Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
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E.J.N.G. est pris en charge par le Wellcome Trust (subvention 106098/Z/14/Z). Autres fonds ont été fournis par le SMA Trust (SMA UK Consortium ; T.H.G. & Y-T. H.), SMA en Europe (tacheraft, D.v.D.H. et E.J.N.G.), le DTP de l’Université d’Édimbourg en médecine Precision (T.H.G., L.L. et a.m.M.) et Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research (tacheraft).

Tissus pour cette procédure ont été extraites des études sur les animaux qui ont été approuvées par le Comité d’éthique interne à l’Université d’Edimbourg et ont été réalisées en concordance avec les institutionnels et les règlements de la UK Home Office sous l’autorité des relatifs personnels et licenses du projet.
Remarque : Ce protocole a été optimisé à l’aide de réactifs et trousses normalisées, disponibles dans le commerce afin d’améliorer la reproduct...

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	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. 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C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

Avec le protocole expérimental approprié, les mesures de contrôle et analyse statistique, les éponger occidental peut servir à effectuer des estimations quantitatives fiables d’expression de la protéine au sein et entre une gamme variée d’échantillons biologiques. Le protocole que nous décrivons dans le manuscrit actuel vise à servir de modèle pour les chercheurs cherchent à utiliser Western Blot pour procéder à l’analyse quantitative au groupes plus importants et plus complexes des échantillons, en ...

