Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

E. j. n. g. 得到 Wellcome 信托基金的支持 (赠款 106080/z z z)。其他资金由 SMA 信托基金 (SMA UK 财团) 提供;T. H. G. &AMP; Y-T。H.)、SMA Europe (t. h. g.、d. d. h. & e. j. n. g.)、爱丁堡大学精密医学 DTP (t. h. g.、l. l. l. & a. m.) 和 Euan MacDonald 汽车神经疾病研究中心 (t. h. g.)。

这一程序的程序是从爱丁堡大学内部道德委员会批准的动物研究中获得的, 这些研究是根据相关机构和英国内政部的规定进行的。个人和项目许可证。
注: 该协议已使用商业上可用的标准化试剂盒和试剂进行了优化, 以提高重现性 (见材料表)。
1. 样品的制备
<ol><li>
蛋白质提取
	<ol>
<li>在干冰上转移-80°c 的小细胞或组织样本, 在冰...

<ol>
	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

通过适当的实验设计、控制措施和统计分析, 西方印迹可以用于对不同范围的生物样本内和之间的蛋白质表达进行可靠的定量估计。我们在目前的手稿中描述的协议旨在为希望利用西方印迹对更大、更复杂的样本组进行定量分析的研究人员提供指导, 方法是使用基于荧光的组合检测方法、总蛋白质负荷归一化和内部标准。虽然这里的重点是确定和比较不同的小鼠组织和不同年龄的蛋白质表达, 这种?...

西方印迹是一种技术, 通常用于检测和量化蛋白质表达, 包括在组织同质或提取物。多年来, 这项技术在基础和临床研究方面都取得了许多进展, 可以作为诊断工具来识别疾病 1、2 的存在。西方印迹最早被描述为1979年将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝化纤维素片的一种方法, 然后使用被放射性标记或与荧光素结合的二级抗体对蛋白质进行可视化或过氧化物酶 3。通过开发商业上可获得的套件和设备, 西方的印迹方法多年来日益标准化和简化。事实上, 这项技术现在很容易由具有不同背景和经验水平的科学家来执行。然而, 与许多类似的实验技术一样, 西方印迹分析的结果很容易受到在实验设计和执行中做出的选择的影响。因此, 重要的是, 标准化的西方印迹方法的可获得性并不掩盖仔细进行实验规划和设计的必要性。实验考虑因素包括但不限于样品制备和处理、蛋白质检测抗体的选择和验证, 以及特别小或大的凝膜转移效率 (lt;10 或 gt;140 kDa)蛋白质4,5,6,7,8,9。原始样品的蛋白质质量在确定随后的西方印迹分析结果方面发挥着重要作用。由于蛋白质可以从各种样品和来源中提取, 包括细胞系、动物模型组织和死后人体组织, 因此需要在处理和处理方面保持一致, 以获得可重现的结果。例如, 当需要长期储存用于蛋白质提取的样品时, 必须认识到, 尽管蛋白质在-80°c 时通常是稳定的, 但在-80°c 时, 提取的蛋白质和完整组织之间的蛋白质稳定性存在差异。报告10。此外, 要获得蛋白质数量的可重复估计, 样品的一致同质化也是至关重要的。在开始大规模定量实验之前, 可能需要优化不同的裂解缓冲液和均质方法 (例如, 与自动化方法相比的手动均质化)。
对蛋白质负荷和定量变异性进行归一化的策略对于获得蛋白质表达的稳健、定量结果至关重要。家务蛋白, 如β-肌动蛋白、α-管蛋白、β-管蛋白和甘油-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH), 传统上被用来使蛋白质水平正常化, 以便进行定量。然而, 为量化目的对特定的家政蛋白进行规范化, 在过去几年中, 11,12受到越来越多的批评。例如, 在不同的发育阶段13、14、同一动物4的组织和不同的疾病条件下, 家养蛋白的表达会发生变化 ,16,17。因此, 使用特定的家政蛋白限制了在不同的时间点和不同的实验条件下对不同组织的蛋白质表达进行更复杂比较的可能性。清洁蛋白的另一种方法是使用总蛋白染色 (TPS) 来标记样本中存在的所有蛋白质。TPS 允许根据总蛋白质负载而不是一个特定蛋白质的水平进行信号归一化, 因此, 无论实验条件、样品类型或发展时间点如何, TPS 信号的定量都应具有可比性和可重现性.总蛋白污渍的例子包括 Ponceau S、无污渍凝胶、Coomassie R-350、Sypro-Ruby、Eppicconone、Amydo Black 和 Cy5 (见第18段审查)。这些方法中的每一种都有具体的优势和局限性, 方法的选择取决于可用的时间和工具以及实验设置4、18。
除了使用 TPS 来纠正膜内负荷和定量变化外, 可能还需要比较不同膜之间的样品, 特别是在进行大规模蛋白质表达分析时。然而, 抗体结合效率和总蛋白质染色强度等因素的变化可能会导致蛋白质样本之间的进一步变化, 并在单独的凝胶和膜上进行分析。因此, 为了在这种情况下进行可靠的量化, 有必要引入进一步的归一化步骤, 以考虑膜间的可变性。这可以通过在每个单独分析的膜上加入一个内部加载标准来实现, 该膜在整个实验中保持不变。该标准可以采取任何蛋白质裂解液的形式, 可以获得足够数量的蛋白质裂解物, 用于实验中包括的所有膜。在这里, 我们使用老鼠大脑裂解液 (从5天的对照小鼠获得), 因为大脑很容易同质化, 所获得的蛋白质裂解液在高浓度中含有大量的蛋白质。通过将内部标准加载到一式三份, 可以直接对单独膜上的样品进行归一化和比较。
在这里, 我们描述了一个详细的协议, 我们已经开发, 使我们能够进行复杂的比较蛋白质表达的变化, 在不同的组织, 小鼠模型 (包括疾病模型), 和发育时间点19。通过将荧光 TPS 与内部加载标准相结合, 我们能够克服现有的样品数量和实验条件方面的限制, 这些限制可以在单个实验中进行比较。这种方法扩大了传统西方印迹技术的使用, 从而使研究人员能够更好地探索不同组织和样本中的蛋白质表达。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

