Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

E.J.N.G. معتمد من قبل ويلكوم ترست (منحة 106098/Z/14/Z). وقدمت مصادر التمويل الأخرى بثقة SMA (SMA اتحاد المملكة المتحدة؛ T.H.G. & Y-t. حاء) وأوروبا SMA (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.) وفي جامعة أدنبرة النشر المكتبي في الطب الدقة (T.H.G.، ول & A.M.M.) ومركز ماكدونالد Euan للبحوث في مجال الأمراض العصبية الحركية (T.H.G).

الأنسجة لهذا الإجراء تم الحصول عليها من دراسات أجريت على الحيوانات التي أقرتها لجنة الأخلاقيات الداخلية في جامعة أدنبرة، وأجريت في التوافق مع المؤسسية ولوائح "وزارة الداخلية في المملكة المتحدة" تحت السلطة ذات الصلة الشخصية وتراخيص للمشاريع.
ملاحظة: هذا البروتوكول قد تم تح...

<ol>
	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

مع التصميم التجريبي المناسب وتدابير المراقبة والتحليل الإحصائي، يمكن استخدام النشاف الغربية لتقديم تقديرات كمية موثوقة للتعبير البروتين داخل وفيما بين مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. ويهدف البروتوكول يصف لنا في المخطوطة الحالية كمبدأ توجيهي للباحثين يبحث استخدام الغربية النشاف ?...

