Name: an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-12-16T12:00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Yazarların hiçbir takdiri yok.

Lipoaspirate ve abdominoplasti örneklerinin kullanımı Rutgers Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır - Newark Kampüsü.
1. Doku Kültürü Ortamının Hazırlanması
<ol><li>ASC'leri izole etmeden önce steril olarak 500 mL doku kültürü ortamı hazırlayın. Kültür ortamını hazırlamak için, Dulbecco'nun yüksek glikoz ve 2 mM L-glutamin içeren minimal esansiyel ortamına (DMEM) %10 tanımlı fetal baldır serumu (FCS) ve Penisilin-Streptomisin (10.000 U/100 mL) ekleyin. Ortam 4 °C'de 3 haftaya kadar saklanabilir ve her zaman sıcak (oda sıcaklığında 37 °C arasında) kullanılmalıdır.<ol>
<li>Kök hücre kültürü için farklı bir ortam tercih edilirse, bunun yerine bu ortamı hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Asc'ların Yağ Dokusundan İzolasyonu
<ol><li>Lipoaspirates veya abdominoplasti örnek(ler) elde edin. IRB onayı alındıktan sonra, çeşitli cerrahi işlemlerden sonra doku atmak gibi örnekler alın. Lipoaspirates'ı hangi damarda cerrah doku çıkardısa laboratuvara nakledin; abdominoplasti örneklerini bir ameliyathane numune çantasına veya konteynerde taşıyın.</li>
	<li>Numuneyi (lar) oda sıcaklığında 6 saate kadar veya 4 °C'de, hemen işlenmezse 24 saate kadar saklayın. Yukarıda belirtilen sürelerin ötesinde işlenen doku örnekleri büyük olasılıkla azalmış bir hücre verime sahip olacaktır. 1x steril fosfat tamponlu tuzlu ilave sina abdominoplasti örnekleri nemli tutun.</li>
	<li>Bu noktadan itibaren, aseptik koşullar altında bir laminar akış başlık tüm adımları yürütmek. Kişisel koruma için eldiven giyin. Biyolojik dökülmeleri hızlı bir şekilde temizlemek için %10 çamaşır suyu, %70 etanol ve kağıt havluları yakınımda saklayın. Biyomedikal atık olarak herhangi bir fazla doku bertaraf.</li>
	<li>Numuneleri < 1 mm'lik parçalar halinde doğrama. Abdominoplasti blok çalışmak için çok büyük ise, kıyma önce blok doku yönetilebilir bir boyutu kesti. Abdominoplasti dokusunu steril 100 mm plakanın kapağına aktarın. Yerinde doku bir parça tutmak için steril bir iğne kullanın ve ya kesme veya yavaşça dökme doku parçalama parçaları kıyma için steril bir neşter kullanın.<ol>
<li>Bu adım genellikle lipoaspirates için gerekli değildir. Ancak, lipoaspirate büyük doku parçaları gözlenirse, steril çalgılar ve yukarıdaki gibi süreç ile bu parçaları kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm katmanların karıştırılmasını sağlamak için dokuyu yeni bir tüpe aktarın ve numuneyi 5-6 kez ters çevirin veya sallayın. İsteğe bağlı: lipoaspirate tamamen yerleşmiş ise, kaldırma ve karıştırma dan önce yağ tabakası atın.</li>
	<li>2,5-5 mL'lik bir dokuyu 100 mm vakum-gaz plazma tedavi doku kültür plakasına(Malzeme Tablosu)aktarın. Taze bir santrifüj tüpüiçine dökerek numunenin hacmini ölçün. Gerekirse, doku transferi ile yardımcı olmak için steril bir spatula kullanın.</li>
	<li>Plakaya eşdeğer miktarda doku kültürü ortamı ekleyin. Yavaşça içeriğini karıştırmak için plaka girdap.</li>
	<li>37 °C'de %5 CO2'de, plakanın tabanında yeterli sayıda hücre bulunana kadar kuluçkaya yat. Zamanla hücreler doku içinden plaka yüzeyine göç eder ve bu noktada plastiğe yapışır. Onlar doku çıkmak gibi, hücreler doku parçaları etrafında küçük kümeler olarak görünür.</li>
	<li>Her 24 saatte bir, mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın ve medya benzer miktarda değiştirin. Mümkünse doku parçalarını yerinde bırakın.</li>
	<li>Plakaüzerinde yeterli sayıda hücre (>10 kümeler > 15-25 hücre plaka) veya 7 gün sonra, hangisi daha erken olursa, kalan tüm doku parçalarını çıkarın.</li>
