Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

E.J.N.G. wordt ondersteund door de Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Andere financiering is verstrekt door de SMA Trust (SMA UK Consortium; T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), de Universiteit van Edinburgh DTP in precisie geneeskunde (T.H.G., L.L. & A.M.M.) en het Euan MacDonald-centrum voor Motor Neurone Disease Research (T.H.G).

Weefsels voor deze procedure werden verkregen uit dierlijke studies die werden goedgekeurd door het Comité van interne ethiek aan de Universiteit van Edinburgh en werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en UK Home Office verordeningen onder het gezag van relevante persoonlijke en project licenties.
Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van gestandaardiseerde, commercieel beschikbare kits en reagentia teneinde reproduceerbaarheid (Zie Tabel van materi...

<ol>
	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

Met de juiste proefopzet, de controlemaatregelen en de statistische analyse, kan westelijke bevlekken worden gebruikt om betrouwbare kwantitatieve ramingen van eiwit expressie binnen en tussen een gevarieerd aanbod van biologische monsters. Het protocol we in het huidige manuscript beschrijven wil dienen als richtsnoer voor onderzoekers op zoek naar het westelijke bevlekken om kwantitatieve analyse over grotere en complexere groepen van monsters, met behulp van een combinatie van fluorescentie gebaseerde gebruiken detect...