النشاف الغربية هو أسلوب الذي يستخدم عادة لكشف وتحديد التعبير البروتين، بما في ذلك في هوموجيناتيس الأنسجة أو مقتطفات. على مر السنين، أدى هذا الأسلوب إلى العديد من التطورات في مجال البحوث الأساسية والسريرية على حد سواء، حيث يمكن استخدامه كأداة تشخيصية لتحديد وجود المرض1،2. النشاف الغربية وصفت أول مرة في عام 1979 كوسيلة لنقل البروتينات من المواد الهلامية polyacrylamide لأوراق النيتروسليلوز وبعد ذلك وضع تصور البروتينات باستخدام الأجسام المضادة الثانوية التي تم بالاشعاع المسمى أو مترافق ب fluorescein أو البيروكسيديز3. من خلال تطوير أدوات متوفرة تجارياً ومعدات، تم الطرق الغربية النشاف متزايدة موحدة ومبسطة على مر السنين. والواقع أن التقنية الآن سهولة يؤديها العلماء مع تباين الخلفيات والمستويات من الخبرة. ومع ذلك، كما هو الحال مع العديد من تقنيات تجريبية مماثلة، نتائج التحليلات الغربية وصمة عار بسهولة يتأثر بالاختيارات في تصميم وتنفيذ التجربة. ولذلك، من المهم أن إمكانية الحصول على أساليب موحدة النشاف الغربية لا تحجب الحاجة إلى تخطيط دقيق التجريبي وتصميم. اعتبارات تجريبية تشمل، ولكن ليست إعداد محدودة إلى، عينة والمناولة والتحديد والتحقق من الأجسام المضادة للكشف عن البروتين وكفاءة نقل جل لغشاء خاصة صغيرة أو كبيرة (< 10 أو > كاتشين 140) بروتينات4،5،،من67،،من89. جودة البروتين من العينة الأصلية تلعب دوراً هاما في تحديد نتائج تحليل لطخة غربية اللاحقة. كما يمكن استخراج البروتين من مجموعة متنوعة واسعة من عينات والمصادر، بما في ذلك خطوط الخلايا والأنسجة من النماذج الحيوانية والأنسجة البشرية بعد الوفاة، مطلوب الاتساق في المناولة والتجهيز للحصول على النتائج استنساخه. على سبيل المثال، عند التخزين على المدى الطويل من عينات لاستخراج البروتين المطلوب، من المهم أن ندرك أنه على الرغم من أن البروتين مستقرة بصفة عامة في-80 درجة مئوية، كانت الاختلافات في الاستقرار البروتين بين البروتينات المستخرجة وأنسجة سليمة في-80 درجة مئوية 10من المبلغ عنها. وعلاوة على ذلك، للحصول على تقديرات استنساخه من كميات البروتين، يتفق تجانس العينات أمر حاسم. قد يكون مطلوباً الاستفادة المثلى من تحلل مختلف المخازن المؤقتة وتجانس أساليب (مثل دليل التجانس مقارنة بأساليب مؤتمتة) قبل البدء في تجربة كمية على نطاق واسع.
استراتيجيات التطبيع لتصحيح لتقلب تحميل وتقدير كمية البروتين ضرورية للحصول على نتائج قوية وكمية البروتين التعبير. التدبير المنزلي البروتينات مثل β-أكتين، α-tubulin، β-tubulin ونازعه جليسيرالديهيدي-3-الفوسفات (جابده) تقليديا قد استخدمت لتطبيع مستويات البروتين للقياس الكمي. ومع ذلك، تطبيع للبروتينات التدبير المنزلي محددة لأغراض القياس الكمي قد انتقدت متزايدة على مدى السنوات القليلة الماضية11،12. على سبيل المثال، يمكنك تغيير التعبير عن التدبير المنزلي البروتينات عبر مراحل تنموية مختلفة13،14، عبر أنسجة من نفس الحيوان4، وفي إطار مختلف الأمراض الشروط4،15 ،،من1617. ولذلك، استخدام البروتينات التدبير المنزلي محددة يحد من الإمكانيات لإجراء مقارنات أكثر تعقيداً بين التعبير البروتين من أنسجة مختلفة، في تيميبوينتس مختلفة وفي ظل مختلف الظروف التجريبية. كبديل للبروتينات التدبير المنزلي لعنصر التحكم للبروتين تحميل الاختلاف هو استخدام وصمة مجموع البروتين (TPS) تلك التسميات ويتصور جميع البروتينات الموجودة في عينة. يسمح TPS تطبيع إشارة استناداً إلى تحميل مجموع البروتين بدلاً من مستويات البروتين محددة واحدة والتحديد الكمي لإشارة النقاط التجارية ولذلك ينبغي أن تكون قابلة للمقارنة واستنساخه بغض النظر عن حالة تجريبية، ونوع العينة أو تيميبوينت الإنمائية . أمثلة من البقع مجموع البروتين S بونسو، الهلام خالية من وصمة عار وأخذ R-350، سيبرو-روبي، ابيكوككونوني، الأسود أميدو و Cy5 (إعادة النظر في الرقم 18). كل من هذه الأساليب مزايا محددة وقيود واختيار أسلوب يعتمد على الوقت والأدوات المتاحة، فضلا عن الإعداد التجريبية4،18.
بالإضافة إلى استخدام النقاط التجارية تصحيح لتحميل داخل الغشاء والتغير الكمي، فإنه قد يكون من الضروري على مقارنة العينات بين الأغشية المختلفة، لا سيما عند إجراء تحليل التعبير البروتين على نطاق واسع. ومع ذلك، قد إدخال التغير في عوامل مثل جسم ملزمة الكفاءة ومجموع البروتين وصمة عار كثافة المزيد من تقلب بين بروتين العينات التي يتم تحليلها في المواد الهلامية منفصلة والأغشية. التقدير الكمي قوية في هذه الحالة، من الضروري لذلك إدخال خطوة تطبيع أخرى تستأثر بتباين بين الغشاء. هذا يمكن أن يتحقق بها بما في ذلك معيار تحميل داخلية في كل من الأغشية التي تم تحليلها بشكل منفصل أن تظل ثابتة عبر التجارب. هذا المعيار يمكن أن تتخذ شكل أي بروتين ليساتي التي يمكن الحصول عليها بكميات كافية لاستخدامها عبر جميع الأغشية المدرجة في هذه التجربة. هنا، نحن نستخدم الدماغ الماوس (التي تم الحصول عليها من 5 يوم من العمر مكافحة الفئران)، كما هو سهولة تجانس المخ والبروتين التي تم الحصول عليها ليستي يحتوي على كمية كبيرة من البروتين بتركيز عال. تحميل معياراً داخلية في ثلاث نسخ يسمح عينات في الأغشية منفصلة إلى تطبيع ومقارنة مباشرة.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة التي قمنا بتطوير للسماح لنا بإجراء مقارنات معقدة من البروتين التعبير التباين عبر الأنسجة المختلفة، ونماذج الماوس (بما في ذلك نماذج المرض)، وتيميبوينتس الإنمائية19. عن طريق الجمع بين TPS فلورسنت باستخدام التحميل الداخلية القياسية، كنا قادرين على التغلب على القيود القائمة في عدد العينات والظروف التجريبية التي يمكن مقارنتها في تجربة واحدة. يوسع هذا النهج استخدام التقنيات التقليدية لطخة غربية، مما يسمح للباحثين استكشاف أفضل تعبير البروتين عبر مختلف الأنسجة والعينات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

