininducerad Svullnad i Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analys av Läkemedels svar i patienter med cystisk fibros

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...