西方印迹是一种通常用于检测和量化蛋白质表达的技术。多年来, 这一技术在基础和临床研究方面都取得了许多进展。然而, 与许多类似的实验技术一样, 西方印迹分析的结果很容易受到在实验设计和执行中做出的选择的影响。特定的家政蛋白传统上被用来使蛋白质水平正常化, 以便进行定量, 但是, 这些蛋白质有许多局限性, 因此在过去几年中受到越来越多的批评。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 我们已经开发, 使我们能够进行复杂的比较蛋白质表达的变化, 在不同的组织, 小鼠模型 (包括疾病模型), 和发育时间点。通过使用荧光总蛋白染色并引入内部加载标准, 可以克服现有的限制, 在实验中可以比较的样本数量, 并系统地比较整个的实验条件范围。这种方法扩大了传统西方印迹技术的使用, 从而使研究人员能够更好地探索不同组织和样本中的蛋白质表达。

我们包括使用 TPS 和内部标准的例子, 以促进对组织和时间点之间的蛋白质水平进行比较。图 1显示了西方对从新生儿 (产后第5天) 获得的组织中提取的蛋白质进行印迹的结果, 与成年小鼠 (10周大) 相比。TPS 和 Smn 免疫印迹如图 1a, c所示。通过测量每个车道上矩形框内的荧光强度, 实现了 TPS 荧光强度的定量, 其结果如<...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