Westelijke bevlekken is een techniek die wordt gebruikt bij het detecteren en kwantificeren van eiwit expressie, met inbegrip in weefsel homogenates of extracten. Loop der jaren heeft deze techniek geleid tot veel vooruitgang in zowel fundamenteel en klinisch onderzoek, waar het kan worden gebruikt als een diagnostisch hulpprogramma te identificeren van de aanwezigheid van ziekte1,2. Westelijke bevlekken werd het eerst beschreven in 1979 als een methode voor het overbrengen van eiwitten van polyacrylamide gels naar nitrocellulose bladen en vervolgens het visualiseren van eiwitten met behulp van secundaire antilichamen die waren ofwel radioactief gelabelde of geconjugeerd met fluoresceïne of peroxidase3. Door de ontwikkeling van commercieel beschikbare kits en apparatuur, zijn westelijke bevlekkende methoden steeds meer gestandaardiseerd en vereenvoudigd door de jaren heen. Inderdaad, de techniek is gemakkelijk nu uitgevoerd door wetenschappers met uiteenlopende achtergronden en niveaus van ervaring. Echter zoals met vele soortgelijke experimentele technieken, wordt het resultaat van westelijke vlek analyses gemakkelijk beïnvloed door de keuzes in het ontwerp en de uitvoering van het experiment. Het is daarom belangrijk, dat de toegankelijkheid van gestandaardiseerde westelijke bevlekkende methoden niet de behoefte aan zorgvuldige experimentele planning verdoezelen en ontwerp. Experimentele aspecten omvatten, maar zijn niet beperkt tot, monster voorbereiding en behandeling, selectie en validatie van antilichamen voor eiwit detectie en gel-naar-membraan spuitrendement van met name kleine of grote (< 10 of > 140 kDa) eiwitten4,5,6,7,8,9. Eiwit kwaliteit van het oorspronkelijke monster speelt een belangrijke rol bij de bepaling van het resultaat van de daaropvolgende westelijke vlekkenanalyse. Zoals eiwitten kan worden geëxtraheerd uit een grote verscheidenheid van monsters en bronnen, met inbegrip van weefsels van dierlijke modellen, cellijnen en post mortem menselijke weefsels, is consistentie in afhandeling en verwerking vereist om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Bijvoorbeeld, als de langetermijnopslag van monsters voor eiwit extractie vereist is, is het belangrijk om te beseffen dat, hoewel eiwit over het algemeen stabiel bij-80 ° C is, verschillen in eiwitstabiliteit uitgepakte eiwitten en intact weefsels bij-80 ° C geweest gerapporteerde10. Bovendien, met het oog op een reproduceerbare ramingen van de hoeveelheden eiwit, consistente homogenisering van de monsters is cruciaal. Optimaliseren van verschillende lysis buffers en homogenisering methoden (bijvoorbeeld handmatige homogenisering in vergelijking met geautomatiseerde methoden) kan nodig zijn voordat u begint een grootschalige kwantitatieve experiment.
Normalisatie strategieën om te corrigeren voor eiwit laden en kwantificering variabiliteit zijn essentieel voor het verkrijgen van robuuste, kwantitatieve resultaten van eiwit expressie. Huishouden eiwitten zoals β-actine, α-tubuline, β-tubuline en glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) hebben van oudsher gebruikt om te normaliseren eiwitniveaus voor kwantificering. Echter, normalisatie aan specifieke huishouding eiwitten voor kwantificering doeleinden is steeds meer bekritiseerd over de afgelopen paar jaar11,12. Bijvoorbeeld, kunt de uitdrukking van de huishouding eiwitten wijzigen in verschillende ontwikkelingsstadia13,14, over weefsels van dezelfde dieren4en onder verschillende ziekte voorwaarden4,15 ,16,17. Daarom is het gebruik van specifieke huishouding eiwitten beperkt de mogelijkheden van het maken van meer complexe vergelijkingen tussen eiwit expressie uit verschillende weefsels, op verschillende tijdstippen en onder verschillende experimentele omstandigheden. Een alternatief voor huishouden eiwitten aan besturingselement voor eiwit laden variatie is het gebruik van een totale proteïne vlek (TPS) dat etiketten en visualiseert alle eiwitten aanwezig in een monster. TPS kunt signaal normalisering op basis van de totale proteïne laden in plaats van de niveaus van één specifieke proteïne en dus kwantificering van TPS signaal moet zijn vergelijkbaar en reproduceerbare ongeacht de experimentele conditie, monster type of developmental timepoint . Voorbeelden van totaal eiwit vlekken zijn Ponceau S, vlek-vrij gels Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black en Cy5 (herzien in ref. 18). Elk van deze methoden heeft specifieke voordelen en beperkingen en selectie methode hangt af van de tijd en hulpmiddelen beschikbaar, evenals de experimentele opzet4,18.
Naast het gebruik van een TPS om te corrigeren voor binnen-membraan laden en kwantificering variabiliteit, wellicht te vergelijken tussen verschillende membranen, met name bij het uitvoeren van grootschalige eiwit expressie analyse monsters. Echter kan variabiliteit in factoren zoals antilichamen bindende efficiëntie en totaal eiwit vlek intensiteit leiden tot verdere variabiliteit tussen de eiwitsteekproeven die op aparte gels zijn geanalyseerd en membranen. Voor robuuste kwantificering in deze situatie moet het dan ook om een verdere normalisatie stap om de variabiliteit tussen-membraan te verklaren. Dit kan worden bereikt door een interne laden standaard op elk van de afzonderlijk geanalyseerde membranen die constant wordt gehouden over experimenten. Deze standaard kan de vorm aannemen van een eiwit lysate die in voldoende hoeveelheden worden gebruikt in alle membranen opgenomen in het experiment kan worden verkregen. Hier, gebruiken we een lysate van muis hersenen (verkregen uit 5 dag oud besturingselement muizen), omdat de hersenen is gemakkelijk gehomogeniseerd en de verkregen eiwit lysate bevat een aanzienlijke hoeveelheid eiwit met een hoge concentratie. Laden van een interne standaard in drievoud kunt monsters op aparte membranen worden genormaliseerd en vergeleken rechtstreeks.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol die we hebben ontwikkeld zodat ons ertoe complexe vergelijkingen van eiwit expressie variatie in verschillende weefsels, Muismodellen (inclusief ziekte modellen) en ontwikkelingsstoornissen timepoints19. Door een fluorescerende TPS te combineren met het gebruik van een interne laden standaard, konden we bestaande beperkingen in het aantal monsters en experimentele omstandigheden die binnen een enkele experiment kunnen worden vergeleken. Deze aanpak breidt het gebruik van traditionele westelijke vlek technieken, waardoor onderzoekers beter verkennen eiwituitdrukking in verschillende weefsels en monsters.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

Westelijke bevlekken is een techniek die wordt gebruikt bij het detecteren en kwantificeren van eiwit expressie. Loop der jaren heeft deze techniek geleid tot veel vooruitgang in zowel fundamenteel en klinisch onderzoek. Echter zoals met vele soortgelijke experimentele technieken, wordt het resultaat van westelijke vlek analyses gemakkelijk beïnvloed door de keuzes in het ontwerp en de uitvoering van het experiment. Specifieke huishouding eiwitten hebben van oudsher gebruikt om te normaliseren eiwitniveaus voor kwantificering, echter deze hebben een aantal beperkingen en hebben daarom steeds meer bekritiseerd in de afgelopen paar jaar. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol die we hebben ontwikkeld zodat ons ertoe complexe vergelijkingen van eiwit expressie variatie in verschillende weefsels, Muismodellen (inclusief ziekte modellen) en ontwikkelingsstoornissen timepoints. Met behulp van een fluorescerende totaal eiwit vlek en introductie van het gebruik van een interne standaard wordt geladen, is het mogelijk om de bestaande beperkingen in het aantal monsters die binnen experimenten kunnen worden vergeleken en systematisch vergelijken eiwitniveaus over een waaier van experimentele omstandigheden. Deze aanpak breidt het gebruik van traditionele westelijke vlek technieken, waardoor onderzoekers beter verkennen eiwituitdrukking in verschillende weefsels en monsters.