Western Blot est une technique qui est couramment utilisée pour détecter et quantifier l’expression de la protéine, y compris dans des homogénats de tissu ou des extraits. Au cours des années, cette technique a abouti à plusieurs avancées en recherche fondamentale et clinique, où il peut être utilisé comme un outil de diagnostic pour identifier la présence de la maladie1,2. Western Blot a été décrite en 1979 comme une méthode pour transférer des protéines de gels de polyacrylamide aux feuilles de nitrocellulose et ensuite visualiser les protéines à l’aide d’anticorps secondaires qui ont été étiquetés ou conjugués à la fluorescéine radiologiquement ou3de la peroxydase. Grâce au développement de kits disponibles dans le commerce et équipement, Western Blot méthodes ont été plus en plus standardisés et simplifiés au fil des ans. En effet, la technique est désormais facilement effectuée par des scientifiques avec des arrière-plans et des niveaux d’expérience. Cependant, comme avec beaucoup de techniques expérimentales semblables, les résultats des analyses de Western blot sont influençable par les choix opérés dans la conception et la réalisation de l’expérience. Il est important, par conséquent, que l’accessibilité des méthodes normalisées de buvard occidentales ne pas occulter la nécessité d’une planification minutieuse et expérimentale et de conception. Considérations expérimentales incluent, sans s’y limite, l’échantillon de préparation et manipulation, sélection et validation des anticorps pour la détection de la protéine et l’efficacité de transfert gel-à-membrane de particulièrement petits ou grands (< 10 ou > 140 kDa) protéines4,5,6,7,8,9. La qualité des protéines de l’échantillon original joue un rôle important en déterminant les résultats de l’analyse ultérieure de Western blot. Comme protéine peut être extraites d’une grande variété d’échantillons et de sources, y compris les lignées cellulaires, des tissus de modèles animaux et post-mortem des tissus humains, cohérence dans le traitement et la manipulation est nécessaire pour obtenir des résultats reproductibles. Par exemple, lors de l’entreposage à long terme des échantillons pour l’extraction de la protéine est nécessaire, il est important de réaliser que, même si la protéine est généralement stable à-80 ° C, des différences dans la stabilité des protéines entre les protéines extraites et de tissus intacts à-80 ° C ont été déclarés10. En outre, pour obtenir des estimations reproductibles des quantités de protéines, compatible homogénéisation des échantillons est cruciale. Optimisation des mémoires tampons de lysis différents et des méthodes d’homogénéisation (p. ex., manuelle homogénéisation par rapport aux méthodes automatisées) peut être nécessaire avant de commencer une expérience quantitative à grande échelle.
Stratégies de normalisation pour corriger la variabilité de chargement et de quantification de protéines sont essentielles pour obtenir des résultats robustes, quantitatives de l’expression de la protéine. Ménage de protéines comme la β-actine, tubuline α, β-tubuline et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) ont traditionnellement servis à normaliser le taux de protéines pour la quantification. Toutefois, normalisation aux protéines internes spécifiques à des fins de quantification a été critiquée de plus en plus sur les dernières quelques années11,12. Par exemple, l’expression des protéines de l’entretien ménager peut changer à travers différentes étapes du développement13,14, à travers les tissus de l' animal même4et en vertu de diverses maladies conditions4,15 ,16,17. Par conséquent, l’utilisation des protéines internes spécifiques limite les possibilités de faire des comparaisons plus complexes entre l’expression de la protéine de différents tissus, à des intervalles différents et dans différentes conditions expérimentales. Une alternative aux protéines internes au contrôle pour protéine variation de chargement est l’utilisation d’une tache de protéines totales (TPS) cette terminologie et visualise toutes les protéines présentes dans un échantillon. TPS permet la normalisation signal selon charge de protéine totale plutôt que de niveaux d’une protéine spécifique et, par conséquent, la quantification du signal de la TPS devraient être comparables et reproductibles, quelles que soient les conditions expérimentales, le type d’échantillon ou validant du développement . Exemples de taches de protéines totales Ponceau S, gels sans tache, R-350 bleu de Coomassie, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo Black et Cy5 (examinées par réf. 18). Chacune de ces méthodes a des limites et des avantages spécifiques et sélection de la méthode dépend de l’heure et outils disponibles ainsi que le montage expérimental4,18.
En plus d’utiliser un TPS pour corriger la charge au sein de la membrane et de la variabilité de la quantification, il peut être nécessaire de comparer les échantillons entre les différentes membranes, notamment lorsque vous effectuez l’analyse de l’expression des protéines à grande échelle. Cependant, la variabilité des facteurs tels que l’anticorps lie l’intensité de coloration de protéine efficacité et total peut introduire de nouvelles variabilité entre les échantillons de protéines qui sont analysées sur les gels distincts et membranes. Pour la quantification fiable dans cette situation, il est donc nécessaire d’introduire une nouvelle étape de normalisation pour tenir compte de la variabilité entre les membranes. Ceci peut être réalisé en incluant une norme interne chargement sur chacun des membranes qui est maintenue constante à travers des expériences analysées séparément. Cette norme peut prendre la forme d’une protéine qui peut être obtenu en quantité suffisante pour être utilisé dans toutes les membranes comprises dans le test lysate. Ici, nous utilisons un lysat de cerveau de souris (obtenu à partir des souris témoins âgés de 5 jours), comme le cerveau est homogénéisé facilement et la protéine obtenue lysate contient une quantité importante de protéine à une concentration élevée. Chargement d’un étalon interne en triple exemplaire permet échantillons sur membranes distinctes pour être normalisé et comparées directement.
Nous décrivons ici un protocole détaillé que nous avons mis au point pour nous permettre d’entreprendre des comparaisons complexes des variations d’expression protéiques dans différents tissus, des modèles de souris (y compris les modèles de maladies) et développement h19. En combinant un TPS fluorescent avec l’utilisation d’une charge interne standard, nous avons été en mesure de surmonter les limites actuelles du nombre d’échantillons et des conditions expérimentales qui peuvent être comparées au sein d’une seule expérience. Cette approche élargit l’utilisation de techniques traditionnelles de Western blot, permettant ainsi aux chercheurs de mieux explorer l’expression protéique dans l’ensemble des échantillons et les différents tissus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

Western Blot est une technique qui est couramment utilisée pour détecter et quantifier l’expression de la protéine. Au cours des années, cette technique a abouti à plusieurs avancées en recherche fondamentale et clinique. Cependant, comme avec beaucoup de techniques expérimentales semblables, les résultats des analyses de Western blot sont influençable par les choix opérés dans la conception et la réalisation de l’expérience. Les protéines internes spécifiques ont été utilisées traditionnellement pour normaliser le taux de protéines pour la quantification, cependant, celles-ci ont un certain nombre de limites et ont donc été critiqués de plus en plus au cours des dernières années. Nous décrivons ici un protocole détaillé que nous avons mis au point pour nous permettre d’entreprendre des comparaisons complexes des variations d’expression protéiques dans différents tissus, des modèles de souris (y compris les modèles de maladies) et du développement on. En utilisant un colorant fluorescent de protéines totales et en introduisant l’utilisation d’une charge interne standard, il est possible de surmonter les limites actuelles du nombre d’échantillons qui peuvent être comparés dans les expériences systématiquement comparer les niveaux de la protéine à travers un gamme de conditions expérimentales. Cette approche élargit l’utilisation de techniques traditionnelles de la tache occidentale, permettant ainsi aux chercheurs de mieux explorer l’expression protéique dans l’ensemble des échantillons et les différents tissus.