النشاف الغربية هو أسلوب الذي يستخدم عادة لكشف وتحديد التعبير البروتين. على مر السنين، أدى هذا الأسلوب إلى العديد من التطورات في مجال البحوث الأساسية والسريرية على حد سواء. ومع ذلك، كما هو الحال مع العديد من تقنيات تجريبية مماثلة، نتائج التحليلات الغربية وصمة عار بسهولة يتأثر بالاختيارات في تصميم وتنفيذ التجربة. البروتينات التدبير المنزلي محددة استخدمت تقليديا لتطبيع مستويات البروتين للقياس الكمي، ومع ذلك، هذه عددا من القيود ولذلك انتقادات متزايدة خلال السنوات القليلة الماضية. هنا، نحن وصف بروتوكول مفصلة التي قمنا بتطوير للسماح لنا بإجراء مقارنات معقدة من البروتين التعبير التباين عبر الأنسجة المختلفة، ونماذج الماوس (بما في ذلك نماذج المرض)، وتيميبوينتس التنموية. باستخدام وصمة فلورسنت مجموع بروتين والاستعانة تحميل الداخلية القياسية، فمن الممكن للتغلب على القيود القائمة في عدد العينات التي يمكن مقارنتها في التجارب ومنهجية مقارنة مستويات البروتين عبر مجموعة من الظروف التجريبية. يوسع هذا النهج استخدام التقنيات التقليدية لطخة غربية، مما يسمح للباحثين استكشاف أفضل تعبير البروتين عبر مختلف الأنسجة والعينات.

نحن تشمل أمثلة على استخدام النقاط التجارية ومعيار داخلية تيسير إجراء المقارنات لمستويات البروتين عبر الأنسجة والنقاط الزمنية. ويبين الشكل 1 النتائج من النشاف الغربية في البروتينات المستخرجة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة (بعد الولادة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

ويصف هذا الأسلوب نهجاً قويا واستنساخه لمقارنة مستويات البروتين في الأنسجة المختلفة وفي تيميبوينتس التنموية المختلفة باستخدام نهج blotting غربية كمية موحدة.