	<li>Doku kültürü medyasındaki ASC'lerin %70'ine ulaşıncaya kadar veya kümeler yoğun hale gelene kadar (plaka üzerindeki her biri yaklaşık > 500 m çapında olan yoğun hücre kümeleri) bu noktada hücreler geçilecektir.</li>
</ol>3 ASC Kültürü
<ol><li>Ana plaka yaklaşık % 70 birleşim ulaştığında ASC'leri geçiş. ASC kültürlerin biraraya gelmesinden kaçınmaya özen.</li>
	<li>Plakayı 1x fosfat tamponlu tuzlu suyla hafifçe durulayın ve yapışık hücreleri deneyin. Hücreleri denemek için, fosfat tamponlu tuzlu aspire ve her plaka ya% 0.25 EDTA ile Trypsin 1 mL ekleyin ve 5 dakika için 37 °C'de kuluçka. 5 dakika sonra, mikroskopi ile de-adherence doğrulayın. Hücreler hala yapışıksa, hücreleri ek 5 dakika için kuvöze geri döndürün.</li>
	<li>Trypsin'i devre dışı bırakmak için tabağa az miktarda ortam (toplam tripsin hacminin yaklaşık %25'i) ekleyin ve media/trypsin kullanarak plakanın tabanını hafifçe yıkayın. Plakayı yıkamak için, plakayı hafif bir açıyla tutun ve media/tripsin'i plakanın üst kısmından aşağıya doğru hafifçe pipetleyerek, plakadan haftalık bağlı hücreleri gevşetin. Hücreler 1:3 oranında yeniden kaplanabilir veya plaka başına 120.000-500.000 hücre yoğunluğunda tohumlanabilir.<ol>
<li>Hücre sayısına göre tohumlama, tipofin/media'yı konik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 300 x g'de 7 dk. Doku Kültürü ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın (ilk plaka başına yaklaşık 1 mL) ve tohumlamadan önce hücreleri sayar. Hücreleri saymak için, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini hemositometreye aktarın ve ızgaranın her köşesindeki 4 x 4 çeyreğinde bulunan hücreleri sayın. Hücre numarasını hesaplamak için bu değerleri birlikte ortalaman ve değeri 104 ile çarpın.</li>
		<li>Hücreleri tohumlamadan önce tabağa ortam ekleyin. Hücreleri damla gibi ekleyin ve sonra plaka boyunca eşit dağılım sağlamak için plaka girdap. NOT: 3 pasajdan sonra yapışık hücreler asimetrik ve iğ şeklinde görünmelidir. ASC fenotip ve davranış akış sitometri ve farklılaşma tahlilleri kullanılarak teyit edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış sitometrisi ve farklılaşma tahlilleri kullanılarak ASC fenotip ve davranışının teyidi<ol>
<li>Akış sitometrisi<ol>
<li>Yukarıda açıklandığı gibi hücreleri toplayın ve pelet. 1x fosfat tamponlu tuzlu ile peletli yıkayın ve üretici antikor önerilen hacimleri ile hücreleri etiket. Akış sitometrisi için ayrıntılı bir protokol, ortak bir laboratuvar prosedürü, burada bulunabilir12,14,15.</li>
			<li>ASC fenotipini onaylamak için aşağıdakilerden yüzey işaretpanellerini seçin: CD14, CD31, CD34, CD45 ve CD106 için negatif; ve POZITIF CD29, CD36, CD44, CD73, CD90 ve CD10516,17,18,19. CD36 varlığı ve kemik iliği türetilmiş MSCs 20 CD106 ayırt ASCs yokluğu20.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Farklılaşma Tsays: Bir MSC farklılaşma kiti kullanarak çoklu çizgi farklılaşması nı onaylayın. Kitleri adipojenik onaylamak için birden fazla üreticiden mevcuttur, osteojenik, ve kondrojenik farklılaşma kapasitesi. Kit tarafından sağlanan ortamı, üreticinin protokollerine göre 3 hafta boyunca veya morfolojik farklılaşma gözlemlenene kadar her 3-4 günde bir değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültür birden fazla pasajlar için hücreleri; gerekli pasajsayısı uygulamaya bağlıdır. Her pasajda, söz konusu hücre yüzey imanlarını kullanarak MSC hücre morfolojisini ve fenotipini doğrulayın ve çoklu çizgi farklılaştırma kapasitesinin kaybolmadığından emin olun. Genişleme potansiyeli bağışçılar arasında farklılık gösterirken, çoğu örnek 6-9 pasaja kadar genişletilebilir.</li>