该方法描述了一种可靠且可重复的方法, 用于使用标准化的定量西方印迹法比较不同组织和不同发育时间点的蛋白质水平。

利用标准化定量西方印迹技术, 对跨组织和整个开发过程中的蛋白质水平进行可靠比较

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

该协议可用于通过查看不同组织和时间点的蛋白质表达，解决基础和临床研究中的重要问题。为了执行可靠的定量西方印迹，我们将荧光总蛋白染色与内部载荷控制相结合。这克服了在实验条件下比较各种组织时产生的限制。要从冷冻细胞或组织样本中提取蛋白质，请先将零下80度的样品解冻，然后适当清洗样品。使用手持式电动均质器与聚丙烯害虫，均匀化洗涤的样品，在双蒸馏水中冲洗害虫，并在样品之间用干净的组织干燥。将样品留在冰上10分钟，然后离心。然后，将含蛋白质样本的上清液转移到冰上的新管中，而不会干扰颗粒。为了对蛋白质浓度进行定量，在三孔三酯浓度增加时建立牛血清白蛋白标准，并将每个蛋白质样品的一微升重复添加到96孔光学板的适当孔中。如果蛋白质浓度预期较低，并在板读卡器上测量560纳米的吸收量，在60摄氏度的热块上孵育蛋白质10分钟或更长时间。导出板读卡器测量值，通过将每个样品的平均吸光度值与使用蛋白质标准获得的标准曲线进行比较来计算蛋白质浓度。要使蛋白质的含量正常化，在样品缓冲液和超纯水中制备蛋白质样品的稀释，并在70摄氏度的热块中孵育样品10分钟。然后，在涡旋和短暂离心之前将样品放在冰上。对于电泳，在凝胶电泳室系统中设置预制四至 12%的 Bis-Tris 梯度凝胶，将 3.5 微升的蛋白质标准加载到井中。当使用膜间标准化的内部标准时，将等于其他样品的量加载到蛋白质梯旁边的前三个孔中，将每个样品的 30 微克加载到剩余的孔中。然后，以 80 伏的堆叠凝胶运行样品 10 分钟，然后运行 150 伏特，再运行 45 到 60 分钟。在电泳的末尾，组装转移堆栈，将蛋白凝胶放在底部堆栈上，其中包含聚乙烯二氟化物膜，然后是滤纸。使用印迹辊去除任何气泡，然后将顶部堆叠放在滤纸的顶部，然后再滚动堆叠以清除气泡。将整个堆栈与设备左侧的电极一起转移到传输装置中，将凝胶海绵放在堆叠的顶部，使海绵与设备上的相应电气触点对齐。合上盖子后，选择并启动相应的程序。在程序结束时，将膜切割到凝胶大小，用双蒸馏水快速清洗切膜，然后继续处理总蛋白污渍。对于总的蛋白质染色，将膜卷入50毫升管中，蛋白质侧朝内，并在烟罩室温下用五毫升蛋白质染色溶液在滚筒上标记膜5分钟。在孵化结束时，用五毫升的洗涤液快速清洗膜，将管子短暂地返回到洗涤之间的滚筒中，然后用超纯水短暂冲洗。在膜中加入三毫升阻塞缓冲液，并在室温下将膜返回滚筒 30 分钟。以适当优化的浓度用感兴趣的主要抗体替换阻塞缓冲液，并在四摄氏度下将辊子上的膜孵育过夜。第二天，在室温下，用五毫升新鲜PBS在滚筒上清洗，将膜洗涤五分钟， 五分钟。最后一次洗涤后，在室温下用适当的二次抗体溶液在滚筒上孵育膜一小时，然后每次洗涤30分钟。最后一次洗涤后，干燥膜，使用铝箔，以保持膜免受光线。对于图像采集，请将膜放在扫描仪上，蛋白质侧朝下，然后选择软件中的扫描区域。然后，在两个通道中获取图像，然后将图像导出到适当的图像分析程序。显示 700 纳米通道以显示总蛋白质染色结果，选择分析和绘制矩形以定义用于规范化的兴趣区域。然后，将第一个矩形区域复制并粘贴到每个单独的样本上，以确保定义的区域对于所有分析的通道的大小相同。要量化每个通道中的蛋白质浓度，请将总蛋白质染色和感兴趣的蛋白质的结果复制到电子表格程序，并确定最高的总蛋白质染色信号。然后，将每个总蛋白质染色信号值除以该值，获得规范化蛋白质载荷值，并除以每个样品的800纳米信号值及其相应的规范化蛋白质值，计算不同样品的相对蛋白表达比。在这些具有代表性的西方印迹中，从产后第5天获得的组织中提取的蛋白质与从10周大的成年小鼠中提取的蛋白质进行比较。通过测量每个通道上矩形盒内的荧光强度，实现了总蛋白染色的荧光强度的量化。当分析整个通道时，整个样品的荧光强度保持相对相似，表明使用总蛋白染色进行规范化是适合此目的的。荧光总蛋白染色也可用于比较不同发育时间点的蛋白质水平。例如，虽然小鼠存活运动神经元蛋白水平随着年龄的增长而明显降低，但总蛋白质染色定量保持不变。使用内部标准、基于荧光的规范化和足够的统计数据，可提高不同条件下复杂蛋白质表达分析的鲁棒性。该协议增加了传统的西方印迹技术，克服了实验批次中适当的载荷控制和比较问题，并为蛋白质表达分析提供了灵活性。这种方法可以扩展到比较其他实验条件下的蛋白质表达。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

使用脚手架脂质体重构脂质近端蛋白质 - 蛋白质相互作用<em&gt;体外</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

科研

生物化学

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA和CLC：这表现在免疫印迹，溶酶体酶的抑制，和免疫组化CNTFRα的CLF-1依赖性下调

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

增强组织样品使用组合前体同位素标记和标记等压的复用（cPILOT）

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

一种用于小数目造血干细胞的西方印迹协议

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

高通量, 用定量斑点杂交分析法绝对测定组织层中选定蛋白质的含量 (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

用斑点印迹分析 A11-positive β淀粉样寡聚物的制备与评价

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

用奇米蛋白构建功能蛋白区的鉴定

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

使用新激酶蛋白的强生化方法在分子水平上进行表征

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...