Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
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E.J.N.G. wird vom Wellcome Trust (Grant 106098/Z/14/Z) unterstützt. Sonstige Finanzierung wurde durch den Trust SMA (SMA UK Konsortium; vorgesehen T.H.G. & Y-T. (H.) SMA (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), der University of Edinburgh DTP in Präzision Medizin (T.H.G., l.l. & U.V.M.) und Europa Euan MacDonald Zentrum zur Erforschung von Motoneuronen Krankheiten (T.H.G).

Gewebe für dieses Verfahren stammen aus tierexperimentellen Studien, die von der internen Ethikkommission an der Universität von Edinburgh genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit institutionellen und UK Home Office Regelungen unter der Aufsicht der zuständigen persönliche und Projekt-Lizenzen.
Hinweis: Dieses Protokoll optimiert mit standardisierten, im Handel erhältlichen Kits und Reagenzien um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen (siehe Tabelle der Materialien...

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	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

Mit der geeigneten Versuchsdesign, Kontrollmaßnahmen und statistische Analyse westliche Beflecken lässt sich verlässliche quantitative Schätzungen der Proteinexpression innerhalb und zwischen ein vielfältiges Angebot an biologischen Proben vornehmen. Das Protokoll, die, das wir im aktuellen Manuskript beschreiben, soll dienen als Richtlinien für Forscher auf der Suche nach Western blotting um Quantitative Analyse auf größeren und komplexeren Gruppen von Proben, verpflichten sich, durch eine Kombination von Fluore...