	<li>Hücreleri kriyokorunmuş ve ileride kullanılmak üzere sıvı nitrojen de polar.</li>
</ol>4 ASC'lerin Kriyopreservation
<ol><li>10 mL'lik dondurma çözeltisi A ve B hazırlayın.<ol>
<li>Donma çözeltisi A için, yüksek glikozlu DMEM'e %20 FCS ekleyin.</li>
		<li>B'nin dondurulması için yüksek glikozlu DMEM'e %20 FCS ve %20 dimetil sülfür (DMSO) ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 dk. Donma çözeltisi A küçük bir hacim de hücreleri resuspend 300 x g santrifüj ederek hücreleri pelet ve adım 3.3.1 olarak bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Hücrelerin 500.000-1.000.000 hücre/mL'lik son hücre konsantrasyonuna ulaşmak için yeniden askıya alınacağı son hacmi hesaplayın. Son hacmin %50'sinde peleti yeniden askıya almak için donma solüsyonu A'yı kullanın. Son hücre konsantrasyonuna ulaşmak için tüpü kışkırtırken yavaş yavaş eşit hacimli donma çözeltisi B damlacık ekleyin.</li>
	<li>Hemen 1-2 mL cryovials hücreleri dondurmak. Cryovials kontrollü bir hızda dondurucu veya -80 °C'de yerleştirilen dondurucu kabında dondurun, bu da sıcaklığı 1 °C/dk düşürür. Kontrollü donma (bir dondurucu konteyner için bir gecede) sonra, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen hücreleri aktarın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal/stem+cells+in+drug+therapy:+New+perspective.">Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective.</a> Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).</li><li>Conde-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+Mechanical+Isolation+of+Adipose-derived+Stromal+Vascular+Fraction:+Review+of+Upcoming+Techniques.">Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Hendijani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+An+advantageous+method+for+isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+tissues.">Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues.</a> Cell Proliferation. 50 (2), (2017).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells.">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+a+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+different+methods+of+handling+human+liposuction+aspirate+and+their+effect+on+adipocytes+and+adipose+derived+stem+cells.">In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-Free+Isolation+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).</li><li>Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+effective+strategy+for+the+isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+minimally+manipulated+adipose-derived+stem+cells+for+more+rapid+and+safe+stem+cell+therapy.">A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy.</a> Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discussion+on+adult+mesenchymal+stem+cells+for+drug+delivery:+pros+and+cons.">A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons.</a> Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Barlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+placenta-+and+bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).</li><li>Munoz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feline+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+show+similar+phenotype+and+functions+with+regards+to+neuronal+differentiation+as+human+MSCs.">Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs.</a> Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).</li><li>Amati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+cord+blood:+evaluation+of+in+vitro+quality+parameters+prior+to+clinical+use.">Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14 (2017).