Wij zijn voorbeelden van het gebruik van TPS en een interne standaard om vergelijkingen van eiwitniveaus over weefsels en tijdstippen. Figuur 1 toont de resultaten van het westelijke bevlekken op eiwit geëxtraheerd uit weefsels verkregen neonatale (postnatale dag 5) in vergelijking met volwassen muizen (10 - weken oude). TPS en Smn immunoblot worden weergegeven in figuur 1A, C. Kwantificering van de intensiteit ...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Deze methode beschrijft een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het vergelijken van eiwitniveaus in verschillende weefsels en bij verschillende ontwikkelings timepoints met behulp van een kwantitatieve westelijke bevlekkende standaardbenadering.

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Dit protocol kan worden gebruikt om belangrijke vragen in fundamenteel en klinisch onderzoek aan te pakken door te kijken naar eiwitexpressie in verschillende weefsels en tijdstippen. Om betrouwbare kwantitatieve westerse blotting uit te voeren, combineren we een fluorescerende totale eiwitvlek met een interne ladingscontrole. Dit overwint beperkingen die zich voordoen bij het vergelijken van verschillende weefsels over experimentele omstandigheden.Om eiwitten uit snap-bevroren cel of weefselmonsters te extraheren, ontdooit u de min-80-gradenmonsters op ijs voordat u de monsters indien van toepassing was, volgens de tabel. Met behulp van een draagbare elektrische homogenisator met een polypropyle stamper, homogeniseren de gewassen monsters, spoelen de stamper in dubbel gedestilleerd water en drogen met een schoon weefsel tussen de monsters. Laat de monsters 10 minuten op ijs liggen, gevolgd door centrifugatie.Breng vervolgens het eiwitmonster-bevattende supernatant over naar een nieuwe buis op ijs zonder de pellet te verstoren. Voor de kwantificering van de eiwitconcentratie worden de albuminenormen voor runderserums ingesteld bij toenemende concentraties in drievoud en één microliter van elk eiwitmonster in tweevoud toegevoegd aan de juiste putten van een optische plaat met 96 put. Incubeer het eiwit op een 60-graden Celsius warmteblok gedurende 10 minuten of langer als de eiwitconcentratie naar verwachting laag is en meet de absorptie op 560 nanometer op een plaatlezer.Exporteer de metingen van de plaatlezer en bereken de eiwitconcentratie door de gemiddelde absorptiewaarden van elk monster te vergelijken met een standaardcurve verkregen met behulp van de eiwitnorm. Om de hoeveelheid eiwit te normaliseren, bereid verdunningen van de eiwitmonsters in monsterbuffer en ultrazuiver water en broed de monsters gedurende 10 minuten uit in een hitteblok van 70 graden Celsius. Plaats vervolgens de monsters op ijs voordat u gaat wervelen en even centrifugeert.Voor elektroforese, het opzetten van een prefab vier tot 12%Bis-Tris gradiënt gel in de gel elektroforese kamer systeem en belasting 3,5 microliter van een eiwit standaard in de put. Laad bij het gebruik van een interne standaard voor tussen-membraannormalisatie een hoeveelheid die gelijk is aan de andere monsters in de eerste drie putten naast de eiwitladder en laad 30 microgram van elk monster in de resterende putten. Voer vervolgens de monsters door de stapelgel op 80 volt gedurende 10 minuten, gevolgd door 150 volt voor een extra 45 tot 60 minuten.Plaats aan het einde van de elektroforese, om de overdrachtsstapel te monteren, de eiwitgel op de bodemstapel met het polyvinylidenen difluoridemembraan, gevolgd door het filterpapier. Gebruik de blotting roller om eventuele luchtbellen te verwijderen en plaats de bovenste stapel op de bovenkant van het filterpapier voordat u de stapel weer rolt om luchtbellen te verwijderen. Breng de hele stapel met de elektrode aan de linkerkant van het apparaat over in het overdrachtsapparaat en plaats de gelspons bovenop de stapel, zodat de spons wordt uitgelijnd met de bijbehorende elektrische contacten op het apparaat.Na het sluiten van het deksel, selecteer en start het juiste programma. Snijd aan het einde van het programma het membraan tot de gelgrootte en was het snijmembraan snel met dubbel gedestilleerd water voordat u verdergaat met de totale eiwitvlek. Voor totale eiwitvlekken rol je het membraan in een buis van 50 milliliter