Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

E.J.N.G. understøttes af Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Andre midler er blevet leveret af SMA Trust (SMA UK konsortium; T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), universitetet i Edinburgh DTP i præcision medicin (T.H.G., ll & A.M.M.) og Euan MacDonald Forskningscenter for Motor neuronsygdomme sygdom (T.H.G).

Væv for at denne procedure blev der indsamlet fra dyreforsøg, som blev godkendt af den interne etiske komité på universitetet i Edinburgh og blev udført i overensstemmelse med institutionelle og britiske Home Office forordninger under myndighed af relevante personlige og projekt licenser.
Bemærk: Denne protokol er blevet optimeret ved hjælp af standardiserede, kommercielt tilgængelige kits og reagenser for at øge reproducerbarhed (Se Tabel af materialer).
<p class...

<ol>
	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

Med de relevante eksperimentelle design, kontrolforanstaltninger og statistiske analyser, kan western blotting bruges til at foretage pålidelige kvantitative estimater af protein udtryk inden for og mellem et varieret udvalg af biologiske prøver. Den protokol, vi beskriver i det aktuelle manuskript har til formål at tjene som retningslinje for forskere søger for at bruge Western blotting for at foretage kvantitative analyse på tværs af større og mere komplekse grupper af prøver ved hjælp af en kombination af flu...