</li><li>Bajek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+liposuction+method+influence+the+phenotypic+characteristic+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells.</a> Bioscience Reports. 35 (3), (2015).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Isolation,+Characterization+and+Expansion+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+(ASCs):+An+Overview.">Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).</li><li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal/stem+cells:+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+(IFATS)+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+(ISCT).">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li><li>Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+without+tissue+destruction:+a+non-enzymatic+method.">Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method.</a> Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).</li><li>Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+"Bench+to+Bedside":+Current+Advancement+on+Large-Scale+Production+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">From "Bench to Bedside": Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

ASC'ler, dokunun kolay erişemeleri nedeniyle MSC'lerin cazip bir kaynağıdır. Hem klinik hem de araştırma uygulamaları için, bilim adamları bu hücreleri izole ederken ve kültürlendirirken donör değişkenliğini göz önünde bulundurmalıdırlar. Henüz açıklığa kavuşturulması gereken nedenlerden dolayı, farklı bağışçıların MSC'leri in vitro çoğalmak için farklı kapasiteler göstermekte ve bu da ASC'nin yağ eksplant ve prolifelifelasyon kapasitesinden kaynaklanan göçünü etkilemektedir. Bu enzimsiz ekstremitelerden izole edilen ASC'lerin biraraya gelmesi için gereken süre içinde değişkenlik gözlemlenebilirken, bir numunenin in vitro olarak çoğalmaması nadirdi.
Donör değişkenliğinin ötesinde, hücrelerin dokudışına çıkamamasının ve/veya in vitro olarak çoğalmasının en olası kaynağı, dokunun işlemeden önce depolanan süre uzunluğudur. Numunelerin işleme alınmadan önce >12 saat süreyle bekletilmesine izin verildiğinde veya hasat ve işleme arasında nemli tutulmadığında, daha düşük göç ve proliferasyon oranları gözlendi. Sık sık çoğalamayan tek örnekler tuzlu çözelti ile nemli tutulmayan abdominoplasti örnekleriydi: bu durumlarda, doku bloğunun merkezindeki doku genellikle işlenecek kadar nemliydi, ancak bazen atılması gerekiyordu. Bu nedenle işleme yoluyla hasat andan itibaren doku nemli tutmak için önemlidir.
1 hafta işaretinde plakaüzerinde ASC'lerin gözlenmediği durumlarda, doku nekrozu oluşmaması için yağ eksplanlarının doku kültür plakalarından çıkarılması gerekir. Bazen kolayca tanımlamak için çok az hücre vardır, ama bu birkaç hücre kültür sistemi içinde genişletme yeteneğine sahip olacaktır. Hücreler hala 3 hafta gözlenmezise, izolasyon başarısız olarak kabul edilmelidir.
Bazı durumlarda, özellikle abdominoplasti, cerrahi arenaiçinde sınırlamalar nedeniyle gerçek bir aseptik örnek elde etmek mümkün değildir. Eğer dokuyu ameliyathaneden laminar akış kaputuna taşımak için steril bir kap kullanmak mümkün değilse, dokunun dış 1 cm'sinin çıkarılması genellikle mikroorganizma kontaminasyonunu önlemek için yeterlidir. Abdominoplasti örneği cilde bağlıysa, yağ dokusu kıymadan önce bu yüzeyi sterilize etmek için cilt %70 etanol ile silinebilir.
Kıyma işlemi sırasında, doku küçük, ince parçalar halinde kıyılmış olması önemlidir. Ekseforlar çok büyükse, ASC'lerin dokudışına ve plakaya göç etmesi için yeterli yüzey alanı olmayacaktır. Ayrıca, doku nekrotik hale gelmesi için doku gerekli daha uzun plaka kalmaz önemlidir.