met de eiwitkant naar binnen gericht en label het membraan met vijf milliliter eiwitvlekoplossing op een roller gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in een rookkap.Aan het einde van de incubatie was je het membraan snel met vijf milliliter wasoplossing, waarbij de buis kort terugkeert naar de roller tussen wasbeurten, gevolgd door een korte spoeling met ultrazuiver water. Voeg drie milliliter blokkeerbuffer toe aan het membraan en breng het membraan gedurende 30 minuten terug op de rol bij kamertemperatuur. Vervang de blokkeerbuffer door het primaire antilichaam van belang bij de juiste geoptimaliseerde concentratie en broed het membraan op de rol 's nachts bij vier graden Celsius uit.De volgende dag was je het membraan zes keer gedurende vijf minuten met vijf milliliter verse PBS per wasbeurt op de rol bij kamertemperatuur. Na de laatste wasbeurt, incubeer het membraan met de juiste secundaire antilichaamoplossing op de rol gedurende een uur bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten gedurende 30 minuten per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt droog je het membraan en gebruik aluminiumfolie om het membraan tegen licht te beschermen.Voor het verkrijgen van afbeeldingen, plaats het membraan op de scanner met de eiwitkant naar beneden en selecteer het scangebied in de software. Verwerf vervolgens afbeeldingen in beide kanalen en exporteer de afbeeldingen naar een geschikt beeldanalyseprogramma. Geef het kanaal van 700 nanometer weer om het totale resultaat van eiwitvlekken weer te geven en Selecteer Analyse en Tekenrechthoek om het interessegebied voor normalisatie te definiëren.Kopieer en plak vervolgens het eerste rechthoekgebied op elk afzonderlijk voorbeeld om ervoor te zorgen dat het gedefinieerde gebied dezelfde grootte heeft voor alle geanalyseerde rijstroken. Om de eiwitconcentratie in elke rijstrook te kwantificeren, kopieert u de resultaten van zowel de totale eiwitvlek als het eiwit van belang naar een spreadsheetprogramma en bepaalt u het hoogste totale eiwitvleksignaal. Verdeel vervolgens elke totale eiwitvleksignaalwaarde door deze waarde om de genormaliseerde eiwitbelastingswaarde te verkrijgen en verdeel de signaalwaarde van 800 nanometer van elk afzonderlijk monster door de bijbehorende genormaliseerde eiwitwaarde om de relatieve eiwitexpressieverhouding in verschillende monsters te berekenen.In deze representatieve westerse vlekken worden eiwitten gewonnen uit weefsels verkregen uit postnatale dag vijf muizen vergeleken met eiwitten die worden gewonnen uit 10 weken oude volwassen muizen. Kwantificering van de fluorescentieintensiteit van de totale eiwitvlek werd bereikt door de fluorescentieintensiteit in de rechthoeksdoos op elke rijstrook te meten. Wanneer hele rijstroken worden geanalyseerd, blijft de fluorescentieintensiteit relatief vergelijkbaar tussen monsters, wat aangeeft dat het gebruik van de totale eiwitvlek voor normalisatie geschikt is voor dit doel.De fluorescerende totale eiwitvlek kan ook worden gebruikt om eiwitniveaus op verschillende ontwikkelingstijdpunten te vergelijken. Bijvoorbeeld, hoewel overleving motorische neuron eiwitniveaus duidelijk afnemen met de leeftijd in muizen, de totale eiwit gekleurde kwantificering blijft constant. Het gebruik van interne standaarden, normalisatie op basis van fluorescentie en adequate statistieken verhoogt de robuustheid van complexe eiwitexpressieanalyse over verschillende omstandigheden.Dit protocol voegt toe aan traditionele westerse vlekkentechnieken, het overwinnen van de problemen van de juiste beladingscontroles en vergelijkingen tussen experimentele batches, en het verstrekken van flexibiliteit voor eiwit expressie analyse. Deze aanpak kan worden uitgebreid tot het vergelijken van eiwitexpressie onder andere experimentele omstandigheden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA en CLC: CLF-1-afhankelijke negatieve regulatie van CNTFRa zoals aangetoond door Western blotting, Remming van lysosomale enzymen en immunocytochemie

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

High Throughput, Absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve Dot analyse (QDB) van de vlek

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...