Western blotting er en teknik, der er almindeligt anvendt til at detektere og kvantificere protein ytringsfrihed, herunder i væv homogeniseret eller ekstrakter. I år, har denne teknik ført til mange fremskridt inden for både grundforskning og klinisk forskning, hvor det kan bruges som et diagnostisk redskab til at identificere tilstedeværelsen af sygdom1,2. Western blotting blev første gang beskrevet i 1979 som en metode til at overføre proteiner fra polyacrylamidgeler nitrocellulose ark og derefter visualisere proteiner ved hjælp af sekundære antistoffer, der var enten radioaktivt mærket eller konjugeret til fluorescein eller peroxidase3. Gennem udviklingen af kommercielt tilgængelige kits og udstyr, er Western blotting metoder blevet stadig mere standardiseret og forenklet gennem årene. Ja, teknikken er nu let udført af forskere med forskellige baggrunde og niveauer af erfaring. Som med mange lignende eksperimentelle teknikker, er resultatet af vestlige skamplet analyser, let påvirket af valg, der træffes i design og udførelse af forsøget. Det er derfor vigtigt, at adgangen til standardiseret Western blotting metoder ikke tilsløre behovet for omhyggelig eksperimentelle planlægning og design. Eksperimentelle overvejelser omfatter, men er ikke begrænset til, eksempeldatabase forberedelse og håndtering, udvælgelse og validering af antistoffer til registrering af protein og gel til membran overførsel effektivitet af især små eller store (< 10 eller > 140 kDa) proteiner4,5,6,7,8,9. Protein kvalitet af den oprindelige prøve spiller en væsentlig rolle ved fastsættelsen af resultatet af den efterfølgende Western blot analyse. Som protein kan udvindes fra en bred vifte af prøver og kilder, herunder cellelinjer, væv fra dyremodeller og post mortem humane væv, er konsistens i håndtering og forarbejdning forpligtet til at opnå reproducerbare resultater. For eksempel, når langtidsopbevaring af prøver til protein udvinding er påkrævet, er det vigtigt at indse, at selv om protein er generelt stabilt på-80 ° C, forskelle i protein stabilitet mellem udvundne proteiner og intakt væv ved-80 ° C har været rapporterede10. Desuden, for at opnå reproducerbare estimater af protein mængder, konsekvent homogenisering af prøver er afgørende. Optimering af forskellige lysis buffere og homogenisering metoder (f.eks. manuel homogenisering sammenlignet med automatiserede metoder) kan være nødvendig før du starter en storstilet kvantitative eksperiment.
Normalisering strategier til at korrigere for protein lastning og kvantificering variation er afgørende for at opnå robuste, kvantitative resultater af protein udtryk. Husholdning proteiner som β-actin, har α-tubulin, β-tubulin og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) traditionelt været brugt til at normalisere protein niveauer for kvantificering. Normalisering til specifikke husholdning proteiner til kvantificering formål er imidlertid blevet kritiseret i stigende grad over de sidste par år11,12. For eksempel kan udtryk for husholdning proteiner ændre på tværs af forskellige udviklingsstadier13,14, på tværs af væv fra de samme dyr4, og under forskellige sygdom betingelser4,15 ,16,17. Derfor begrænser brugen af specifikke husholdning proteiner mulighederne for at foretage mere komplekse sammenligninger mellem protein udtryk fra forskellige væv, på forskellige timepoints og under forskellige forsøgsbetingelser. Et alternativ til husholdning proteiner til kontrol for protein lastning variation er brugen af en total protein pletten (TPS) at etiketter og visualiserer alle proteiner til stede i en prøve. TPS giver signal normalisering baseret på total protein belastning i stedet niveauer af et specifikt protein og derfor kvantificering af TPS signal bør være sammenlignelige og reproducerbare uanset eksperimentelle tilstand, prøvetype eller udviklingsmæssige tidspunkt . Ponceau S, plet-fri geler, Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black og Cy5 (gennemgik i ref. 18) er eksempler på total protein pletter. Hver af disse metoder har specifikke fordele og begrænsninger og valg af metode afhænger af tiden og værktøjer til rådighed samt eksperimentelle setup4,18.
Ud over at bruge en TPS for at korrigere for inden for membran lastning og kvantificering variabilitet, kan det være nødvendigt at sammenligne prøver mellem forskellige membraner, navnlig når du udfører omfattende protein udtryk analyse. Dog kan variabilitet i faktorer som antistof bindende effektivitet og total protein pletten intensitet indføre yderligere variabiliteten mellem protein prøver, der analyseres på separate geler og membraner. For robuste kvantificering i denne situation er det derfor nødvendigt at indføre en yderligere normalisering skridt at tage højde for mellem membran variabilitet. Dette kan opnås ved at inkludere en indre lastning standard på hver af separat analyseret membraner, der holdes konstant på tværs af eksperimenter. Denne standard kan tage form af et protein lysate, der kan fås i tilstrækkelige mængder til at bruges på tværs af alle membraner inkluderes i eksperimentet. Her bruger vi en lysate af mus hjernen (fremstillet af 5 dage gamle kontrol mus), som hjernen er let homogeniseret og opnåede proteinet lysate indeholder en betydelig mængde af protein i høj koncentration. Indlæsning af en intern standard i tre eksemplarer giver prøver på separate membraner til at blive normaliseret og sammenlignes direkte.
Her beskriver vi en detaljeret protokol, som vi har udviklet for at gøre det muligt at foretage komplekse sammenligninger af protein udtryk variation på tværs af forskellige væv, musemodeller (herunder sygdomsmodeller) og udviklingsmæssige timepoints19. Ved at kombinere en fluorescerende TPS med brug af en indre lastning standard, var vi i stand til at overvinde de nuværende begrænsninger i antallet af prøver og forsøgsbetingelser, som kan sammenlignes i et enkelt eksperiment. Denne tilgang udvider anvendelsen af traditionelle vestlige skamplet teknikker, hvorved forskere at bedre udforske protein udtryk på tværs af forskellige væv og prøver.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

Western blotting er en teknik, der er almindeligt anvendt til at detektere og kvantificere protein udtryk. Gennem årene har denne teknik førte til mange fremskridt inden for både grundforskning og klinisk forskning. Som med mange lignende eksperimentelle teknikker, er resultatet af vestlige skamplet analyser, let påvirket af valg, der træffes i design og udførelse af forsøget. Specifikke husholdning proteiner har traditionelt været brugt til at normalisere protein niveauer for kvantificering, men disse har en række begrænsninger, og derfor er blevet kritiseret i stigende grad i de sidste par år. Her beskriver vi en detaljeret protokol, som vi har udviklet for at gøre det muligt at foretage komplekse sammenligninger af protein udtryk variation på tværs af forskellige væv, musemodeller (herunder sygdomsmodeller) og udviklingsmæssige timepoints. Ved hjælp af en fluorescerende total protein pletten og indføre brugen af en indre lastning standard, er det muligt at overvinde de nuværende begrænsninger i antallet af prøver, der kan sammenlignes i eksperimenter og systematisk sammenligne protein niveauer på tværs af en række forsøgsbetingelser. Denne tilgang udvider anvendelsen af traditionelle vestlige skamplet teknikker, hvorved forskere at bedre udforske protein udtryk på tværs af forskellige væv og prøver.

