Name: evaluation of colorectal cancer risk and prevalence by stool dna integrity detection
Uploaded: 2020-06-08T12:30:00
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作者没有承认。

2013年至2015年，在梅尔多拉（FC，意大利FC）的科罗马诺洛科学组织（IRST）招募了患者。注册患者进入 IRSTB002 协议，经 IRST 道德委员会 - IRCCS AVR （25/10/2012，第 1 条） 批准。所有方法均按照相关准则和条例执行。所有患者均获得书面知情同意。
1. 从凳子中提取DNA
<ol><li>使用工具包准备凳子样本（参见材料表）。根据制造商的说明，通过执行萃取来选...

<ol>
	<li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Genetics+of+Colorectal+Cancer.">Molecular Genetics of Colorectal Cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).</li><li>Sears, C. L., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbes,+Microbiota,+and+Colon+Cancer.">Microbes, Microbiota, and Colon Cancer.</a> Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).</li><li>Levin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Surveillance+for+the+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Adenomatous+Polyps,+2008:+A+Joint+Guideline+From+the+American+Cancer+Society,+the+US+Multi-Society+Task+Force+on+Colorectal+Cancer,+and+the+American+College+of+Radiology.">Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology.</a> Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).</li><li>Bosch, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tests+for+colorectal+cancer+screening.">Molecular tests for colorectal cancer screening.</a> Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).</li><li>Ahlquist, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+colorectal+neoplasia.">Molecular detection of colorectal neoplasia.</a> Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).</li><li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+multiple+molecular+tests+to+detect+colorectal+cancer+in+stool.">Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).</li><li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+cancer+by+a+quantitative+fluorescence+determination+of+DNA+amplification+in+stool.">Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool.</a> Neoplasia. 6, 536-540 (2004).</li><li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescence+determination+of+long-fragment+DNA+in+stool+as+a+marker+for+the+early+detection+of+colorectal+cancer.">Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer.</a> Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).</li><li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+DNA+for+noninvasive+diagnosis+of+colorectal+cancer+in+immunochemical+fecal+occult+blood+test-positive+individuals.">Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).</li><li>De Maio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+and+stool+nucleic+acid+analysis+for+colorectal+cancer+diagnosis.">Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).</li><li>Rengucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+stool+DNA+integrity+method+for+early+colorectal+cancer+diagnosis.">Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).</li></ol>

先前的研究已经表明，由手动和半自动方法提取的粪便的DNA完整性分析，可以代表早期发现结肠直肠病变的替代方法,87、8、9、10、11、12。,9,10,11,12多年来，为检测结肠直肠癌开发了分子、非侵入性筛查测试，但由于方法耗时，与其他筛查测试相比?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.
The first&#160;affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

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Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