Westliche Beflecken ist eine Technik, die häufig verwendet wird, zu erkennen und zu quantifizieren, Protein-Expression, einschließlich Gewebe Homogenates oder Extrakte. Im Laufe der Jahre hat diese Technik führte zu viele Fortschritte in der Grundlagenforschung und klinische Forschung, wo es als diagnostisches Werkzeug lässt sich das Vorhandensein der Krankheit1,2identifizieren. Westliche Beflecken wurde erstmals im Jahr 1979 als eine Methode, um Proteine von Polyacrylamid-Gele auf Nitrozellulose Blätter übertragen und anschließend visualisieren Proteine mit sekundären Antikörpern, die waren entweder radioaktiv gekennzeichnet oder konjugiert zu Fluorescein beschrieben oder Peroxidase-3. Durch die Entwicklung von kommerziell erhältlichen Kits und Ausrüstung wurden westliche befleckende Methoden zunehmend standardisiert und vereinfacht im Laufe der Jahre. Die Technik ist in der Tat, jetzt leicht von Wissenschaftlern mit unterschiedlichen Hintergründen und Ebenen der Erfahrung durchgeführt. Allerdings ist wie bei vielen ähnlichen experimentellen Techniken, die Ergebnis der Western-Blot Analysen leicht Entscheidungen bei der Gestaltung und Durchführung des Experiments beeinflusst. Es ist wichtig, daher, dass die Zugänglichkeit von standardisierten westliche befleckende Methoden nicht die Notwendigkeit sorgfältiger experimentelle Planung verdecken und design. Experimentelle Überlegungen gehören, jedoch nicht beschränkt auf, Probe Vorbereitung und Handhabung, Auswahl und Validierung von Antikörpern für die Proteindetektion und Gel-Membran Auftragswirkungsgrad von besonders klein oder groß (< 10 oder > 140 kDa) Proteine4,5,6,7,8,9. Protein-Qualität der ursprünglichen Probe spielt eine bedeutende Rolle bei der Bestimmung, des Ergebnis der anschließenden Western-Blot Analyse. Wie Protein aus einer Vielzahl von Proben und Quellen, einschließlich die Zelllinien, Gewebe aus Tiermodellen und Post-Mortem-menschlichen Geweben, extrahiert werden kann ist Konsistenz in Handhabung und Verarbeitung erforderlich, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Zum Beispiel, wenn langfristige Lagerung von Proben zur Proteingewinnung erforderlich ist, ist es wichtig zu erkennen, dass obwohl Protein in der Regel stabil bei-80 ° C ist, Unterschiede in Proteinstabilität extrahierten Proteine und intakten Gewebe bei-80 ° C gewesen sein gemeldeten10. Darüber hinaus ist konsequente Homogenisierung der Proben um reproduzierbare Schätzungen der Proteinmengen zu erhalten, entscheidend. Optimierung der verschiedenen Lyse Puffer und Homogenisierung Methoden (z. B. manuelle Homogenisierung im Vergleich zu automatisierten Methoden) kann erforderlich sein, vor Beginn der quantitativen Großversuch.
Normalisierung Strategien für Protein be- und Quantifizierung Variabilität zu korrigieren sind wichtig, robuste, quantitative Ergebnisse der Proteinexpression erhalten. Housekeeping Proteine wie β-Aktin, haben α-Tubulin, β-Tubulin und Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) traditionell verwendet, um Protein-Ebene für die Quantifizierung zu normalisieren. Normierung auf spezifische Zimmermädchen Proteine Quantifizierung Zwecken wurde jedoch zunehmend über die letzten paar Jahre11,12kritisiert. Beispielsweise kann der Ausdruck Hauswirtschaft Proteine in unterschiedlichen Entwicklungsstadien13,14, über Gewebe aus dem gleichen Tier4und unter verschiedenen Krankheiten Bedingungen4,15 ändern. ,16,17. Daher schränkt die Verwendung von bestimmten Haushalt Proteine die Möglichkeiten der komplexere Vergleiche zwischen Proteinexpression aus verschiedenen Geweben, an verschiedenen Zeitpunkten und unter verschiedenen experimentelle Bedingungen. Eine Alternative zum Haushalt Proteine Steuern für Protein laden Variante ist die Verwendung des Fleckes Gesamt-Protein (TPS), Etiketten und visualisiert alle Proteine in einer Probe vorhanden. TPS ermöglicht Signal Normalisierung anhand der Gesamt-Protein Last anstatt ein spezifisches Protein und somit Quantifizierung der TPS Signal sollte vergleichbar und reproduzierbar unabhängig von Versuchsbedingung, Probentyp oder Entwicklungsstörungen timepoint . Beispiele für Gesamtprotein Flecken Ponceau S, fleckenfreie Gele Coomassie R-350, Sypro-Rubin, Epicocconone, Amydo Black und Cy5 (überarbeitet in Nr. 18). Jede dieser Methoden hat spezifische Vorteile und Beschränkungen und Auswahl richtet sich nach der Zeit und Werkzeuge zur Verfügung, sowie der Versuchsaufbau4,18.
Zusätzlich zur Verwendung einer TPS, um innerhalb der Membran be- und Quantifizierung Variabilität zu korrigieren, kann es notwendig, Proben zwischen verschiedenen Membranen, besonders bei großflächigen Proteinanalytik Ausdruck zu vergleichen sein. Variabilität in Faktoren wie Antikörper binden Effizienz und Total Protein Fleck Intensität kann jedoch weitere Variabilität zwischen Proteinproben, die analysiert werden auf separaten Gele und Membranen einführen. Für robuste Quantifizierung in dieser Situation ist es daher notwendig, einen weiteren Normalisierung Schritt um Variabilität zwischen Membran zu berücksichtigen. Dies kann erreicht werden durch die Einbeziehung eines internen laden Standards auf jedem der separat analysierten Membranen, die über Experimente konstant gehalten wird. Dieser Standard kann haben die Form von jedem Protein lysate, in ausreichenden Mengen verwendet werden, über alle Membranen enthalten im Experiment gewonnen werden können. Hier verwenden wir ein lysate Gehirn der Maus (5 Tage alten Kontroll-Mäusen entnommen), Gehirn wird leicht homogenisiert und das gewonnene lysate Protein enthält eine erhebliche Menge an Protein in einer hohen Konzentration. Laden eines internen Standards in dreifacher Ausfertigung kann Proben auf separaten Membranen normalisiert und direkt verglichen werden.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das wir entwickelt haben, um komplexe Vergleiche von Protein Ausdruck Variation in verschiedenen Geweben, Maus-Modellen (einschließlich Krankheitsmodelle) und Entwicklungsstörungen Zeitpunkte19auf höchstem Niveau zu ermöglichen. Durch die Kombination einer fluoreszierenden TPS mit dem Einsatz von einem internen standard laden, konnten wir zur Überwindung bestehender Einschränkungen in der Anzahl der Proben und experimentellen Bedingungen, die in einem einzigen Experiment verglichen werden kann. Dieser Ansatz erweitert die Verwendung von traditionellen Western-Blot-Techniken, so dass Forscher besser Proteinexpression in verschiedenen Geweben und Proben zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