Vi medtager eksempler på brugen af TPS og en intern standard til lette sammenligninger af protein niveauer på tværs af væv og tidspunkter. Figur 1 viser resultater fra Western blotting på protein udvundet af væv fra neonatal (postnatal dag 5) i forhold til voksne mus (10 - gamle uge). TPS og Smn immunblot er vist i figur 1A, C. Kvantificering af fluorescens intensiteten af TPS blev opnået ved måling af fl...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

I denne metode beskrives en robust og reproducerbar metode til sammenligning af protein niveauer i forskellige væv og på forskellige udviklingsmæssige timepoints ved hjælp af en standardiseret kvantitative western blotting tilgang.

Robust sammenligning af Protein niveauer på tværs af væv og udvikling ved hjælp af standardiserede kvantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Denne protokol kan bruges til at behandle vigtige spørgsmål i grundforskning og klinisk forskning ved at se på proteinudtryk på tværs af forskellige væv og tidspunkter. For at udføre pålidelig kvantitativ western blotting kombinerer vi en fluorescerende totalproteinplet med en intern belastningskontrol. Dette overvinder begrænsninger, der opstår, når man sammenligner forskellige væv på tværs af eksperimentelle betingelser.For at udtrække proteiner fra snapfrosne celle- eller vævsprøver skal de minus-80-graders prøver på is tøs op, før prøverne vaskes efter behov, alt efter tabellen. Ved hjælp af en håndholdt elektrisk homogenisator med en polypropylen støder, homogenisere de vaskede prøver, skylning støderen i dobbeltdestilleret vand og tørring med et rent væv mellem prøverne. Lad prøverne blive på is i 10 minutter efterfulgt af centrifugering.Overfør derefter det protein-prøveholdige supernatant til et nyt rør på is uden at forstyrre pellet. Ved kvantificering af proteinkoncentrationen skal der opstilles standarder for kvægserumalbumin i stigende koncentrationer i tre eksemplarer, og der tilsættes en mikroliter af hver proteinprøve i to eksemplarer til de relevante brønde på en optisk plade med 96 brønd. Inkuber proteinet på en 60-graders-Celsius varmeblok i 10 minutter eller længere, hvis proteinkoncentrationen forventes at være lav, og mål absorptionen ved 560 nanometer på en pladelæser.Pladelæsermålingerne udregner og beregner proteinkoncentrationen ved at sammenligne de gennemsnitlige absorbansværdier for hver prøve med en standardkurve, der er opnået ved hjælp af proteinstandarden. For at normalisere mængden af protein, forberede fortyndinger af proteinprøver i prøve buffer og ultra-rent vand og inkubere prøverne i en 70-graders-Celsius varmeblok i 10 minutter. Derefter placeres prøverne på is, før du hvirvler og kortvarigt centrifugeres.For elektroforese, oprette en præfabrikeret fire til 12% Bis-Tris gradient gel i gel elektroforese kammer system og belastning 3,5 mikroliter af en proteinstandard i brønden. Når du bruger en intern standard for normalisering mellem membranen, skal der indlæsses en mængde, der er lig med de andre prøver, i de første tre brønde ved siden af proteinstigen og indlæs 30 mikrogram af hver prøve i de resterende brønde. Derefter køre prøverne gennem stabling gel ved 80 volt i 10 minutter efterfulgt af 150 volt i yderligere 45 til 60 minutter.I slutningen af elektroforese, at samle overførslen stak, placere protein gel på den nederste stak, der indeholder polyvinylidene difluorid membran efterfulgt af filterpapir. Brug blotting rullen til at fjerne eventuelle luftbobler og placere den øverste stak på toppen af filterpapiret, før du ruller stakken igen for at fjerne luftbobler. Overfør hele stakken til overførselsenheden med elektroden på venstre side af enheden, og placer gelsvampen oven på stakken, så svampen flugter med de tilsvarende elektriske kontakter på enheden.Når låget er lukket, skal du vælge og starte det relevante program. I slutningen af programmet skæres membranen til gelstørrelsen, og den afskårne membran vaskes hurtigt med dobbeltdestilleret vand, før du fortsætter med den samlede proteinplet. For total proteinfarvning rulles membranen ind i et 50-milliliterrør med proteinsiden vendt indad, og membranen mærkes med fem milliliter proteinpletopløsning på en rulle i fem minutter ved stuetemperatur