Bu yöntemin bir sınırlama doku kültürü süreci sırasında ASCs ayırmak için bir enzim (açıklanan protokol, tripsin) kullanımıdır. Accutase gibi diğer hayvan salite olmayan enzimler, hayvan türetilmiş ürünler için ihtiyaç kaldırmak için değiştirilebilir, ancak, bu doku kültürünün maliyetini artıracaktır. Bu nedenle, diğerleri arasında, çok sayıda grup biyoreaktörler ve iskele tabanlı sistemler gibi iki boyutlu olmayan doku kültürü yöntemleri msc büyüme potansiyelini artırmak için araştırma yaparken onların substrat hücreleri ayırmak için ihtiyacı en aza indirmek22.
Ascs kliniğe taşınırken, eksplant izolasyon yönteminin önemli bir sınırlama iyi bir üretim uygulama (GMP) seviye doku kültür tesisi, birçok tıp merkezleri eksikliği güven. Bu gibi durumlarda, kendi kendine kapalı ticari olarak kullanılabilir enzim veya santrifüj tabanlı yöntemlerden herhangi birinin istihdam edilmesi gerekir. Ancak, GMP tesisleri daha yaygın hale geldikçe, bu etkinin sınırlı olması beklenmektedir. Bu arada, GMP doku kültürü tesisleri eksik bile bu tür tesisler in vitro ASCs eğitimi için explant yöntemi ni kullanmayı düşünebilirsiniz: daha az manipülasyon, daha fazla benzer bu hücrelerin in vivo meslektaşları11vardır .
Bu yöntem, sert enzimler veya santrifüj adımları yokluğunda asc'ları yağ dokusundan (hem lipoaspirates hem de abdominoplastiler) izole etmenin basit bir yolunu sağlar. ASC'lerin ilk verimi diğer yöntemlerden daha düşük olsa da, ASC'ler in vitro çoğalarak düşük başlangıç veriminin etkisini en aza indirir. Aşırı veya güçlü manipülasyon eksikliği, daha az soru olduğundan (örneğin, gözlemlenen etkilerin hücrelerin kendileri mi yoksa hücrelerin izolasyon işlemi sırasında ki manipülasyonundan mı kaynaklandığı) olduğundan, ASC'leri özellikle konuyla ilgili bir şekilde izole eder. ).

Mezenkimal kök hücreler (MSCs) yağ dokusu da dahil olmak üzere çeşitli yetişkin ve fetal dokulardan izole edilebilir multipotent yetişkin kök hücrelerin bir sınıftır. Bu hücreler hem temel araştırma ve klinik uygulamalar nedeniyle kendi plastisite nedeniyle in vitro tüm mikrop katmanlarının hücrelerine ayırt etmek için cazip bir hücre tipi, allojenik engelleri çapraz, inflamasyon alanlarına ev, ve iltihabı bastırmak (Sherman gözden, ve ark.1). Yağ türetilmiş MSC'ler (ASC'ler) özellikle elde etme kolaylığı nedeniyle caziptir, çünkü yağ dokusu genellikle rutin liposuction ve abdominoplasti prosedürleri sonrasında doku ları atmak olarak kabul edilir. Ancak, elde edildikten sonra, numuneler genellikle sert koşullara tabi tutulur - ya enzimatik durum veya santrifüj - amacıyla ASCs2,3izole etmek . Bu yöntem, sert enzimatik veya santrifüj adımları yokluğunda, bir explant yöntemi kullanarak ASC'leri yalıtmak için basit bir yordamı göstermektedir.