Westliche Beflecken ist eine Technik, die häufig verwendet wird, zu erkennen und zu quantifizieren, Protein-Expression. Im Laufe der Jahre führte diese Technik zu viele Fortschritte in der Grundlagenforschung und klinische Forschung. Allerdings ist wie bei vielen ähnlichen experimentellen Techniken, die Ergebnis der Western-Blot Analysen leicht Entscheidungen bei der Gestaltung und Durchführung des Experiments beeinflusst. Spezifische Zimmermädchen Proteine traditionell verwendet wurden, um Protein-Ebene für die Quantifizierung zu normalisieren, aber diese haben eine Reihe von Einschränkungen und sind daher in den letzten Jahren zunehmend kritisiert worden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das wir entwickelt haben, um komplexe Vergleiche von Protein Ausdruck Variation in verschiedenen Geweben, Maus-Modellen (einschließlich Krankheitsmodelle) und Entwicklungsstörungen Zeitpunkte auf höchstem Niveau zu ermöglichen. Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Gesamtprotein Fleckes und Einführung in die Verwendung von einem internen standard laden, es ist möglich, bestehende Einschränkungen in der Anzahl der Stichproben zu überwinden, die in Experimenten verglichen werden können und systematisch vergleichen Proteingehalte in eine Reihe von experimentellen Bedingungen. Dieser Ansatz erweitert die Verwendung von traditionellen western-Blot-Techniken, so dass Forscher besser Proteinexpression in verschiedenen Geweben und Proben zu untersuchen.

Wir sind Beispiele für die Verwendung von TPS und internem Standard Vergleiche von Protein-Ebene über Gewebe und Zeitpunkte zu erleichtern. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse von Western blotting auf Protein extrahiert aus dem Gewebe von Neugeborenen (postnatale 5.Tag) im Vergleich zu Erwachsenen Mäusen (10 - Wochen alten) erhalten. TPS und Smn Immunoblot sind in Figur 1A, Cdargestellt. Quantifizierung der Fluor...

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Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Diese Methode beschreibt, einen stabile und reproduzierbaren Ansatz für den Vergleich der Proteingehalte in verschiedenen Geweben und an verschiedenen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten mit einem standardisierten quantitativen westlichen befleckenden Ansatz.