结肠直肠癌（CRC）源于一个多步骤的过程，其中健康的上皮慢慢发展成腺瘤或息肉，随着时间的推移，它逐渐发展成恶性癌。,2尽管CRC的发病率很高，但在过去十年中，死亡人数呈下降趋势。事实上，筛查计划采用的早期诊断工具已导致早期发现和去除肿瘤前腺瘤或息肉4。然而，由于不同的技术限制，这些方法都不是最佳的。事实上，为了提高灵敏度和特异性，许多粪便DNA测试都是单独提出的，或与当前常规诊断测试55、66结合提出。
通常，健康的粘血症会排入粪便流中凋亡的结肠细胞，而患病的粘卵菌会去角质非凋亡结肠细胞。长度为200bp或以上的片段是非凋亡DNA的特征。这种DNA被称为长DNA（L-DNA），已成为CRC早期诊断的可利用生物标志物。L-DNA可以从粪便标本中分离出来，并使用体外诊断FL-DNA试剂盒77、8、9、10、11、128,9,10,11,12进行qPCR量化。
该测试包括两个检测FL-DNA片段的检测，范围从138bp到339bp。每个测定允许放大FL-DNA（FAM）以及尖峰DNA（HEX）。为了确保所有片段的最佳放大，测试分为两个检测（称为"A"和"B"）。A检测检测APC基因（NM_001127511）的外子14和TP53基因（NM_001276760）的外子7片段。B检测检测出APC基因（NM_001127511）的外子14片段和TP53基因（NM_001276760）的外子5和8的两个区域。测定不区分检测到的区域。尖峰DNA对应于Oncorhynchus keta鲑鱼DNA，并能够验证手术是否正确，并检查是否存在抑制剂，从而可能产生假阴性结果。使用标准曲线方法通过绝对定量评估FL-DNA浓度，并表示为ng/反应。
FL-DNA方法是一种非侵入性和廉价的粪便DNA测试，结合免疫化学为基础的粪便隐匿血测试（iFOBT），目前用于CRC筛查程序，并允许更好地预测CRC和/或高风险腺瘤病变12。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1051px;" width="1051">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free)</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:525px;">Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Absolute Ethanol (quality of analytical degree)</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reagent required for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EasyPGX analysis software version 2.0.0</td>
			<td style="width:140px;">Diatech Pharmacogenetics</td>
			<td>RT800-SW</td>
			<td>Analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips</td>
			<td style="width:140px;">Diatech Pharmacogenetics</td>
			<td style="width:119px;">RT803</td>
			<td>Instrument recommended for the Real Time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">EasyPGX qPCR instrument 96&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Diatech Pharmacogenetics</td>
			<td style="width:119px;">RT800-96</td>
			<td>Instrument recommended for the Real Time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">EasyPGX ready FL-DNA</td>
			<td style="width:140px;">Diatech Pharmacogenetics</td>
			<td style="width:119px;">RT029</td>
			<td>Kit required for the Real Time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 &#181;L)</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Powder-free disposable gloves</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">QIAamp Fast DNA Stool</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">51604</td>
			<td>Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 &#181;L)</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Thermal block e.g. EasyPGX dry block</td>
			<td style="width:140px;">Diatech Pharmacogenetics</td>
			<td style="width:119px;">RT801</td>
			<td>Instrument required for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Diatech Pharmacogenetics</td>
			<td style="width:119px;">RT802</td>
			<td>Instrument required for DNA extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of colorectal cancer risk and prevalence by stool dna integrity detection

如今，凳子DNA可以通过几种方法进行分离和分析。通过qPCR测定可以检测粪便中DNA的长片段，它提供了出现前肿瘤或肿瘤性结肠直肠病变的可靠概率。这种方法，称为荧光长DNA（FL-DNA），是一个快速，非侵入性的程序，是一个改善的主要预防系统。该方法基于对基因组DNA特定靶点进行定量扩增，对粪便DNA完整性进行评估。特别是，对超过200bp的DNA片段的评估可以检测出具有极高特异性的结肠直肠病变患者。然而，该系统和所有目前可用的粪便DNA测试提出了一些需要解决的一般问题（例如，应进行测试的频率和在每个时间点为每个个体收集的粪便样本的最佳数量）。然而，FL-DNA的主要优点是有可能将其与目前用于CRC筛查程序的测试（称为免疫化学基粪便隐匿血测试（iFOBT）结合使用。事实上，两个测试都可以在同一样本上进行，从而降低成本，并更好地预测结肠直肠病变的最终存在。

该协议的工作流如图1所示。工作流根据这些步骤结果提供两个控制步骤和不同的操作。首先，如果样本显示不适合的控件，则必须重复放大。其次，如果放大被抑制，样品必须从开始再加工或归类为无价值。
图 2显示了正负样本产生的荧光曲线。（A） 所示是合适的正样本的示例。HEX 通道上的采样信号在可接受的范围内。正信号高于 FAM ...

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Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