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لمعالجة الأسئلة الهامة في البحوث الأساسية والسريرية من خلال النظر في التعبير البروتيني عبر الأنسجة ونقاط الزمن المختلفة. لتنفيذ كمية موثوقة النشاف الغربية، ونحن الجمع بين وصمة عار البروتين الكلي الفلورسنت مع عنصر تحكم التحميل الداخلية. هذا يتغلب على القيود التي تنشأ عند مقارنة الأنسجة المختلفة عبر الظروف التجريبية.لاستخراج البروتينات من عينات الخلايا أو الأنسجة المجمدة ، اذاب العينات ناقص 80 درجة على الجليد قبل غسل العينات حسب الاقتضاء ، وفقا للجدول. باستخدام المجانسة الكهربائية المحمولة مع مبيد البولي بروبلين، التجانس العينات غسلها، شطف الآفات في الماء المقطر المزدوج وتجفيف مع الأنسجة النظيفة بين العينات. اترك العينات على الجليد لمدة 10 دقائق، تليها الطرد المركزي.ثم، نقل البروتين عينة التي تحتوي على supernatant إلى أنبوب جديد على الجليد دون إزعاج بيليه. لتحديد كمي من تركيز البروتين، ووضع معايير الألبومات مصل الأبقار في زيادة تركيزات في ثلاث نسخ، وإضافة ميكرولتر واحد من كل عينة البروتين في مكررة إلى الآبار المناسبة من لوحة بصرية 96 جيدا. احتضان البروتين على كتلة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو أكثر إذا كان من المتوقع أن يكون تركيز البروتين منخفضًا وقياس الامتصاص عند 560 نانومتر على قارئ لوحة.تصدير قياسات قارئ لوحة وحساب تركيز البروتين من خلال مقارنة متوسط قيم الامتصاص لكل عينة إلى منحنى قياسي تم الحصول عليها باستخدام معيار البروتين. لتطبيع كمية البروتين، وإعداد التخفيفات من عينات البروتين في المخزن المؤقت للعينة والمياه النقية للغاية واحتضان العينات في كتلة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم ضع العينات على الجليد قبل الدوامة والطرد المركزي لفترة وجيزة.بالنسبة للكهربية، قم بإعداد هلام متدرج من أربعة إلى 12٪ Bis-Tris في نظام الحجرة الكهربائية الهلامية وتحميل 3.5 ميكرولترات من معيار البروتين في البئر. عند استخدام معيار داخلي للتطبيع بين الغشاء، قم بتحميل كمية تساوي العينات الأخرى في الآبار الثلاثة الأولى بجوار سلم البروتين وتحميل 30 ميكروغرام من كل عينة في الآبار المتبقية. ثم، تشغيل العينات من خلال هلام التراص في 80 فولت لمدة 10 دقائق تليها 150 فولت لمدة 45 إلى 60 دقيقة إضافية.في نهاية electrophoresis، لتجميع كومة نقل، ووضع هلام البروتين على كومة أسفل تحتوي على غشاء ثنائي فلوريد بولي فينيلايدين تليها ورقة التصفية. استخدام الأسطوانة النشاف لإزالة أي فقاعات الهواء ووضع كومة أعلى على الجزء العلوي من ورقة التصفية قبل المتداول المكدس مرة أخرى لإزالة فقاعات الهواء. نقل المكدس كله إلى جهاز نقل مع القطب على الجانب الأيسر من الجهاز ووضع الإسفنج هلام على رأس المكدس بحيث يتم محاذاة الاسفنج مع الاتصالات الكهربائية المقابلة على الجهاز.بعد إغلاق الغطاء، حدد البرنامج المناسب وابدأ تشغيله. في نهاية البرنامج ، قم بقطع الغشاء إلى حجم الجل وغسل الغشاء المقطوع بسرعة بالماء المقطر المزدوج قبل الاستمرار في وصمة البروتين الإجمالية. بالنسبة إلى تلطيخ البروتين الكلي ، الف الغشاء إلى أنبوب 50 ملليلتر مع جانب البروتين الذي يواجه الداخل وتسمية الغشاء بخمس ملليلتر من محلول وصمة عار البروتين على الأسطوانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان.في نهاية الحضانة ، اغسل الغشاء بسرعة بخمسة ملليلترات من محلول الغسيل ، ويعيد الأنبوب لفترة وجيزة إلى الأسطوانة بين الغسيل ، يليه شطف قصير مع مياه نقية للغاية. إضافة ثلاثة ملليلتر من العازلة حظر إلى الغشاء والعودة الغشاء إلى الأسطوانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استبدال العازلة حظر مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في التركيز الأمثل المناسب واحتضان الغشاء على الأسطوانة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.