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um wichtige Fragen in der grundlagen- und klinischen Forschung zu behandeln, indem die Proteinexpression über verschiedene Gewebe und Zeitpunkte hinweg untersucht wird. Um eine zuverlässige quantitative Western-Blotting durchzuführen, kombinieren wir einen fluoreszierenden Gesamtproteinfleck mit einer internen Belastungskontrolle. Dadurch werden Die Grenzen überwunden, die beim Vergleich verschiedener Gewebe über experimentelle Bedingungen hinweg entstehen.Um Proteine aus snap-gefrorenen Zell- oder Gewebeproben zu extrahieren, tauen Sie die Minus-80-Grad-Proben auf Eis auf, bevor Sie die Proben entsprechend der Tabelle waschen. Mit einem handgeführten elektrischen Homogenisator mit einem Polypropylen-Stößel die gewaschenen Proben homogenisieren, den Stößel in doppelt destilliertem Wasser spülen und mit einem sauberen Gewebe zwischen den Proben trocknen. Lassen Sie die Proben 10 Minuten auf Eis, gefolgt von zentrifugieren.Dann übertragen Sie den proteinhaltigen Überstand in eine neue Röhre auf Eis, ohne das Pellet zu stören. Zur Quantifizierung der Proteinkonzentration sollten Rinderserumalbumin-Standards bei zunehmender Konzentration in Dreifacharbeit festgelegt und ein Mikroliter jeder Proteinprobe doppelt in die entsprechenden Brunnen einer 96-Well-Optikplatte gegeben werden. Inkubieren Sie das Protein auf einem 60-Grad-Celsius-Wärmeblock für 10 Minuten oder länger, wenn die Proteinkonzentration voraussichtlich niedrig ist, und messen Sie die Absorption bei 560 Nanometern auf einem Plattenleser.Exportieren Sie die Plattenlesermessungen und berechnen Sie die Proteinkonzentration, indem Sie die durchschnittlichen Absorptionswerte jeder Probe mit einer Standardkurve vergleichen, die mit dem Proteinstandard ermittelt wurde. Um die Menge an Protein zu normalisieren, bereiten Sie Verdünnungen der Proteinproben in Probenpuffer und reinem Reinstwasser vor und inkubieren Sie die Proben in einem 70-Grad-Celsius-Wärmeblock für 10 Minuten. Dann legen Sie die Proben auf Eis, bevor Sie wirbeln und kurz zentrieren.Für die Elektrophorese ein vorgefertigtes Vier- bis 12%Bis-Tris-Gradientengel im Gelelektrophorese-Kammersystem einrichten und 3,5 Mikroliter eines Proteinstandards in den Brunnen laden. Wenn Sie einen internen Standard für die Normalisierung zwischen der Membran verwenden, laden Sie eine Menge, die den anderen Proben entspricht, in die ersten drei Brunnen neben der Proteinleiter und laden Sie 30 Mikrogramm jeder Probe in die verbleibenden Bohrungen. Führen Sie dann die Proben bei 80 Volt für 10 Minuten durch das Stapelgel, gefolgt von 150 Volt für weitere 45 bis 60 Minuten.Legen Sie das Proteingel am Ende der Elektrophorese, um den Transferstapel zu montieren, auf den unteren Stapel, der die Polyvinyliden-Difluoridmembran gefolgt vom Filterpapier enthält. Verwenden Sie die Blottwalze, um Luftblasen zu entfernen und legen Sie den oberen Stapel auf der Oberseite des Filterpapiers, bevor Sie den Stapel wieder rollen, um Luftblasen zu entfernen. Übertragen Sie den gesamten Stapel mit der Elektrode auf der linken Seite des Geräts in die Übertragungsvorrichtung und legen Sie den Gelschwamm auf den Stapel, so dass der Schwamm an den entsprechenden elektrischen Kontakten am Gerät ausgerichtet ist.Nachdem Sie den Deckel geschlossen haben, wählen Sie das entsprechende Programm aus und starten Sie es. Am Ende des Programms die Membran auf die Gelgröße schneiden und die geschnittene Membran schnell mit doppelt destilliertem Wasser waschen, bevor Sie mit dem gesamten Proteinfleck fortfahren. Für die gesamte Proteinfärbung die Membran in ein 50-Milliliter-Rohr mit der nach innen gerichteten Proteinseite rollen und die Membran mit fünf Millilitern Proteinflecklösung auf einer Walze fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Dunstabzugshaube beschriften.Am Ende der Inkubation die Membran schnell mit fünf Millilitern Waschlösung waschen und das Rohr zwischen den Waschungen kurz auf die Walze zurückgeben, gefolgt