提出的诊断FL-DNA试剂盒是一种节省时间和用户友好的方法，用于确定存在结肠直肠癌病变的可靠概率。

通过大刀DNA完整性检测评估结肠直肠癌风险和患病率

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

此方法允许通过非侵入性方法检测结肠直肠肿瘤病变患者。特别是，这项测试允许，与目前用于结肠直肠癌筛查计划的测试，以更好地预测癌症的存在或异常病变的较高风险。为了开始此协议，在小型离心机上以干燥格式将每个正对照、标准DNA和尖峰DNA的等分分离10秒钟。用 750 微升水重新暂停正控。重新使用尖峰DNA，用作外源性内部控制，以测试抑制剂的存在，用100微升水。对于标准曲线，用 100 微升水重新暂停干燥标准，然后从库存溶液开始进行四个 1：5 稀释。然后，小心地旋转试剂15秒，并在微型离心机中离心机中离心机10秒。要进行完全的再暂停，请将液体试剂在室温下存放 30 分钟，然后再使用。为了准备1倍尖峰DNA控制，将5微升FL-DNA尖峰与45微升无菌水混合。对于样品，将每个样品的75微升与50微升的1倍尖峰DNA混合，产生125微升的总体积。首先，打开 qPCR 操作软件。要设置板，请将第一栏中所有八个位置的井型设置为标准。将 A2 和 B2 油井的井型设置为 NTC。将正控件 C2 和 D2 的井类型设置为"未知"。并设置所有其他位置的井类型为"未知"。选择所有 96 个职位。添加染料、FAM 和 HEX，然后单击"同步板"。然后设置热配置文件，如提供。准备所需数量的8井条，其中包含完整的冻干扩增混合物，并针对特定的用于人类DNA和内部控制的特定底剂和探针。要将内装物放在管的底部，请将条形离心 10 秒钟。轻轻地从条子上取下密封件，确保不会丢失任何颗粒。然后在负控制井中加入25微升水。25微升样品DNA样本井和25微升正对照DNA对正控制井。对于标准曲线，在每个专用井中添加 25 个标准 1、2、3 和 4 微升。使用 8 条扁平光盖小心地关闭所有条带和涡流几秒钟。将条形离心 10 秒钟，将它们加载到仪器中，然后开始运行。在运行结束时，对于 FAM FL-DNA A 和 HEX IC，选择列、A、C、E 和 G.对于 FAM FL-DNA B 和 HEX IC，选择列、B、D、F 和 H.对于标准数量的起始量，为 A1 和 B1 孔设置 10 个 nanogram，为 C1 和 D1 选择每个反应 2 个 nanogram，对于 E1 和 F1 的每个反应设置 4 个 nanogram，并且 G1 和 H1 的每个反应点为零 8 南图。然后，对于 FAM 和 HEX 通道，将阈值荧光值设置为 150。在"结果表"框中，单击"列选项"，然后"选择全部"，然后"确定"，以获取两个通道中的结果，这些通道具有各自的 Cq 和增量 R 最后值，这些值由实时 qPCR 仪器软件提供。增量 R 最后对应于与最后一个放大周期规范化的荧光值。在"结果表"框中，右键单击表以打开上下文菜单。单击"发送到 Excel"导出原始数据。然后上传 Excel 文件到专用分析软件上，以自动计算 FL-DNA 数量。从 iFOBT 和 FL-DNA 值对每个患者的估计相结合，结肠直肠癌的风险。合适的正样本的荧光曲线在可接受的范围内显示 HEX 通道（即内部控制）上的样本信号。正信号高于 FAM 通道的阈值，显示目标基因的放大。合适的负样本的荧光曲线显示 HEX 通道上可接受的范围内的样本信号。负控制信号低于 FAM 通道的阈值。另一方面，不适合的样本的曲线显示的样本信号不在 HEX 通道上的可接受范围内。很可能是由于潜在的抑制。因此，必须从提取开始重复此示例。软件分析输出表显示 Mix A 和 Mix B 在反应控制、临床样本和运行质量控制结果的 FL-DNA 浓度方面的数据。样本四没有任何结果，因为它没有通过质量控制。必须重复和重新分析它。将用于尖峰控制的控制的 DNA 重新用于标准曲线时，请小心。当将不同的DNA分布到8井条时，以及在结果分析部分的分子检测过程中。此方法必须与 iFOBT 测试相结合进行，以便更好地评估结肠直肠肿瘤病变，必须使用相同的粪便样本进行。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

无细胞DNA完整性分析尿样中

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

科研

癌症研究

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

在直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

遗传工程小鼠模型的散发性结肠直肠癌

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

基于免疫荧光显微镜的瞬时和持久双链 dna 损伤 dna 修复过程的表征

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

转移性结直肠癌患者循环微 rna 自定义面板的检测

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

荧光肽酶谱法检测蛋白酶活性

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

超声成像对小鼠肺肿瘤进展的检测

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Establishing a Competing Risk Regression Nomogram Model for Survival Data

为生存数据建立竞争风险回归 Nomogram 模型

The Kaplan&#8211;Meier method and Cox proportional hazards regression model are the most common analyses in the survival framework. These are relatively ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

大肠癌HT29衍生癌症干细胞类肿瘤球中的驱动基因发现

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...