في اليوم التالي، اغسل الغشاء ست مرات لمدة خمس دقائق مع خمسة ملليلترات من PBS الطازجة لكل غسل على الأسطوانة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير، احتضان الغشاء مع حل الأجسام المضادة الثانوية المناسبة على الأسطوانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل لمدة 30 دقيقة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، جفف الغشاء واستخدم رقائق الألومنيوم للحفاظ على الغشاء المحمي من الضوء.للحصول على الصورة، ضع الغشاء على الماسح الضوئي مع توجيه جانب البروتين لأسفل وحدد منطقة المسح الضوئي في البرنامج. ثم، الحصول على الصور في كل من القناتين وتصدير الصور إلى برنامج مناسب لتحليل الصور. عرض قناة 700 نانومتر لإظهار مجموع نتيجة تلطيخ البروتين وحدد تحليل ورسم مستطيل لتحديد المنطقة ذات الأهمية للتطبيع.ثم نسخ ولصق منطقة المستطيل الأول على كل عينة الفردية لضمان المنطقة المحددة هو نفس الحجم لجميع الممرات تحليلها. لتحديد كمية تركيز البروتين في كل حارة، انسخ النتائج من كل من مجموع وصمة عار البروتين والبروتين الذي يهم لبرنامج جدول البيانات وتحديد أعلى إشارة وصمة عار البروتين الكلي. ثم، قم بتقسيم قيمة إشارة بقعة البروتين الإجمالية حسب هذه القيمة للحصول على قيمة تحميل البروتين الطبيعية وتقسيم قيمة إشارة 800 نانومتر من كل عينة فردية حسب قيمتها البروتينية العادية المقابلة لحساب نسبة التعبير البروتيني النسبي في عينات مختلفة.في هذه البقع الغربية التمثيلية، يتم مقارنة البروتينات المستخرجة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من يوم ما بعد الولادة خمسة فئران بالبروتينات المستخرجة من الفئران البالغة التي يبلغ عمرها 10 أسابيع. تم تحقيق القياس الكمي بكثافةة الفلورية من مجموع وصمة عار البروتين من خلال قياس شدة الفلوريسنس داخل مربع المستطيل على كل حارة. عند تحليل الممرات بأكملها، تظل شدة الفلوريسين متشابهة نسبيًا عبر العينات، مما يشير إلى أن استخدام وصمة البروتين الإجمالية للتطبيع مناسب لهذا الغرض.ويمكن أيضا أن تستخدم وصمة عار البروتين الفلورسنت الكلية لمقارنة مستويات البروتين في نقاط زمنية مختلفة للتنمية. على سبيل المثال، على الرغم من أن مستويات البروتين العصبي الحري على قيد الحياة تنخفض بوضوح مع التقدم في العمر في الفئران، فإن إجمالي الكم الملون بالبروتين لا يزال ثابتًا. إن استخدام المعايير الداخلية، والتطبيع القائم على الفلور، والإحصاءات الكافية يزيد من قوة تحليل التعبير البروتيني المعقد عبر الظروف المختلفة.ويضيف هذا البروتوكول إلى تقنيات البقع الغربية التقليدية، والتغلب على قضايا الضوابط التحميل المناسبة والمقارنات عبر دفعات تجريبية، وتوفير المرونة لتحليل التعبير البروتيني. ويمكن توسيع نطاق هذا النهج لمقارنة التعبير البروتيني في ظل ظروف تجريبية أخرى.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA وCLC: Downregulation CLF-1-تعتمد من CNTFRα كما تظاهر عن طريق ويسترن التنشيف، تثبيط إنزيمات الليزوزومية، وسيتولوجية مناعية

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

الغربية النشاف بروتوكول لإعداد صغيرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

إنتاجية عالية، وتحديد محتوى البروتين المحددة في مستويات الأنسجة باستخدام نقطة الكمية المطلقة لطخة تحليل (قدب)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

إعداد Oligomer بيتا-اميلويد A11-إيجابية وتقييم استخدام دوت النشاف التحليل

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

تحديد المناطق الوظيفية البروتين من خلال تشييد البروتين تشيميريك

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...