von einer kurzen Spülung mit reinem Reinstwasser. Fügen Sie der Membran drei Milliliter Sperrpuffer hinzu und geben Sie die Membran bei Raumtemperatur für 30 Minuten an die Walze zurück. Ersetzen Sie den Sperrpuffer bei entsprechender optimierter Konzentration durch den primären, von Interesse, und brüten Sie die Membran über Nacht bei vier Grad Celsius auf die Walze.Am nächsten Tag die Membran sechsmal für fünf Minuten mit fünf Millilitern frischer PBS pro Wäsche auf der Walze bei Raumtemperatur waschen. Nach der letzten Wäsche die Membran mit der entsprechenden Sekundärantikörperlösung auf der Walze für eine Stunde bei Raumtemperatur bebrüten, gefolgt von drei Wäschen für 30 Minuten pro Wäsche. Trocknen Sie nach der letzten Wäsche die Membran und verwenden Sie Aluminiumfolie, um die Membran vor Licht zu schützen.Legen Sie zur Bildaufnahme die Membran auf den Scanner mit der Nachwärtsseite des Proteins und wählen Sie den Scanbereich in der Software aus. Erfassen Sie dann Bilder in beiden Kanälen, und exportieren Sie die Bilder in ein entsprechendes Bildanalyseprogramm. Zeigen Sie den 700-Nanometer-Kanal an, um das Gesamtergebnis der Proteinfärbung anzuzeigen, und wählen Sie Analyse und Rechteck zeichnen aus, um den Bereich von Interesse für die Normalisierung zu definieren.Kopieren Sie dann den ersten Rechteckbereich in jedes einzelne Beispiel, und fügen Sie ihn in jedes einzelne Beispiel ein, um sicherzustellen, dass der definierte Bereich für alle analysierten Bahnen die gleiche Größe hat. Um die Proteinkonzentration in jeder Spur zu quantifizieren, kopieren Sie die Ergebnisse sowohl aus dem gesamten Proteinfleck als auch aus dem Protein von Interesse in ein Tabellenkalkulationsprogramm und bestimmen Sie das höchste Proteinflecksignal insgesamt. Dividieren Sie dann jeden Gesamtwert des Proteinflecksignals durch diesen Wert, um den normalisierten Proteinbelastungswert zu erhalten, und dividieren Sie den 800-Nanometer-Signalwert von jeder einzelnen Probe durch den entsprechenden normalisierten Proteinwert, um das relative Proteinexpressionsverhältnis in verschiedenen Proben zu berechnen.In diesen repräsentativen westlichen Flecken werden Proteine, die aus Geweben gewonnen wurden, die aus postnatalen Fünf-Mäusen gewonnen wurden, mit Proteinen verglichen, die von 10 Wochen alten erwachsenen Mäusen extrahiert wurden. Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität des gesamten Proteinflecks wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität innerhalb der Rechteckbox auf jeder Spur erreicht. Wenn ganze Bahnen analysiert werden, bleibt die Fluoreszenzintensität in den Proben relativ ähnlich, was darauf hindeutet, dass die Verwendung des gesamten Proteinflecks für die Normalisierung für diesen Zweck geeignet ist.Der fluoreszierende Gesamtproteinfleck kann auch verwendet werden, um Proteinspiegel zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten zu vergleichen. Zum Beispiel, obwohl überlebenmotorische Neuronenproteinspiegel deutlich mit dem Alter bei Mäusen abnehmen, bleibt die gesamte proteingefleckte Quantifizierung konstant. Die Verwendung interner Standards, fluoreszenzbasierte Normalisierung und angemessene Statistiken erhöhen die Robustheit komplexer Proteinexpressionsanalysen unter verschiedenen Bedingungen.Dieses Protokoll ergänzt die traditionellen westlichen Blot-Techniken, überwindet die Probleme geeigneter Ladekontrollen und Vergleiche über experimentelle Chargen hinweg und bietet Flexibilitäten für die Proteinexpressionsanalyse. Dieser Ansatz kann auf den Vergleich der Proteinexpression unter anderen experimentellen Bedingungen ausgedehnt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA und CLC: CLF-1-abhängige Herunterregulieren von CNTFR &amp; agr; als Demonstriert durch Western Blotting, Hemmung der lysosomale Enzyme und Immunzytochemie

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Festlegung der funktionellen Protein Regionen durch chimäres Protein Aufbau

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...