i en røghætte.Ved slutningen af inkubationen vaskes membranen hurtigt med fem milliliter vaskeopløsning, hvor røret kortvarigt returneres til rullen mellem vaskene efterfulgt af en kort skylning med ultra rent vand. Tilsæt tre milliliter blokerende buffer til membranen og returnere membranen til rullen i 30 minutter ved stuetemperatur. Udskift blokeringsbufferen med det primære interesseantistof ved den passende optimerede koncentration, og inkuber membranen på rullen natten over ved fire grader Celsius.Den næste dag vaskes membranen seks gange i fem minutter med fem milliliter frisk PBS pr. vask på rullen ved stuetemperatur. Efter den sidste vask inkuberes membranen med den passende sekundære antistofopløsning på rullen i en time ved stuetemperatur efterfulgt af tre vaske i 30 minutter pr. vask. Efter den sidste vask, tør membranen og bruge aluminiumsfolie til at holde membranen beskyttet mod lys.Ved billedopkøb skal membranen på scanneren med proteinsiden vende nedad og vælge scanningsområdet i softwaren. Derefter erhverve billeder i begge kanaler og eksportere billederne til et passende billedanalyse program. Vis 700-nanometerkanalen for at vise det samlede proteinfarvningsresultat og Vælg analyse og tegn rektangel for at definere interesseområdet for normalisering.Kopier og indsæt derefter det første rektangelområde på hvert enkelt eksempel for at sikre, at det definerede område har samme størrelse for alle de analyserede baner. For at kvantificere proteinkoncentrationen i hver vognbane skal du kopiere resultaterne fra både den samlede proteinplet og det protein, der er af interesse, til et regnearksprogram og bestemme det højeste samlede proteinpletsignal. Derefter divideres hver samlet proteinpletsignalværdi med denne værdi for at opnå den normaliserede proteinbelastningsværdi, og 800-nanometersignalværdien divideres fra hver enkelt prøve med den tilsvarende normaliserede proteinværdi for at beregne det relative proteinudtryksforhold i forskellige prøver.I disse repræsentative vestlige blots sammenlignes proteiner, der er udvundet af væv fra postnatal dag, med proteiner udvundet af 10 uger gamle voksne mus. Kvantificeringen af fluorescensintensiteten af den samlede proteinplet blev opnået ved at måle fluorescensintensiteten inde i rektangelboksen på hver vognbane. Når hele baner analyseres, forbliver fluorescensintensiteten relativt ens på tværs af prøver, hvilket indikerer, at brugen af den samlede proteinplet til normalisering er egnet til dette formål.Den fluorescerende samlede protein plet kan også bruges til at sammenligne proteinniveauer på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter. For eksempel, selv om overlevelse motor neuron protein niveauer klart falde med alderen i mus, den samlede protein farvede kvantificering forbliver konstant. Brugen af interne standarder, fluorescensbaseret normalisering og tilstrækkelig statistik øger robustheden af kompleks proteinudtryksanalyse på tværs af forskellige forhold.Denne protokol tilføjer til traditionelle vestlige blot teknikker, overvinde spørgsmål om passende belastning kontrol og sammenligninger på tværs af eksperimentelle partier, og giver fleksibilitet til protein udtryk analyse. Denne fremgangsmåde kan udvides til at sammenligne proteinudtryk under andre eksperimentelle forhold.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA og CLC: CLF-1-afhængig Nedregulering af CNTFRa som demonstreret ved Western blotting, Inhibering af lysosomale enzymer, og Immunocytokemi

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Forbedret Prøve Multiplexing af væv under anvendelse kombinerede Precursor isotopmærkning og isobar Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting-protokollen for et lille antal hæmatopoietisk stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høj overførselshastighed, absolut bestemmelse af indholdet af en markeret Protein i væv niveauer ved hjælp af kvantitative Dot duppes analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive β-amyloid Oligomer forberedelse og vurdering ved hjælp af Dot Blotting analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikation af funktionelle Protein regioner gennem kimære Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...