ASC'leri izole etmek için en yaygın yöntem bir yağ örneğinin yıkanması, enzimatik olarak örneğin kollajenaz ile sindirilmesi, numunenin santrifüjünün santrifüjünün santrifüjü ve son olarakASC'lerin4.'nün kültüre atılından önce kırmızı kan hücrelerinin lysing'i dir. ASCs yüksek verim izole verimli iken, ksenojenik bileşenlerin kullanımı (örneğin, kollajenaz ile enzimatik sindirim) ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından "minimal manipüle" daha fazla kabul edilir, ve bağışıklık reaksiyonu gibi riskler oluşturabilir, klinikte hücrelerin kullanımını yasaklayan5,6. Ksenojenik bileşenlerin risklerini en aza indirmek için, birçok grup yağ dokusunu sindirmek için hayvan olmayan türemiş, imal enzimler önermiştir. Ancak, bu enzimler hala sert, ve hücre fenotip değiştirebilirsiniz7.
ASC'leri izole etmek için diğer yöntemler arasında yüksek hızlı santrifüj, 1.200 x ggibi yüksek kuvvetler kullanımı veASC'leriizole etmek için girdap lar 8 yer almaktadır. 400 x g gibi düşük kuvvetler bile uygun ASC'leri izole etmek için yeterliydi9. Bu hücreler canlı hücrelerin büyük miktarda üretmek olsa da, birçok protokolleri 14 gün8ötesinde çoğalmak için başarısız oldu. Ayrıca, mekanik izolasyon enzimatik sindirim daha az kurtarılan hücreleri verir, ancak izole hücrelerin daha yüksek bir oranda geçide 010de yağ dokusuna endojen diğer hücrelere göre ASCs edildi.
Daha kısa sürede asc'lerin daha saf, daha canlı bir popülasyonunun izolasyonu, ksenojenik bileşenlerin maliyeti ve riskleri ile birleştiğinde, enzimatik sindirimi kliniğe çeviri için giderek daha az cazip hale getirir. Mekanik izolasyon başlangıçta olumlu bir yaklaşım olsa da, kullanılan yöntemlerde önemli bir eşitsizlik vardır ve işlenen doku hacmi özel santrifüj birimlerinin boyutu ile sınırlıdır ve operatörtutarlılığı2 bağlı olabilir.
Hem enzimatik sindirim hem de santrifüj hızlı bir şekilde yüksek hacimli ASC'ler verirken, bu izole hücreler henotik değişiklikler göstererekhastaya2'ye döndüklerinde davranışları hakkında sorular ortaya çıkar. Asc izolasyon bir ekstrektifi tabanlı yöntem, bu protokolde açıklandığı gibi, böylece ASCs katı yağ dokusu3,11,12küçük parçalar dışarı göç böylece, bazı gruplar tarafından istihdam ediliyor. Bu göç büyük olasılıkla besin açısından zengin ortama çekilen hücrelerin bir etkisidir. MsCs diğer popülasyonları gibi, ASCs plastik yapışır ve hayatta kalmak ve kullanılan doku kültürü medya (bileşenleri aşağıdaki bileşenler), yağ dokusu diğer hücre tiplerinden izolasyon izin. Başlangıçta daha az hücre kurtarılırken – genellikle doku kültürü plakasında hücreler görünene kadar 1 hafta boyunca - bu manipüle edilmemiş ASC'ler in vitro çoğalacak ve hücrelerin klinik olarak ilgili hacimlere genişlemesine izin verecek11,12,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3003 tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>serum is batch tested to ensure it supports MSC growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells

Mezenkimal kök hücreler (MSCs) yağ dokusu da dahil olmak üzere çeşitli erişkin ve fetal dokulardan izole edilebilir multipotent hücrelerin bir nüfus vardır. Klinik olarak ilgili bir hücre tipi olarak, optimal yöntemler izole etmek ve in vitro bu hücreleri genişletmek için gereklidir. Yağ kaynaklı MSC'leri (ADSC) izole etmek için kullanılan yöntemlerin çoğu, yağ dokusunu sindirmek için kollajenaz gibi sert enzimlere dayanır. Ancak, yağ dokusunu parçalamave yüksek ADSC kurtarma verim etkili iken, bu enzimler pahalı ve ADSC üzerinde zararlı etkisi olabilir - klinik uygulamalarda ksenojenik bileşenlerin kullanma riskleri de dahil olmak üzere. Bu protokol, ADSC'leri enzimsiz taze lipoaspirate ve abdominoplasti örneklerinden izole etmek için bir yöntem ayrıntıları. Kısaca, bu yöntem herhangi bir dökme doku ve ardından ekplant tipi kültür sisteminin mekanik ayrıştırma dayanır. ADSC'lerin doku dışına ve doku kültür plakasına göç etmelerine izin verilir, bundan sonra ADSK'lar herhangi bir sayıda araştırma ve/veya klinik uygulama için in vitro olarak kültürlenebilir ve genişletilebilir.

Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntem kullanılarak, ASC'ler lipoaspirate ve abdominoplasti örneklerinden başarıyla izole edilmiştir(Şekil 1). Üç pasajdan sonra izole edilmiş hücrelerin enzimatik sindirimi takiben ASC'lere benzer bir MSC morfolojisi (asimetrik, iğ şekli) ve fenotip olduğu saptandı(Şekil 2). Grubumuz ve diğerleri önceki çalışmalar da dahil olmak üzere diğer ARAÇLAR11,21tarafından izole ASCs dahil olmak üzere, diğer MSCs gibi adipositler, osteositler ve nöronlar ayırt etmek için bu ASCs göstermiştir .
Çoğu durumda, DOKU kültür plakasına giren ASC'ler parlak alan mikroskobu ile 3-5 gün içinde görüntülenebilir. Ancak, bazı durumlarda, sadece seyrek hücreler 7 gün sonra görünür olacaktır. Nadir durumlarda, hücreler tabağa geçirilmez ve/veya üçüncü bölüme kadar çoğalmayacaktır. Bu sonuç genellikle doku örneğinin işlenmesinde bir gecikme ile ilişkilidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig1.jpg"> Şekil 1: ABdominoplasti ve lipoaspirate örneklerinden ASC izolasyonunun şematik gösterimi. Rutin cerrahi işlemler sonrasında doku atılarak abdominoplasti ve lipoaspirate örnekleri alındı. Abdominoplasti örnekleri parçalandıktan sonra doku kültürü ortamlarında abdominoplasti veya lipoaspire örnekleri eksektif olarak kaplandı. ASC'ler dokudan besin açısından zengin medyaya doğru göç ettiler. 1 hafta sonra eksplorler çıkarıldı ve ASC'ler downstream deneyve/veya klinik uygulama için kültürlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig1alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59419/59419fig2.jpg"> Şekil 2: MSC morfolojisi ve fenotip ile izole ASCs. Enzimsiz, eksplant yöntemi ile izole edilen ASC'lerin 3. (A)Diğer MSC'ler gibi, bu ASC'ler de asimetrik, iğ şekline sahiptir, eksplant veya enzimatik yöntemle izole edilmiş olsun (örn. kollajenaz). Enzim yöntemi kullanılarak izole edilen ASC'ler, eksplant izole ASC'lere göre daha uzun ve daha dar bir morfoloji verir; ikincisi daha yakın kemik iliği türetilmiş-MSCs gibi diğer enzimiçermeyen izolasyon yöntemleri, türetilen MSCs benzer. (B) Diğer MSCs gibi, eksplant izole ASCs CD45 için negatif ve CD73, CD90 ve CD105 için pozitif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59419/59419fig2alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Bu protokol, ekstrektif bir yöntem kullanılarak abdominoplasti ve lipoaspirate örneklerinden mezenkimal kök hücrelerin izole imal etmek için enzimsiz bir yöntem sağlar. Sert enzimlerin veya santrifüj adımlarının olmaması, in vitro çalışmalarda kullanılabilecek veya kliniğe geri transfer edilebilen klinik olarak ilgili kök hücreleri sağlar.

İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Bu protokol, hücre fenotipini ve davranışını değiştirebilen sert enzimler veya santrifüj adımları kullanmadan ASC'leri izole etmek için basit bir maliyet etkin bir yol sağlar. Sert adımların olmayışı, enzimler ve santrifüj kullanılarak izole edilenhücrelerden daha az manipüle edilmiş hücreler emerek, deneysel gözlemlerin izolasyon yönteminin bir eseri olup olmadığı sorularını en aza indirir. Bu eksplant yöntemi çeşitli hastalıkları tedavi etmek veya yaşam da araştırma uygulamaları göze genişletmek için bir hastaya tanıtılacak klinik ilgili ASCs oluşturabilir.Kıyma yöntemini kelimelerle tam olarak açıklamak zordur. Görsel gösteri diğer bilim adamlarına da dokuyu parçalamayı öğrenme güçlükleri sunabilir. Benzer eksplant yöntemleri, göbek dokuları gibi mscs diğer popülasyonları izole etmek için kullanılabilir.Abdominoplasti doku örneklerini kıymak için önce dokuyu steril 100 milimetrelik bir plakanın kapağına aktarın. Sonra yerde doku bir parça tutmak için steril bir iğne kullanın ve bir milimetreden daha az parçalar halinde doku kesmek için steril bir neşter kullanın. Yeni bir tüp ve ters veya tüm katmanların karıştırılmasını sağlamak için örnek beş ila altı kez sallamak doku aktarın.Sonra, steril bir spatula ile, 100 milimetre vakum gaz plazma tedavi doku kültür plaka doku 2,5 ila beş mililitre aktarın. Taze bir santrifüj tüpüiçine dökerek numunenin hacmini ölçün. Daha sonra, plakaya eşdeğer bir doku kültürü ortamı ekleyin ve düzgünce içeriğini karıştırmak için plakayı döndürün.Plakanın tabanında yeterli sayıda hücre görülene kadar plakayı %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Yeterli sayıda hücre tabakta veya yedi gün sonra , hangisi daha erken olursa, kalan tüm doku parçalarını çıkarın. Daha sonra, doku kültürü medyasındaki ASC'ler %70 biraraya gelene veya kümeler yoğun hale gelene kadar hücrelerin hangi noktada geçeceğini gösterene kadar kültür.Plakayı 1X fosfat tamponlu tuzlu suyla hafifçe durulayın. Yapışık hücreleri denemek için, fosfat tamponlu tuzlu aspire, her plaka için% 0.25 EDTA ile takviye tripsin bir mililitre ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Trypsin'i devre dışı bırakmak için plakaya az miktarda ortam ekleyin.Daha sonra hafifçe plakanın üstünden aşağı doğru medya trypsin pipet, plaka herhangi bir zayıf bağlı hücreleri kaybetme. Hücreleri tohumlamak için, önce plakaya ortam ekleyin. Daha sonra, damla gibi hücreleri ekleyin ve daha sonra plaka arasında eşit dağılımı sağlamak için plaka girdap.Üç pasajdan sonra, sitometri ve farklılaşma tahlilleri akışına devam edin. Üç pasajdan sonra, lipoaspirate ve abdominoplasti örneklerinden izole ASC'lerde enzimatik bir sindirimi takiben izole ASC'lere benzer bir MSC morfolojisi ve fenotip saptandı. Diğer MSC'ler gibi, explant yalıtılmış ASC'ler CD45 için negatif ve CD73, CD90 ve CD105 için pozitiftir.Doku kıyma zaman, her parçanın yüzey alanı ascs doku dışına göç için yeterince büyük olmalıdır. Bunlar, çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilen temel kök hücrelerdir. İzole ASC'ler herhangi bir downstream uygulaması için kullanılabilir, in vivo veya in vitro.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Farelerde Trakea hızlı intübasyon için geliştirilmiş bir yöntem

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Oluşturma ve diyabetik yara iyileşmesi manken bir yağ elde edilen kök hücre (ASC) Sheet nakli

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...