Nous incluons des exemples d’utilisation de TPS et d’un étalon interne pour faciliter les comparaisons des niveaux de protéines dans les tissus et les points dans le temps. La figure 1 montre les résultats d’éponger occidental sur les protéines extraites des tissus prélevés néonatale (postnatal J5) par rapport à des souris adultes (10 - semaine vieux). TPS et immunoblot Smn sont indiquées dans la Figure 1 a<strong...

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Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Cette méthode décrit une approche fiable et reproductible pour la comparaison des niveaux de protéine dans différents tissus et en différents points du développement en utilisant une approche de buvard ouest quantitative standardisée.

Robuste comparaison des niveaux de protéine tissus et partout ailleurs au développement aide à éponger occidental quantitatives standardisées

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ce protocole peut être utilisé pour répondre à des questions importantes dans la recherche fondamentale et clinique en examinant l’expression des protéines à travers différents tissus et points de temps. Pour effectuer des ballonnements occidentaux quantitatifs fiables, nous combinons une tache fluorescente totale de protéine avec un contrôle interne de chargement. Ceci surmonte des limitations qui surgissent en comparant divers tissus à travers des conditions expérimentales.Pour extraire les protéines des échantillons de cellules ou de tissus congelés, décongelez les échantillons de moins-80 degrés sur la glace avant de laver les échantillons le cas échéant, selon le tableau. À l’aide d’un homogénéiseur électrique portatif avec un pilon en polypropylène, homogénéisez les échantillons lavés, rincez le pilon dans de l’eau doublement distillée et séchez-le avec un tissu propre entre les échantillons. Laissez les échantillons sur la glace pendant 10 minutes, suivis d’une centrifugation.Ensuite, transférez le supernatant contenant des échantillons de protéines dans un nouveau tube sur glace sans déranger la pastille. Pour quantifier la concentration en protéines, établir des normes d’albumine sérique bovine à des concentrations croissantes de triplicate et ajouter un microlitre de chaque échantillon de protéines en double aux puits appropriés d’une plaque optique de 96 puits. Incuber la protéine sur un bloc thermique de 60 degrés Celsius pendant 10 minutes ou plus si la concentration en protéines devrait être faible et mesurer l’absorption à 560 nanomètres sur un lecteur de plaque.Exportez les mesures du lecteur de plaques et calculez la concentration de protéines en comparant les valeurs moyennes d’absorption de chaque échantillon à une courbe standard obtenue à l’aide de la norme protéique. Pour normaliser la quantité de protéines, préparez des dilutions des échantillons de protéines dans l’échantillon tampon et l’eau ultra-pure et incubez les échantillons dans un bloc thermique de 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, placez les échantillons sur la glace avant de vortexer et de centrifuger brièvement.Pour l’électrophoresis, mettre en place un gel de gradient préfabrique de quatre à 12%Bis-Tris dans le système de chambre gel électrophoresis et charger 3,5 microlitres d’une norme protéique dans le puits. Lors de l’utilisation d’une norme interne pour la normalisation entre les membranes, chargez une quantité égale aux autres échantillons dans les trois premiers puits à côté de l’échelle protéique et chargez 30 microgrammes de chaque échantillon dans les puits restants. Ensuite, faire passer les échantillons à travers le gel d’empilage à 80 volts pendant 10 minutes suivie de 150 volts pendant 45 à 60 minutes supplémentaires.À la fin de l’électrophorèse, pour assembler la pile de transfert, placez le gel protéique sur la pile inférieure contenant la membrane de difluoride polyvinylidene suivie du papier filtre. Utilisez le rouleau de ballonnement pour enlever les bulles d’air et placez la pile supérieure sur le dessus du papier filtre avant de rouler la pile à nouveau pour enlever les bulles d’air. Transférez toute la pile dans le dispositif de transfert avec l’électrode sur le côté gauche de l’appareil et placez l’éponge de gel sur le dessus de la pile de sorte que l’éponge soit alignée avec les contacts électriques correspondants sur l’appareil.Après avoir fermé le couvercle, sélectionnez et démarrez le programme approprié. À la fin du programme, couper la membrane à la taille du gel et laver la membrane coupée rapidement avec de l’eau double-distillée avant de continuer avec la tache totale de protéines. Pour la coloration totale des protéines, rouler la membrane dans un tube de 50 millilitres avec le côté protéique orienté vers l’intérieur et étiqueter la membrane avec cinq millilitres de solution de tache protéique sur un rouleau pendant cinq minutes à température ambiante dans une hotte de fumée.À la fin de l’incubation, lavez rapidement la membrane avec cinq millilitres de solution de lavage, en retournant brièvement le tube au rouleau entre les lavages, suivi d’un bref rinçage à l’eau ultra-pure. Ajouter trois millilitres de tampon de blocage à la membrane et remettre la membrane au rouleau pendant 30 minutes à température ambiante. Remplacez le tampon de blocage par l’anticorps primaire d’intérêt à la concentration optimisée appropriée et incubez la membrane sur le rouleau pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, laver la membrane six fois pendant cinq minutes avec cinq millilitres de PBS frais par lavage sur le rouleau à température ambiante. Après le dernier lavage, incuber la membrane avec la solution d’anticorps secondaire appropriée sur le rouleau pendant une heure à température ambiante suivie de trois lavages pendant 30 minutes par lavage. Après le dernier lavage, séchez la membrane et utilisez du papier d’aluminium pour protéger la membrane de la lumière.Pour l’acquisition d’images, placez la membrane sur le scanner avec le côté protéine orienté vers le bas et sélectionnez la zone de numérisation dans le logiciel. Ensuite, acquérir des images dans les deux canaux et exporter les images vers un programme d’analyse d’image approprié. Affichez le canal de 700 nanomètres pour afficher le résultat total de coloration des protéines et sélectionnez l’analyse et le rectangle de tirage pour définir la zone d’intérêt pour la normalisation.Ensuite, copier et coller la première zone rectangle sur chaque échantillon individuel pour s’assurer que la région définie est de la même taille pour toutes les voies analysées. Pour quantifier la concentration en protéines dans chaque voie, copiez les résultats de la tache totale de protéines et de la protéine d’intérêt pour un programme de feuille de calcul et déterminez le signal de tache protéique total le plus élevé. Ensuite, divisez chaque valeur totale du signal de tache protéique par cette valeur pour obtenir la valeur normalisée de chargement des protéines et diviser la valeur du signal de 800 nanomètres de chaque échantillon individuel par sa valeur protéique normalisée correspondante pour calculer le rapport relatif d’expression des protéines dans différents échantillons.Chez ces taches occidentales représentatives, les protéines extraites des tissus obtenus à partir de souris postnatales de cinq jours sont comparées aux protéines extraites de souris adultes âgées de 10 semaines. La quantification de l’intensité de fluorescence de la tache totale de protéine a été réalisée en mesurant l’intensité de fluorescence à l’intérieur de la boîte de rectangle sur chaque voie. Lorsque des voies entières sont analysées, l’intensité de la fluorescence demeure relativement semblable d’un échantillon à l’autre, ce qui indique que l’utilisation de la tache protéique totale pour la normalisation convient à cette fin.La tache fluorescente totale de protéine peut également être employée pour comparer des niveaux de protéine à différents points de temps développemental. Par exemple, bien que les niveaux de protéines des motoneurones de survie diminuent clairement avec l’âge chez la souris, la quantification totale des protéines tachées demeure constante. L’utilisation de normes internes, la normalisation basée sur la fluorescence et des statistiques adéquates augmentent la robustesse de l’analyse complexe de l’expression des protéines dans différentes conditions.Ce protocole s’ajoute aux techniques traditionnelles de tache occidentale, surmontant les problèmes des contrôles et des comparaisons appropriés de chargement entre les lots expérimentaux, et fournissant des flexibilités pour l’analyse d’expression de protéine. Cette approche peut être étendue à la comparaison de l’expression des protéines dans d’autres conditions expérimentales.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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